專利名稱：固氮植物聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及固氮植物聯(lián)合共生技術(shù)，具體地說是一種固氮植物聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
氮素是組成蛋白質(zhì)的主要元素，是植物生長所必需的大量營養(yǎng)元素。空氣中雖含有近80％的氮?dú)?，但并不能被高等植物直接吸收利用，人工合成氮素化肥地能源耗費(fèi)巨大，不合理的過量施用帶來的環(huán)境污染問題也日趨嚴(yán)重，人們逐漸認(rèn)識到農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)完全依賴化肥終非良策，因此生物固氮的研究倍受關(guān)注。在貧瘠的土壤中生物固氮的最經(jīng)常的限制因素是磷元素，這是因為磷元素在參與生物界的物質(zhì)循環(huán)中，只有在無機(jī)磷和有機(jī)磷之間的轉(zhuǎn)化，而不發(fā)生氧化還原反應(yīng)，而且磷元素在無人為活動參與的情況下總是單向流動的，生物體中的有機(jī)磷經(jīng)分解后形成不溶性無機(jī)磷酸鹽在土壤中沉積，在被河流帶入海洋，不參與陸地上的磷循環(huán)。而與植物共生的菌根真菌可以通過根外菌絲的形成，增加植物與土壤的接觸點，擴(kuò)大吸收面積，縮短磷的擴(kuò)散距離(文獻(xiàn)1Hattingh，M.J.，Gray，L.E.，Gerdemsnn，J.W.1973.Uptake and translocation of 32 P-labelled phosphate to onionroots by endomycorrhizal fungi，Soil Sci.5456～63；文獻(xiàn)2Nye P.H.，Tinker，P.B.1977.Solute movement in the soil-root system，OxfordBlackwell Scientific Publications.；文獻(xiàn)3Rhode，L.H.and J.W.Gerdemann.1978.Translocation of calcium and phosphate byexternal hyphae of Vesicular-arbuscular mycorrhizae，Soil Sci.126125～126)，從而提高宿主對磷素的吸收，改善植物營養(yǎng)狀況，促進(jìn)植物生長(文獻(xiàn)4Raiu，P.S.，Clark，R.B.，Ellis，J.R..et al，1990.Effects of species of VAM fungi on growth and mineraluptake of sorghum at different temperatures，Plant Soil.121165～170；文獻(xiàn)5Sieverding，E.T，1983.Influence of Soil moisture regime on VA-mycorrhiza.H.II.Effects of soil temperature and water regime on growth，nutrient uptake and waterutilization of Eupatorium odoratum L.Z.Acker and Pflanzenbau.15256～57)。菌根真菌與植物形成的共生體菌根還可分泌生長素、抗生素及一些酶提高植物的抗逆性，使菌根植物在貧瘠土壤中生存。
植物與微生物的共生是自然界普遍存在的一種生物學(xué)現(xiàn)象，其中與人類關(guān)系密切的有高等植物與菌根真菌共生形成的菌根，豆科固氮植物與根瘤菌或非豆科固氮植物與弗蘭克氏放線菌共生形成的根瘤。近二十年來對于菌根和根瘤這樣兩位一體的共生體系的研究已取得顯著進(jìn)展，特別是從遺傳特性、形態(tài)解剖、生理生態(tài)等方面對共生關(guān)系的建立、優(yōu)化和機(jī)理都進(jìn)行了深入的研究，通過人工接種促進(jìn)共生體形成及應(yīng)用的技術(shù)也有較快發(fā)展，在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)實踐中已顯示出菌根和根瘤的應(yīng)用潛力；但這方面多注重于植物與菌根真菌共生形成的菌根、固氮植物與根瘤菌或放線菌共生形成根瘤，進(jìn)而在貧脊的土地上應(yīng)用時，便不能最佳地形成植物與微生物間的營養(yǎng)共生環(huán)境，發(fā)揮固氮樹種優(yōu)良性狀，極大滿足它們各自生長的需求。很早以前許多學(xué)者就認(rèn)識到高等植物、根瘤、菌根同時存在的聯(lián)合共生現(xiàn)象，固氮植物菌根的存在就是這種聯(lián)合共生現(xiàn)象的具體表現(xiàn)；已有研究表明聯(lián)合共生體中菌根菌與共生固氮菌之間存在著相互促進(jìn)作用，尤其是菌根菌對固氮菌的固氮作用具有明顯的增效作用，菌根的存在促進(jìn)了宿主植物的生長，改善了植物根際的微生態(tài)環(huán)境；但是這類研究基本上是限于VA菌之間或外生菌之間，并且多停留在現(xiàn)象的描述上，并未在純培養(yǎng)條件下進(jìn)行，就將其歸功于雙接種的增效作用，這種盲目性的結(jié)論必然導(dǎo)致不能最好地利用固氮植物資源和菌根技術(shù)，發(fā)揮固氮植物與微生物共生的優(yōu)勢作用效果不夠理想，對脆弱地帶的生態(tài)恢復(fù)效果欠佳。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能極大地發(fā)揮固氮植物與微生物共生優(yōu)勢作用的、有利于脆弱地帶的生態(tài)恢復(fù)的固氮植物聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為將菌根菌、固氮菌與共生固氮植物相結(jié)合，以共生固氮為核心，發(fā)揮多學(xué)科配套優(yōu)勢，特別是對逆境條件下的共生植物與微生物共生生態(tài)的過程、生態(tài)功能和對環(huán)境的適應(yīng)及作用進(jìn)行研究，將純培養(yǎng)條件下的觀察測試與放大規(guī)模的田間模擬相結(jié)合，從微觀到宏觀角度揭示共生體系的基本規(guī)律及其相互關(guān)系，同時針對不同的固氮植物選取相應(yīng)的菌種進(jìn)行混合接種，進(jìn)一步增強(qiáng)宿主植物與微生物間的親合力；其具體操作過程如下
(1)共生菌種的選取
a.在選定固氮樹種分布的干旱、半干旱地區(qū)，隨機(jī)選取至少3處不同地塊的樹齡在5年以上的樹種根系樣品進(jìn)行外部形態(tài)觀測和形態(tài)解剖學(xué)觀察，確定其VA菌根菌和/或外生菌根菌的感染情況；
b.依據(jù)菌根感染強(qiáng)度和固氮結(jié)瘤量，確定共生菌與該樹種的親合力，選定該樹種根際中的發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型，并在每一不同地塊多點取樣，于其根際中分離出VA菌根菌和/或外生菌根菌，根瘤菌或弗蘭克氏放線固氮菌，進(jìn)行菌種擴(kuò)繁培養(yǎng)；
c.在純培養(yǎng)條件下，將分離培養(yǎng)好的菌種單接和組合搭配接種，確定共生體形成效應(yīng)的回接試驗，進(jìn)一步對上述發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型進(jìn)行驗證，確定優(yōu)勢菌種和優(yōu)勢菌種組合；
(2)共生體構(gòu)建
用上述所選優(yōu)勢菌種組合對相同固氮樹種進(jìn)行混合接種，構(gòu)建成聯(lián)合共生體，優(yōu)勢菌種組合為VA菌根菌、外生菌根菌及分離于固氮樹種根際中的固氮菌。
其中所述發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型判斷基點為外生菌根真菌以其在不同地塊出現(xiàn)的頻率多，分布廣，在不同點的感染率高為好；VA菌根菌以在不同地點篩取的同類孢子含量多為好；固氮菌以其在根瘤內(nèi)分離的固氮活性高的菌株菌種為較優(yōu)的菌種類型。
當(dāng)其中所述固氮樹種為刺槐時其中所述優(yōu)勢菌種，VA菌為摩西球囊霉和/或蘇格蘭球囊霉，外生菌為毛邊滑銹傘和/或劣味乳菇，固氮菌為刺槐根瘤菌。
其中所述與刺槐接種的優(yōu)勢菌種組合為摩西球囊霉+毛邊滑銹傘+劣味乳菇+刺槐根瘤菌、或摩西球囊霉+毛邊滑銹傘+刺槐根瘤菌，最佳組合為蘇格蘭球囊霉+毛邊滑銹傘+劣味乳菇+刺槐根瘤菌。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點
1.本發(fā)明接種VA菌根菌、外生菌根菌及分離于固氮樹種根際中的固氮菌形成的聯(lián)合共生體效果優(yōu)于雙接種和單接種，以此為理論依據(jù)能更好地應(yīng)用于造林生產(chǎn)實踐，又能發(fā)揮它們之間的促生優(yōu)勢；發(fā)揮固氮植物的抗逆性，而且在其感染VA菌和外生菌菌根后可極大限度地提高宿主的抗旱性、抗鹽堿性、抗重金屬毒害、抗極端濕度溫度、抗極端PH值等能力。
2.本發(fā)明接種VA菌根菌、外生菌根菌及分離于固氮樹種根際中的固氮菌形成的聯(lián)合共生體增強(qiáng)宿主植物的適應(yīng)性，能夠較好地應(yīng)用于今后的造林引種、育苗、經(jīng)濟(jì)林及果樹栽培等生產(chǎn)實踐中，尤其是逆境條件下的造林與復(fù)墾；同時在促進(jìn)植物生長，植物病蟲害的防治等方面都有很好的應(yīng)用前景；能更好地恢復(fù)和重建農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)，發(fā)揮共生優(yōu)勢。
3.本發(fā)明聯(lián)合共生體的構(gòu)建豐富和發(fā)展了聯(lián)合共生理論，在森林生態(tài)系統(tǒng)中有較大的應(yīng)用潛力，在加速樹木生長，解決農(nóng)村資源短缺，減少水土流失，改良土壤和改善生態(tài)環(huán)境等方面將產(chǎn)生重大的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)環(huán)境效益。
4.本發(fā)明通過純培養(yǎng)驗證了固氮樹種優(yōu)良性狀的發(fā)揮優(yōu)劣與其同時受菌根侵染和結(jié)瘤有關(guān)，以聯(lián)合共生生態(tài)效應(yīng)為主干，創(chuàng)建出構(gòu)建聯(lián)合共生體優(yōu)化組合的應(yīng)用技術(shù)。
具體實施例方式
實施例本實施例圍繞北方干旱和半干旱地區(qū)逆境條件下固氮樹種刺槐，以下實驗過程中部分方法參照《菌根研究及應(yīng)用》(中國林業(yè)出版社，1997年第一版)一書。
(1)共生菌種的選取
a.在選定固氮樹種分布的干旱、半干旱地區(qū)，隨機(jī)選取4處不同地塊的樹齡在5年以上的樹種根系樣品進(jìn)行外部形態(tài)觀測和形態(tài)解剖學(xué)觀察，確定其VA菌根菌和/或外生菌根菌的感染情況；
于一年中4月下旬至5月上旬對遼寧西部半干旱地區(qū)喀左縣、新民實驗站、中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用研究所樹木園及內(nèi)蒙古干旱的烏蘭敖都沙地共生資源野外生態(tài)調(diào)查，進(jìn)行了主要豆科固氮樹種刺槐(Rbinia pseudoacacia)、紫穗槐(Amorphafruticosa)、小葉錦雞兒(Caragana microphylla)、興安胡枝子(Lespedeza davurica)，非豆科固氮樹種沙棘(Hippophae rhamnoides)、沙棗(Elaeagnus angustifolia)及沙地植被山竹巖黃耆(Hedysarum fruticosum)、網(wǎng)果胡盧巴(Trigonella korshinskyi)、沙打旺(Astragslus huangheensis)根瘤樣品及根際菌土的采集，這些樹齡在6-8年之間。參照《菌根研究及應(yīng)用》(中國林業(yè)出版社，1997年第一版)對樹種根系樣品進(jìn)行外部形態(tài)觀測和形態(tài)解剖學(xué)觀測法，確定其VA菌和/或外生菌的感染情況；采用國際通用的乙炔還原法測定固氮活性。
b.依據(jù)菌根感染強(qiáng)度和固氮結(jié)瘤量，確定共生菌與該樹種的親合力，選定該樹種根際中的發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型，并在每一不同地塊多點取樣，于其根際中分離出VA菌根菌和/或外生菌根菌，根瘤菌或弗蘭克氏放線固氮菌，進(jìn)行菌種擴(kuò)繁培養(yǎng)；
固氮樹種VA菌根真菌的收集、分離與擴(kuò)繁培養(yǎng)
宿主植物是上述9種固氮植物，采集范圍是目的樹種根部附近0-30cm土層深度并帶有須根；VA菌孢子的分離稱取土壤20g，用常規(guī)濕篩傾析法篩取孢子，將細(xì)篩上殘留物生部轉(zhuǎn)入離心管，用常規(guī)蔗糖離心法離心后，取蔗糖上清液濾液濾下孢子，用自來水反復(fù)沖洗轉(zhuǎn)移至平皿中；依據(jù)其形態(tài)、大小、顏色分類，進(jìn)行VA菌孢子的擴(kuò)繁，是以須根發(fā)達(dá)的苜蓿(Medicago sativa)，白車軸草(Trifolium repens)為生物載體，種子用40％甲醛1∶100的溶液浸泡消毒15分鐘后播種。培養(yǎng)基質(zhì)為過2mm篩的河沙土，用高壓蒸氣滅菌法滅菌3小時。擴(kuò)繁方式有兩種，(1)單孢繁殖的塑料試管長20cm，口徑4cm底部空心；為通氣良好將小玻璃球放在試管底部，然后裝培養(yǎng)基質(zhì)至試管2/3處，孢子用氯氨T(1g/150ml)消毒15分鐘，在體視顯微鏡下挑孢子至直徑為3cm中央有一小孔的濾紙上，在小心放入上述試管內(nèi)，覆蓋2cm厚的滅菌基質(zhì)，最后播種，澆水；(2)多孢繁殖選用直徑為11cm的花盆用為容器，其它方法同單孢擴(kuò)繁；繁殖場地在樹木苗圃地，冬季置于溫室內(nèi)，并定時澆水。
外生菌根真菌與固氮菌或弗蘭克氏放線菌的分離與培養(yǎng)按常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。
固氮樹種為刺槐刺槐林下VA菌主要有摩西球囊霉(Glomus mosseae)、蘇格蘭球囊霉(G.caledonium)、聚叢球囊霉(G.aggregatum)、細(xì)凹無梗囊霉(Acaulospora scrobiculata)、外生菌根真菌有尖頂?shù)匦?Geastrum triplex)、籠頭菌(Clathrus sp.)、赭鱗蘑菇(Agaricus subrutilecens)、蘑菇屬(Agaricus subrutilecens)、紅籠頭菌(Clathrus sp.)、晶粒鬼傘(Coprinus micaceus)、棱散尾菌(Lysurusmokusin)、硬柄小皮傘(Marasmius oreades)、白鬼筆(Phallus incpudicus)、深紅鬼筆(Phallus rubicundus)、毛邊滑銹傘(Hebeloma mesophasum)、劣味乳菇(Lactariusinsulsus)，固氮根瘤菌為刺槐根瘤菌(Rhizobium robinia Pseudoacacia)；
刺槐根瘤菌菌種的分離篩選、形態(tài)及生理特性的研究參照《微生物學(xué)雜志》第9卷第4期7～14頁；本發(fā)明應(yīng)用刺槐根瘤菌形態(tài)特征為桿狀細(xì)菌，兩端鈍園、單個或成對，大小為0.3～1.4μm，革蘭氏染色陰性；在YMA培養(yǎng)基上生長7天后菌落直徑4～7mm，菌落園形、稍有隆起、邊緣整齊、無色或乳白色、表面濕潤、較??；有次端生或者周生鞭毛；生理特性在B.T.B.培養(yǎng)基上可使培養(yǎng)基變黃產(chǎn)酸；在肉湯蛋白胨培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48小時仍不生長，在石蕊牛奶培養(yǎng)基上變紅，產(chǎn)酸；不利用甘露糖，耐2.6％的NaCl在PH5～9都正常生長，在30℃時生長正常，35℃生長微弱，不利用纖維素，世代時間在2.5～4.5小時之間。
其中發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型有VA菌為摩西球囊霉和/蘇格蘭球囊霉，外生菌為毛邊滑銹傘和劣味乳菇，固氮菌為刺槐根瘤菌
c.在純培養(yǎng)條件下，將分離培養(yǎng)好的菌種單接和組合搭配接種，確定共生體形成效應(yīng)的回接試驗，進(jìn)一步對上述發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型進(jìn)行驗證，確定優(yōu)勢菌種和優(yōu)勢菌種組合；
①純培養(yǎng)條件下刺槐幼苗接種培養(yǎng)
刺槐屬樹種是一種速生、耐貧瘠的固氮樹種；本試驗是參照Melin(1936)驗證分離的已知真菌與特定的宿主在純培養(yǎng)條件下形成外生菌根能力的純培養(yǎng)技術(shù)方法和設(shè)備進(jìn)行，實驗方案設(shè)置見表1，將當(dāng)年采到的刺槐種子冰凍處理1周，用30％的雙氧水消毒15-20分鐘，倒掉雙氧水液，用無菌水70-80℃浸泡種子直至熱水冷卻，加入0.5％小蘇打水再浸種2-3小時，放在滅菌后的內(nèi)墊紗布的培養(yǎng)皿中蓋上蓋，置于25-28℃恒溫催芽；培養(yǎng)基質(zhì)為珍珠巖、泥碳分別過2mm篩，珍珠巖取篩上大粒，泥碳取下面粒性均一的碎屑，珍珠巖泥碳為按7∶1的質(zhì)量比用M.M.N營養(yǎng)液拌料，所用營養(yǎng)液為總質(zhì)量的1.2倍。將上述拌好的基質(zhì)用塑料布蒙一晚后按三分之二高度裝入300mm*38mm玻璃大試管，輕輕壓實，高壓滅菌1.5小時，刺槐根瘤菌在Ash л培養(yǎng)基上活化菌種，在搖床上液體培養(yǎng)36小時鏡檢觀測，稀釋104至105倍用血球計數(shù)器計數(shù)，所用外生菌根真菌有毛邊滑銹傘(Hebeloma mesophasum)→E1、劣味乳菇(Lactarius insulsus)→E2，VA菌為摩西球囊霉(Glomus mosseae)→I1、蘇格蘭球囊霉(G.caledonium)→I2，刺槐根瘤菌→N，在無菌室定量(標(biāo)準(zhǔn)每管VA菌孢子50個，外生菌根菌和固氮菌分別為10ml)接種，順序為外生菌劑→VA菌孢子→固氮菌，外生菌根菌劑要深入試管二分之一高度，VA菌孢子接種方式同其擴(kuò)繁時的接入方法，試管內(nèi)可加無菌水使其含水量在50％，每管最后接進(jìn)3粒健壯出芽整齊的刺槐種子，每種搭配重復(fù)三次，蓋上口徑為50mm的塑料小杯，自然光照為主輔以人工光(10500LUX)室溫條件下培養(yǎng)5個月，定期澆20-30ml無菌水/每管，在小苗長至大試管高時打開小杯蓋。6個月后，取出刺槐小苗樣品，進(jìn)行苗高、地徑、側(cè)根數(shù)、菌根感染率、生物量、結(jié)瘤量、根瘤固氮活性等指標(biāo)的測定。其中以不接任何菌種的植株作為對照組→CK，其它生長條件與接菌組相同。
表1實驗方案設(shè)置②刺槐聯(lián)合共生的確認(rèn)
本施例參考Philips & Hayman(1970)的染色法，根據(jù)根樣鮮嫩的特點加熱處理時間適當(dāng)縮短來進(jìn)行VA菌侵染觀測的，經(jīng)化學(xué)處理在顯微鏡下進(jìn)行組織及細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，確定其感染情況；感染VA菌根菌的刺槐根系皮層細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)有泡囊及內(nèi)生菌絲，在根際培養(yǎng)基質(zhì)中篩析出了孢子，在根系表面觀察到VA菌外生菌絲結(jié)構(gòu)；侵染結(jié)果充分確認(rèn)了摩西球囊霉(Glomus mosseae)、蘇格蘭球囊霉(G.caledonium)與刺槐形成的共生關(guān)系。
刺槐外生菌根外形的識別毛邊滑銹傘(Hebeloma mesophasum)、劣味乳菇(Lactarius insulsus)侵入后使其吸收小根外形產(chǎn)生變化，側(cè)根末梢呈短棍棒狀，稍肥大，轉(zhuǎn)變?yōu)榫男「溟L度生長受到抑制，根的分枝發(fā)育加強(qiáng)，在原根軸上長出許多更稠密的側(cè)根末梢，以至在外形上形成短棒狀。通過顯微觀察和解剖特征觀測進(jìn)一步證實，這兩種外生菌根真菌均能侵染刺槐根系而形成菌根。
菌根發(fā)育與刺槐生長結(jié)果見表2。
表2
③菌根對刺槐生長的促進(jìn)作用
本實驗結(jié)果證實接種VA菌對宿主植物的生長有明顯的促進(jìn)作用，接種不同的VA菌對宿主植物生長的改善作用是有差別的，接種蘇格蘭球囊霉(G.caledonium)比摩西球囊霉(Glomus mosseae)的效果好，說明宿主植物良好的生長狀況是由于菌根侵染造成的，但它們混合接種的優(yōu)勢更明顯，說明它們相互創(chuàng)造了適合于對方生長的微生態(tài)環(huán)境；同樣證實接種外生菌根菌對宿主植物的生長有促進(jìn)作用，毛邊滑銹傘(Hebeloma mesophasum)是比較適合的外生菌根菌。
④VA菌和外生菌根菌對刺槐生長的作用
本實驗結(jié)果證實接種VA菌和外生菌根真菌之間對宿主植物的生長都有促進(jìn)作用，不同菌種組合菌根的侵染狀況、刺槐苗木的生長情況是有差異的；菌根菌可促進(jìn)宿主植物對P及其它營養(yǎng)元素的吸收，微量的鋅可促進(jìn)VA菌孢子的萌發(fā)，外生菌促進(jìn)宿主植物吸收微量元素促進(jìn)VA菌孢子的生長，VA菌的良好生長反過來進(jìn)一步促進(jìn)宿主植物更好的生長，另外菌根菌產(chǎn)生的生長素、菌根對植物根際環(huán)境的改善也產(chǎn)生同樣的作用規(guī)律；混合接種蘇格蘭球囊霉+毛邊滑銹傘+劣味乳菇及摩西球囊霉+蘇格蘭球囊霉+毛邊滑銹傘刺槐苗木生長最好，顯然優(yōu)于任何一種單接菌根菌的效果，菌根侵染率和側(cè)根數(shù)都有顯著提高，說明宿主植物生長狀況的改善是菌根侵染的結(jié)果，而其它的各種組合并未發(fā)現(xiàn)比單接種有明顯優(yōu)勢，所以這兩種VA菌和外生菌混合接種增效作用顯然源于蘇格蘭球囊霉和毛邊滑銹傘這兩種優(yōu)良菌種及其聯(lián)合優(yōu)勢，進(jìn)一步為刺槐選取擇優(yōu)良菌根真菌提供了可靠的依據(jù)。
⑤菌根菌與固氮菌的相互作用
菌根菌與固氮菌的相互作用效果見表3。
固氮活性的測定采用國際通用的乙炔還原法稱取瘤重，裝瓶，注入乙炔，用NaCl中止反應(yīng)，于實驗室在100型氣相層析儀上檢測乙炔含量。
表3
實驗證實菌根菌對固氮過程有促進(jìn)作用，但不同菌種組合效果也不盡相同接種摩西球囊霉+蘇格蘭球囊霉+根瘤菌和毛邊滑銹傘+劣味乳菇+根瘤菌組合較佳，尤其后種組合效果最佳；從實驗看出，固氮菌對菌根菌發(fā)育影響不明顯，說明菌根菌對宿主植物是否固氮依賴性并不大，而固氮植物的結(jié)瘤固氮對菌根有很高的依賴性，將菌根技術(shù)應(yīng)用于固氮植物將產(chǎn)生重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。
⑥刺槐聯(lián)合共生體中宿主植物、菌根菌及固氮菌間的相互作用
純培養(yǎng)條件下聯(lián)合共生效果見表4。
表4
實驗結(jié)果有力地證實了菌根菌與固氮菌雙接種對宿主植物的生長起到了良好的促進(jìn)作用，同時接種VA菌、外生菌根菌和固氮菌刺槐的生長指標(biāo)比單接固氮菌、單接菌根菌及VA菌與外生菌混合接種都好，證實其植物生長促進(jìn)是綜合作用的結(jié)果，其機(jī)理為對植物生長起促進(jìn)作用的除水份外，氮磷的供應(yīng)最主要，固氮菌為植物提供充足氮元素，菌根菌提供磷元素并改善植物的根際及生理生化性狀來促進(jìn)植物的生長，聯(lián)合接種VA菌和外生菌相互取長補(bǔ)短更有效地滿足固氮菌對磷及其它微量元素的需求，其促進(jìn)作用更加明顯；對刺槐其較佳組合為摩西球囊霉+毛邊滑銹傘+劣味乳菇+根瘤菌，其最佳組合為蘇格蘭球囊霉+毛邊滑銹傘+劣味乳菇+根瘤菌；由此進(jìn)一步證明了最佳的促進(jìn)結(jié)瘤固氮能力的菌種組合與促進(jìn)刺槐的生長組合是一致的，顯然高于單接種VA菌或外生菌對固氮的促進(jìn)，它們相得益彰。
本實施例通過純培養(yǎng)驗證了固氮樹種優(yōu)良性狀的發(fā)揮優(yōu)劣與其同時受菌根侵染有關(guān)，為刺槐聯(lián)合共生體人工構(gòu)建提供了基礎(chǔ)。
(2)刺槐聯(lián)合共生體人工構(gòu)建盆栽實驗
將上述所選優(yōu)勢菌種組合對相同固氮樹種進(jìn)行接種，構(gòu)建成聯(lián)合共生體
盆栽相對于純培養(yǎng)條件來說是半開放似的，接近自然條件，因此它是純培養(yǎng)的進(jìn)一步擴(kuò)展，能為更大面積的造林生產(chǎn)實踐應(yīng)用聯(lián)合共生技術(shù)而提供理論與實踐依據(jù)，并形成一套行之有效的人工接種方法。
A.材料與方法
①供試土壤來自樹木園林內(nèi)40厘米以下的生土，過篩，在陽光下曬二天，加干熱滅菌的河沙，沙土比為2∶1，混勻后裝入直徑為20厘米的泥盆中，每盆加過磷酸鈣5克，每盆裝2.5公斤，其土壤理化性質(zhì)見表5。
表5土壤理化性質(zhì)
②接種物來源和菌劑用量
刺槐根瘤菌N(Rhizobium)分離于刺槐根瘤；根瘤菌在勻漿器中勻碎離心(1000轉(zhuǎn)/每分鐘，5-10分鐘)，離心后的菌體按1毫升/100棵苗的量接種。
VA菌根接種物是通過白車軸草擴(kuò)繁后獲得含有孢子和細(xì)根碎片(侵染率為48％)的菌根菌劑，主要是G.aggregatum.其中I1(摩西球囊霉)分離于刺槐林下，VAH(聚叢球囊霉)分離于沙棘林下每盆接種50克，6-8個孢子/克，均勻散布于盆中。
外生菌根真菌E2(劣味乳菇Lactarius insulsus)；E1(毛邊滑銹傘Hebelomamesophasum)按常規(guī)方法分別制成固體菌劑，每盆50克。
實驗處理(1)不加接種物(CK對照組)；(2)單接種根瘤菌N；(3)單接種菌根真菌一I1，二VAH；E2；E1(4)同時接種菌根真菌和根瘤菌I1+N，VAH+N；E2+N；E1+N(5)內(nèi)、外菌根真菌混接I1+E2，VAH+E2，I1+E1，VAH+E1；(6)內(nèi)、外菌根真菌和根瘤菌三接N+I1+E2，N+VAH+E2，N+I1+E1，N+VAH+E1；每種處理重復(fù)5次，每盆確定有5棵苗。
刺槐種子處理用氯化汞消毒滅菌，在28℃的恒溫箱中催芽；挑選萌芽整齊生長良好的種子播種；先將內(nèi)生菌根真菌和外生菌根真菌接種于盆中，播入種子；小苗長出一星期，接種刺槐根瘤菌，盆栽前兩個星期置于溫室中，之后放于室外，苗株長至6個月后進(jìn)行各項指標(biāo)測試。
B.生長指標(biāo)和生理指標(biāo)的測定
6個月后進(jìn)行各項指標(biāo)測試，包括株高、地徑、鮮重、主根長、側(cè)根數(shù)、結(jié)瘤量、固氮活性、葉綠素含量、凈光和效率、葉片含氮量、葉片含磷量、菌根侵染率；其中葉綠素含量采用ANON法進(jìn)行測量；凈光和效率采用CL-301P光合測定儀進(jìn)行測定；菌根侵染率采用壓片染色法進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計；菌根及根瘤形態(tài)解剖觀察及切片觀察；固氮活性采用乙炔還原法進(jìn)行測試；葉片含氮量采用凱氏定氮法進(jìn)行測試；葉片含磷量采用釩鉬黃比色法進(jìn)行測試。
C.結(jié)果
①聯(lián)合共生的確認(rèn)
純培養(yǎng)條件是人為設(shè)置較理想化的環(huán)境，除形成共生體的雙方外，選擇機(jī)會不大，因而在自然條件下形成共生體還存在一定的差別，而盆載實驗條件下的觀測為自然狀態(tài)下聯(lián)合共生體的研究提供了具有實踐意義的理論依據(jù)。
VA菌根形態(tài)特征的觀測經(jīng)壓片染色法，可以在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)VA菌根形成的叢枝和泡囊結(jié)構(gòu)，由VA菌菌絲體侵入宿主植物皮層細(xì)胞內(nèi)，并在細(xì)胞內(nèi)連續(xù)進(jìn)行分枝形成的一種枝狀結(jié)構(gòu)，它在VA菌感染的初期出現(xiàn)，僅維持2-3周時間，以后漸漸消亡，變成碎粒狀；而泡囊則出現(xiàn)在細(xì)胞感染的后期，由于新老菌絲可在同一根段上出現(xiàn)，因此有時可同時觀察到叢枝和泡囊結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果充分確認(rèn)了盆栽實驗條件下，VA菌根真菌與刺槐形成菌根的共生關(guān)系。
刺槐外生菌根外形的識別及解剖學(xué)特性的觀測外生菌根的特征是在距小根生長點不遠(yuǎn)的地方，真菌的菌絲纏繞在根的周圍；這種菌絲體密集交織形成菌絲套，其上菌絲體外延伸到土壤中，向內(nèi)從根表皮細(xì)胞間進(jìn)入外皮層，菌絲體只鑲嵌在皮層細(xì)胞間成一網(wǎng)狀，既哈迪氏網(wǎng)。側(cè)根末端呈短棒狀，稍肥大，轉(zhuǎn)變?yōu)榫男「溟L度生長受到抑制，根的分枝發(fā)育加強(qiáng)，在原根軸上長出許多更稠密的側(cè)根末梢。這兩種外生菌根真菌均能侵染刺槐根系而形成菌根，但外形上沒有差異；通過切片觀察，可以發(fā)現(xiàn)刺槐外皮層細(xì)胞間隙的外生菌根的哈迪氏網(wǎng)橫切面呈迷路狀。
刺槐能夠與根瘤菌形成根瘤，證明其感染成功。
②菌根、根瘤菌對刺槐生長的促進(jìn)作用
盆栽條件下共生效果見表6。
表6
刺槐聯(lián)合共生關(guān)系的存在刺槐聯(lián)合共生的人工構(gòu)建在上述人工純培養(yǎng)的實驗條件下，證實了刺槐接種VA菌根菌、外生菌根菌及固氮根瘤菌均成功感染了刺槐無菌苗，并能在形成根瘤的同時形成菌根，充分證實了它們之間的聯(lián)合共生關(guān)系，說明共生體是長期協(xié)同進(jìn)化的必然結(jié)果，那么在自然狀態(tài)下的半開放實驗條件下，也應(yīng)得到同樣的結(jié)論，本實險結(jié)果恰好也證實了這點，即刺槐聯(lián)合共生體存在的必然性，與此它們之間的相互作用生態(tài)效應(yīng)也得到了充分體現(xiàn)。
菌根真菌間的聯(lián)合共生對刺槐的生長效應(yīng)刺槐同時具有VA菌根菌、外生菌根菌，說明是長期的自然選擇，決定了這種共生方式的優(yōu)越性，二者之間存在聯(lián)合共生優(yōu)勢，而以往這類研究基本上限于VA菌根菌之間或外生菌根菌之間，并均非針對具體的宿主植物——固氮樹種進(jìn)行；本發(fā)明結(jié)果表明VA菌根菌與外生菌根菌間存在增效作用，但它們必須是建立在菌種合理搭配的基礎(chǔ)上，不同菌種組合效果不同，對刺槐來說最好組合為I1+E2與I1+E1各項指標(biāo)及生理功能，株高、地徑、鮮重、凈光和效率、葉綠素含量分別比對照組增加25.05％、19.44％、5.855％、15.25％、20.66％和28.64％、24.05％、5.98％、11.20％、20.64％優(yōu)于任何一種單接種效果，同時菌根的侵染率和葉片含磷量分別比對照組增加80％、7.07％和100％、8.54％說明宿主植物的生長狀況的改善與菌根的感染是分不開的，所以VA菌根菌與外生菌根菌的混合接種的增效作用顯然源于優(yōu)良菌種及其綜合優(yōu)勢復(fù)合效應(yīng)。
菌根真菌與根瘤菌之間對刺槐聯(lián)合共生的增效作用菌根真菌與根瘤菌共同生活在同一根際微生態(tài)系統(tǒng)中，在長期的進(jìn)化中形成了對宿主植物的聯(lián)合共生體，追溯共生的起源在于對逆境的適應(yīng)，隨著自然選擇作用，由最初的單體受益演替為協(xié)同進(jìn)化，在生長發(fā)育過程中體現(xiàn)了不可替代的優(yōu)越性；實驗結(jié)果有力的證實了菌根菌與固氮菌雙接種對宿主動植物的生長起到了良好的催進(jìn)作用，同時接種VA菌根菌、外生菌根菌及固氮根瘤菌的刺槐地上部分的生長指標(biāo)均比相應(yīng)的單接種VA菌根菌、外生菌根菌及固氮根瘤菌及雙接菌根菌要好，這充分說明對刺槐生長的促進(jìn)作用是它們綜合作用的結(jié)果；雖然各種菌根菌與固氮菌的聯(lián)合接種都表現(xiàn)了良好的促生優(yōu)勢，但接種刺槐根瘤菌+摩西球囊霉+毛邊滑銹傘是最好優(yōu)化組合，其表現(xiàn)在植株的生長和生理指標(biāo)株高、地徑、鮮重、凈光和效率、葉綠素含量分別比對照組增加36.12％、34.21％、12.77％、23.55％、20.99％，而促結(jié)瘤固氮能力和促菌根發(fā)育也表現(xiàn)出最佳的增效作用；則其固氮結(jié)瘤量、固氮活性及葉片含氮量也比對照組高69.17％、272.55％、90.71％；菌根的發(fā)育狀況為側(cè)根數(shù)、感染率和葉片含磷量也比對照組高47.86％、112.5％、32.20％；由此可知這種最佳優(yōu)勢組合的聯(lián)合共生優(yōu)勢表現(xiàn)在菌根真菌與固氮菌之間的相互增效作用，不僅提高了根瘤菌的結(jié)瘤固氮能力，而且也促進(jìn)了菌根的生長發(fā)育，同時菌根的良好發(fā)育與根瘤菌的固氮能力提高之間成正相關(guān)；再通過對比單接根瘤菌對植株的生長效應(yīng)方面表現(xiàn)在宿主的各項生理功能和生長指標(biāo)株高、地徑、鮮重、側(cè)根數(shù)、凈光和效率、葉綠素含量、結(jié)瘤量、固氮活性、葉片含氮量、菌根侵染率和葉片含磷量均比對照組高12.6％、11.09％、15.24％、4.79％、6.95％、13.88％、17.00％、152.94％、8.55％、12.50％和7.07％，僅接VA菌根菌和外生菌根菌的混合接種I1+E1對植株的生長效應(yīng)方面表現(xiàn)在宿主的各項生理功能和生長指標(biāo)株高、地徑、鮮重、凈光和效率、葉綠素含量、菌根侵染率和葉片含磷量均比對照組高28.64％、24.05％、5.98％、11.20％、20.64％、100％和8.54％，均不如混接菌根菌與固氮菌對宿主樹木的各項生長發(fā)育指標(biāo)和生理功能，由此再一次證明VA菌根菌、外生菌根菌及固氮根瘤菌的聯(lián)合共生的增效作用，其機(jī)理在于混接VA菌根菌、外生菌根菌及固氮根瘤菌同時滿足植物對氮磷營養(yǎng)的需求，良好的宿主植物為固氮菌和菌根菌提供了更充分的營養(yǎng)，增強(qiáng)結(jié)瘤固氮能力和菌根感染能力，這樣構(gòu)成一個良性循環(huán)而形成了聯(lián)合共生的增效作用。
盆栽模擬實例接種的各類菌種均對刺槐有較好的生長效應(yīng)，但不同的菌種對其生長效應(yīng)也不相同；其中雙接種效果優(yōu)于單接種，而本發(fā)明的聯(lián)合共生體VA菌根菌、外生菌根菌及分離于固氮樹種根際中的刺槐根瘤菌，混合接種效果更好，刺槐的各項生長指標(biāo)均有明顯提高，比較幾種接種方式的組合搭配，認(rèn)為E1+I1+N最佳，明顯體現(xiàn)了菌根菌對根瘤菌結(jié)瘤固氮能力的增效作用。
本實施例所用各類菌株都為非特異性的菌株體，而各菌株體所在的菌種于自然界普遍存在，分布較廣，各菌種在微生物學(xué)雜志、生態(tài)學(xué)報、土壤學(xué)報、林業(yè)科學(xué)研究、應(yīng)用生態(tài)學(xué)報上1989～2000年間發(fā)表的論文中均有提及和利用，其中劣味乳菇分離于1979年；毛邊滑銹傘分離于1987年；摩西球囊霉分離于刺槐林下，聚叢球囊霉分離于沙棘林下，都于1998年分離得到，依據(jù)N.C.SCHEWCKand YVONNE PEREZ 1988.1Mannual for the identification of VA mycorrizal fungi(second edition published)進(jìn)行分類鑒定；刺槐根瘤菌分離于1986年。
權(quán)利要求
1.一種固氮植物聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法，其特征在于將菌根菌、固氮菌與共生固氮植物相結(jié)合，以共生固氮為核心，將純培養(yǎng)條件下的觀察測試與放大規(guī)模的田間模擬相結(jié)合，針對不同的固氮植物選取相應(yīng)的菌種進(jìn)行混合接種，以增強(qiáng)宿主植物與微生物間的親合力；具體操作過程如下
(1)共生菌種的選取
a.在選定固氮樹種分布的干旱、半干旱地區(qū)，隨機(jī)選取至少3處不同地塊的樹齡在5年以上的樹種根系樣品進(jìn)行外部形態(tài)觀測和形態(tài)解剖學(xué)觀察，確定其VA菌根菌和/或外生菌根菌的感染情況；
b.依據(jù)菌根感染強(qiáng)度和固氮結(jié)瘤量，確定共生菌與該樹種的親合力，選定該樹種根際中的發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型，并在每一不同地塊多點取樣，于其根際中分離出VA菌根菌和/或外生菌根菌，根瘤菌或弗蘭克氏放線固氮菌，進(jìn)行菌種擴(kuò)繁培養(yǎng)；
c.在純培養(yǎng)條件下，將分離培養(yǎng)好的菌種單接和組合搭配接種，確定共生體形成效應(yīng)的回接試驗，進(jìn)一步對上述發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型進(jìn)行驗證，確定優(yōu)勢菌種和優(yōu)勢菌種組合；
(2)共生體構(gòu)建
用上述所選優(yōu)勢菌種組合對相同固氮樹種進(jìn)行混合接種，構(gòu)建成聯(lián)合共生體，優(yōu)勢菌種組合為VA菌根菌、外生菌根菌及分離于固氮樹種根際中的固氮菌。
2.按照權(quán)利要求1所述固氮植物聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法，其特征在于其中所述固氮樹種為刺槐。
3.按照權(quán)利要求1所述固氮植物聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法，其特征在于固氮樹種為刺槐時，所述優(yōu)勢菌種中VA菌為摩西球囊霉和/或蘇格蘭球囊霉，外生菌為毛邊滑銹傘和/或劣味乳菇，固氮菌為刺槐根瘤菌。
4.按照權(quán)利要求1所述固氮植物聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法，其特征在于固氮樹種為刺槐時，與刺槐接種的優(yōu)勢菌種組合為摩西球囊霉+毛邊滑銹傘+劣味乳菇+刺槐根瘤菌、或摩西球囊霉+毛邊滑銹傘+刺槐根瘤菌。
5.按照權(quán)利要求1所述固氮植物聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法，其特征在于固氮樹種為刺槐時，與刺槐接種的優(yōu)勢菌種組合為蘇格蘭球囊霉+毛邊滑銹傘+劣味乳菇+刺槐根瘤菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及固氮植物聯(lián)合共生技術(shù)，是一種固氮植物聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法。具體操作為將菌根菌、固氮菌與共生固氮植物相結(jié)合，以共生固氮為核心，將純培養(yǎng)條件下的觀察測試與放大規(guī)模的田間模擬相結(jié)合，針對不同的固氮植物選取相應(yīng)的菌種進(jìn)行混合接種，以增強(qiáng)宿主植物與微生物間的親合力；(1)菌種選取(2)共生體構(gòu)建用上述所選優(yōu)勢菌種組合對相同固氮樹種進(jìn)行混合接種，構(gòu)建成聯(lián)合共生體，優(yōu)勢菌種組合為VA菌根菌、外生菌根菌及分離于固氮樹種根際中的固氮菌。本發(fā)明通過純培養(yǎng)驗證了固氮樹種優(yōu)良性狀的發(fā)揮優(yōu)劣與其同時受菌根侵染有關(guān)，構(gòu)建聯(lián)合共生體能極大地發(fā)揮固氮植物與微生物共生優(yōu)勢作用的、有利于脆弱地帶的生態(tài)恢復(fù)。
文檔編號A01H17/00GK1425279SQ0113880
公開日2003年6月25日 申請日期2001年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月12日
發(fā)明者何興元, 韓桂云, 趙淑清, 張成剛 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所