專利名稱：一種構(gòu)建哺乳動(dòng)物克隆胚的方法及人類克隆胚的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種構(gòu)建哺乳動(dòng)物克隆胚的方法，涉及動(dòng)物細(xì)胞核移植、動(dòng)物細(xì)胞的融合及動(dòng)物細(xì)胞的遺傳改造等，適用于包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物核移植胚、也就是克隆胚的構(gòu)建以及涉及核移植技術(shù)的動(dòng)物克隆和人類治療性克隆等方面的研究和應(yīng)用。
20世紀(jì)80年代以來，哺乳動(dòng)物核移植技術(shù)發(fā)展迅速，先后有多種動(dòng)物的胚胎細(xì)胞、胎兒細(xì)胞克隆后代出生，1996年以后，綿羊、小鼠和牛等動(dòng)物的成體細(xì)胞也先后被成功克隆?？寺?dòng)物的出生不但具有重大的理論意義，在優(yōu)良動(dòng)物的繁殖、瀕危動(dòng)物的保存及人類治療性克隆等方面的應(yīng)用價(jià)值也十分巨大。
利用顯微注射的方法或細(xì)胞融合的方法將供體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去掉細(xì)胞核的受體細(xì)胞內(nèi)，再對(duì)移植了供體細(xì)胞核的受體細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)處理和培養(yǎng)，發(fā)育而成的胚胎即為克隆胚。將克隆胚移植到代孕母體子宮內(nèi)發(fā)育而出生的動(dòng)物即為克隆動(dòng)物。因此，構(gòu)建克隆胚時(shí)，需先對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行去核，去核前一般需用細(xì)胞松弛素對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行處理。
目前克隆哺乳動(dòng)物所用的受體細(xì)胞，一般是處于第二次減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞(MII)，MII卵母細(xì)胞的特性存在種屬差異。由于處于第二次減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞(MII)的細(xì)胞核沒有核膜，細(xì)胞核以紡錘體的形式存在，大多數(shù)動(dòng)物MII卵母細(xì)胞的細(xì)胞核都無法在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到。卵母細(xì)胞在成熟過程中進(jìn)行第一次減數(shù)分裂，排出第一極體，MII卵母細(xì)胞的細(xì)胞核一般位于細(xì)胞的周邊部位，并與第一極體鄰近。針對(duì)MII卵母細(xì)胞的特點(diǎn)，目前對(duì)MII卵母細(xì)胞進(jìn)行去核一般采用下列方法1、小鼠的MII卵母細(xì)胞胞質(zhì)較為透明，其細(xì)胞核在相差顯微鏡下清晰可見，因而可在相差顯微鏡下將其細(xì)胞核連同少量細(xì)胞質(zhì)一同去掉。大多數(shù)動(dòng)物的卵母細(xì)胞細(xì)胞不適合用該方法去核。
2、對(duì)于大多數(shù)動(dòng)物的MII卵母細(xì)胞，由于觀察不到細(xì)胞核，考慮到其細(xì)胞核一般與第一極體鄰近，對(duì)其去核時(shí)可將極體連同極體附近的細(xì)胞質(zhì)一同去掉，去掉的細(xì)胞質(zhì)通常約1/3。由于實(shí)際上極體的位置不一定與MII卵母細(xì)胞的細(xì)胞核鄰近，這一方法并不能保證去核成功。即使去核成功，由于去核時(shí)去掉的細(xì)胞質(zhì)較多(1/3或更多)，一些重要的細(xì)胞因子也可能去掉，這可能影響克隆胚的發(fā)育。
3、為克服方法2的缺點(diǎn)，在對(duì)MII卵母細(xì)胞進(jìn)行去核之前，可用DNA熒光染料對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行染色，然后在熒光顯微鏡的紫外線照射下進(jìn)行去核操作。熒光染料受紫外線的激發(fā)可發(fā)出可見的熒光，與DNA結(jié)合可以指示細(xì)胞核的位置。該方法也需去掉較多的細(xì)胞質(zhì)，所用的熒光染料和熒光顯微鏡的紫外線對(duì)MII卵母細(xì)胞有一定損害(如對(duì)線粒體DNA的損傷)，這些損害有可能影響克隆胚的發(fā)育。
上述方法的缺點(diǎn)是①去核發(fā)生在移核之前，經(jīng)過去核處理的卵母細(xì)胞為非正常狀態(tài)細(xì)胞，也就是在供體核進(jìn)入受體細(xì)胞之前，受體細(xì)胞已處于非正常狀態(tài)。②不能保證去核成功。③去核時(shí)去掉了較多的細(xì)胞質(zhì)，因而去掉了一些可能對(duì)克隆胚發(fā)育必需的細(xì)胞因子。④去核時(shí)所用的熒光染料和紫外線對(duì)卵母細(xì)胞有損傷，克隆胚的發(fā)育可能因此而受到影響。目前克隆技術(shù)的成功率不到5％，克隆胚、克隆動(dòng)物胎兒和新生克隆動(dòng)物的死亡率均較高，這些缺點(diǎn)可能是原因之一。
本發(fā)明的目的在于克服以上缺點(diǎn)，建立一種在幾乎不去掉細(xì)胞質(zhì)的情況下，既能保證去核，又可避免DNA熒光染料和紫外線對(duì)卵母細(xì)胞損傷的克隆方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案和內(nèi)容包括1、細(xì)胞核移植即將供體細(xì)胞核移植到成熟卵母細(xì)胞(MII)內(nèi)，移植了供體核的卵母細(xì)胞內(nèi)存在供體細(xì)胞核和卵母細(xì)胞核兩個(gè)核。移核時(shí)，應(yīng)將供體細(xì)胞核移植到離卵母細(xì)胞核較遠(yuǎn)的位置(與極體相對(duì)的位置)。核移植的方法有顯微注射法和細(xì)胞融合法，可根據(jù)動(dòng)物種屬不同和實(shí)驗(yàn)需要而定。
2、卵母細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)移植了供體細(xì)胞核的卵母細(xì)胞進(jìn)行一定時(shí)間的培養(yǎng)，使供體細(xì)胞核與卵母細(xì)胞質(zhì)相互作用，培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短可根據(jù)動(dòng)物種屬不同和實(shí)驗(yàn)需要而定。
3、卵母細(xì)胞激活卵母細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間后，即可對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行激活處理，并對(duì)激活或處于激活處理過程中的卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。在激活處理和培養(yǎng)過程中，供體細(xì)胞核和卵母細(xì)胞核將分別發(fā)生原核樣變化，形成原核樣核，此過程與正常受精過程中雌原核和雄原核的形成相似。培養(yǎng)過程中應(yīng)定期觀察卵母細(xì)胞是否有原核樣核形成。激活的方法有物理方法和化學(xué)方法，可根據(jù)動(dòng)物種屬不同和實(shí)驗(yàn)需要而定。
4、去除雌原核原核樣核形成后，在兩個(gè)原核樣核相互靠近和融合之前，用內(nèi)徑與原核樣核大小相近的玻璃微管將離極體較近的原核樣核吸掉，該原核樣核為雌原核(由卵母細(xì)胞核形成)的可能性較大，而另一原核樣核為供體細(xì)胞核形成的可能性較大。如果只形成一個(gè)原核樣核，而該原核樣核與極體極為接近，則其為雌原核的可能性很大，可將其去掉，而不必等另一原核樣核形成。去掉雌原核的卵母細(xì)胞內(nèi)只剩下供體細(xì)胞核。
5、胚胎培養(yǎng)對(duì)去掉雌原核而只剩下供體細(xì)胞核的卵母細(xì)胞在適當(dāng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)培養(yǎng)發(fā)育而成的胚胎即為克隆胚。
本發(fā)明區(qū)別于其他克隆技術(shù)的特征及優(yōu)點(diǎn)在于①由于在卵母細(xì)胞去核前將供核移入卵母細(xì)胞內(nèi)，因而保持了正常的卵母細(xì)胞質(zhì)環(huán)境，這對(duì)供核的重編程序可能有利，從而有利于克隆胚的發(fā)育。②由于在出現(xiàn)原核樣核時(shí)對(duì)卵母細(xì)胞去核，細(xì)胞核清晰可見，且有核膜存與在，因而去核干凈徹底，避免了因卵母細(xì)胞去核不徹底而造成克隆胚的染色體異常。③去核時(shí)去掉的細(xì)胞質(zhì)極少，避免了因去掉過多細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的因子而影響克隆胚的發(fā)育。④避免了DNA熒光染料和紫外線對(duì)卵母細(xì)胞的損傷。
現(xiàn)結(jié)合附圖(


圖1為顯微注射法核移植過程中的一種狀態(tài)。圖2和圖3分別為細(xì)胞融合法核移植過程中的一種狀態(tài)。圖4為去核過程中的一種狀態(tài)。)，以人類克隆胚的構(gòu)建為例，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施進(jìn)行介紹
1、卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備用含160IU/ml透明質(zhì)酸酶的HTF培養(yǎng)基去掉包裹于卵母細(xì)胞外的顆粒細(xì)胞和放射冠細(xì)胞。
2、核移植①顯微注射法如
圖1所示，在顯微鏡下，利用顯微操作器通過負(fù)壓用固定針(1)吸住卵母細(xì)胞的透明帶(2)，固定卵母細(xì)胞，使極體(3)處于固定針的相對(duì)面，偏離卵母細(xì)胞的水平軸約45度(以卵母細(xì)胞的中心為圓心)，然后用毛細(xì)玻璃管(4)將供核(5)注射到卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)靠近固定針的位置。因卵母細(xì)胞細(xì)胞核(在光學(xué)顯微鏡下一般觀察不到卵母細(xì)胞核)一般在極體附近，使極體偏離約45度既可使卵母細(xì)胞核(6)遠(yuǎn)離供核，又可避免注射時(shí)毛細(xì)玻璃管對(duì)卵母細(xì)胞核的損傷。 ②細(xì)胞融合法如圖2所示，將供核細(xì)胞(1)注射到卵母細(xì)胞的透明帶(2)下，其所處位置與極體(3)相對(duì)。如圖3所示，用電場(chǎng)或化學(xué)試劑處理卵母細(xì)胞，使供核細(xì)胞與卵母細(xì)胞融合，供核(1)進(jìn)入卵母細(xì)胞。因供核所處位置與極體(2)相對(duì)，因而供核離卵母細(xì)胞細(xì)胞核(3)較遠(yuǎn)。
3、卵母細(xì)胞培養(yǎng)用含20％血清的B2培養(yǎng)基將移植了供核的卵母細(xì)胞在37.5℃，含5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3——5小時(shí)。
4、卵母細(xì)胞的激活將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含10μM鈣離子載體(A23187)的HTF培養(yǎng)基內(nèi)，37.5℃保持8至10分鐘，然后用不含A23187的HTF培養(yǎng)基洗滌三次，再用含4mM 6-DMAP(6-Dimethylaminopurine)的HTF培養(yǎng)基在37.5℃，含5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5——7小時(shí)。6-DMAP培養(yǎng)到5小時(shí)時(shí)，每小時(shí)觀察一次卵母細(xì)胞，注意有無原核樣核出現(xiàn)。6-DMAP培養(yǎng)7小時(shí)后，如沒出現(xiàn)原核樣核，則將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含20％血清的B2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并繼續(xù)每小時(shí)觀察一次。
5、去除雌原核如發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)原核樣核，即將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含7.5μg/ml細(xì)胞松弛素B(CB)的HTF培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)45—60分鐘，然后如圖4所示，用固定針(1)在與雌原核(2)[與極體(3)較近的原核]相對(duì)的位置將卵母細(xì)胞固定，并用酸性Tyrode液在靠近雌原核的透明帶(4)上溶解一個(gè)小孔(5)，用內(nèi)徑約30μm的平頭玻璃管(6)將雌原核吸掉，剩下的原核樣核(7)即為供體細(xì)胞核。
6、胚胎培養(yǎng)用常規(guī)體外受精(IVF)的胚胎培養(yǎng)方法對(duì)去掉雌原核而只剩下供體細(xì)胞核的卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)育而成的胚胎即為人類克隆胚。
權(quán)利要求
1.一種哺乳動(dòng)物克隆胚的構(gòu)建方法，其步驟包括①將供體細(xì)胞核移植到成熟MII卵母細(xì)胞內(nèi)。②對(duì)移植了供體細(xì)胞核的卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。③對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行激活處理，使供體細(xì)胞核和卵母細(xì)胞核發(fā)生原核樣變化，分別形成原核樣核。④對(duì)發(fā)生原核樣變化的卵母細(xì)胞進(jìn)行去核，去掉其雌原核。⑤對(duì)去掉雌原核而只剩下供體細(xì)胞核的卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使其發(fā)育成克隆胚。本發(fā)明的特征是①將供體細(xì)胞核移植到卵母細(xì)胞質(zhì)的操作在對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行去核之前進(jìn)行。②對(duì)卵母細(xì)胞的去核操作在雌原核形成之后進(jìn)行。③對(duì)卵母細(xì)胞的去核操作在雌原核與由供體細(xì)胞核形成的原核樣核相互接近和融合之前進(jìn)行。
2.一種人類克隆胚的構(gòu)建方法，其步驟包括①將供體細(xì)胞核移植到成熟MII卵母細(xì)胞內(nèi)。②對(duì)移植了供體細(xì)胞核的卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。③對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行激活處理，使供體細(xì)胞核和卵母細(xì)胞核發(fā)生原核樣變化，分別形成原核樣核。④對(duì)發(fā)生原核樣變化的卵母細(xì)胞進(jìn)行去核，去掉其雌原核。⑤對(duì)去掉雌原核而只剩下供體細(xì)胞核的卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使其發(fā)育成克隆胚。本人類克隆胚構(gòu)建方法的特征是①將供體細(xì)胞核移植到卵母細(xì)胞質(zhì)的操作在對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行去核之前進(jìn)行。②對(duì)卵母細(xì)胞的去核操作在雌原核形成之后進(jìn)行。③對(duì)卵母細(xì)胞的去核操作在雌原核與由供體細(xì)胞核形成的原核樣核相互接近和融合之前進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人類克隆胚的構(gòu)建方法，其特征在于移植了供體細(xì)胞核的卵母細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間為3-5小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人類克隆胚的構(gòu)建方法，其特征在于用鈣離子載體(A23187)和6-DMAP對(duì)移植了供體細(xì)胞核并經(jīng)過培養(yǎng)的卵母細(xì)胞進(jìn)行激活處理，A23187的濃度為10μm/ml，處理時(shí)間為8至10分鐘。6-DMAP的濃度為4mM，處理時(shí)間為5至7小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明為一種哺乳動(dòng)物及人類克隆胚的構(gòu)建方法,目的在于克服目前克隆技術(shù)中對(duì)MII卵母細(xì)胞去核時(shí)的一些缺陷,建立一種對(duì)MII卵母細(xì)胞損害小而去核徹底、去除細(xì)胞質(zhì)少的克隆方法,其特征是對(duì)卵母細(xì)胞去核在核移植之后進(jìn)行,去核時(shí)卵母細(xì)胞核已發(fā)生原核樣變化,細(xì)胞核有核膜存在。本發(fā)明適用于哺乳動(dòng)物和人類克隆胚的構(gòu)建以及與核移植技術(shù)相關(guān)的動(dòng)物克隆和人類治療性克隆等方面的研究和應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01K67/00GK1379977SQ0110699
公開日2002年11月20日 申請(qǐng)日期2001年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月10日
發(fā)明者陸長(zhǎng)富, 盧光琇 申請(qǐng)人:陸長(zhǎng)富, 盧光琇