基于酶循環(huán)放大及納米顆粒增強(qiáng)spr檢測(cè)核酸或細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于酶循環(huán)放大及納米顆粒增強(qiáng)SPR檢測(cè)核酸或細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤(簡(jiǎn)稱(chēng)癌癥)是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命和健康的惡性疾病之一。我國(guó)腫瘤引起 的死亡率在所有病因中局第二位，并且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。近年來(lái)，隨著人類(lèi)對(duì)癌癥研究的 不斷深入，人們逐漸意識(shí)到癌癥的預(yù)防是抗擊癌癥最有效的武器。因此，癌癥的早期發(fā)現(xiàn)和 診斷對(duì)癌癥的預(yù)防和治療具有極為重要的意義。腫瘤細(xì)胞作為診斷腫瘤的一項(xiàng)重要指標(biāo)， 通過(guò)對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞表面分化蛋白和細(xì)胞因子的檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)癌癥的早期診斷與治療，且對(duì) 預(yù)后起到十分關(guān)鍵的作用。由于早期癌癥血液中癌細(xì)胞的數(shù)量一般非常少，且考慮到細(xì)胞 個(gè)體差異對(duì)藥物反應(yīng)的不同，尋找可選擇性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面活性物質(zhì)的探針，建立特異 性好、靈敏度高的腫瘤細(xì)胞檢測(cè)新方法，對(duì)于癌癥的早期診斷和治療具有非常重要的科學(xué) 意義和臨床價(jià)值。
[0003] 近年來(lái)，通過(guò)不同的信號(hào)傳導(dǎo)，用于腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的方法很多，主要包括表面增強(qiáng) 拉曼光譜，石英晶體微天平，電化學(xué)檢測(cè)，熒光檢測(cè)，單納米管場(chǎng)效應(yīng)晶體管矩陣和微流控 分析等，這些方法都是基于抗體與細(xì)胞表面受體的特異性相互作用。盡管這些方法已經(jīng)被 用于實(shí)驗(yàn)室研究，但是在實(shí)際應(yīng)用及臨床檢測(cè)分析中，由于相對(duì)較長(zhǎng)的分析時(shí)間，繁瑣的洗 滌操作及分離步驟，這些方法具有一定的局限性。
[0004] 核酸適配體是利用SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enr i chment)技術(shù)從DNA或RNA庫(kù)中篩選出來(lái)的單鏈寡核苷酸。與用于腫瘤標(biāo)志物識(shí)別的分 子探針相比，適配體具有特異性高，分子量小，制備簡(jiǎn)單，應(yīng)用廣泛，易于操作等優(yōu)點(diǎn)。譚蔚 泓小組利用細(xì)胞SELEX技術(shù)篩選了能夠特異性識(shí)別淋巴癌、粒細(xì)胞性白血病、小細(xì)胞肺癌和 肝癌等腫瘤細(xì)胞的適體。由于適體與靶分子之間的親和力比適體與其互補(bǔ)鏈之間的結(jié)合力 強(qiáng)，在靶分子存在的條件下，適體的互補(bǔ)鏈能夠被靶分子競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)，通過(guò)對(duì)釋放的互補(bǔ)鏈的 檢測(cè)，就能夠?qū)崿F(xiàn)相應(yīng)的靶分子的定量分析。
[0005] 酶循環(huán)放大作為一種有效的分子放大工具被廣泛的應(yīng)用于基于適體的分析檢測(cè) 中。例如許多研究小組（Wu Z.S.，Zhou H.，Zhang S.et al,Electrochemical Aptameric Recognition System for a Sensitive Protein Assay Based on Specific Target Binding-Induced Rolling Circle Amplification[J],Anal.Chem.,2010,82,2282-2289； Yang L.,Fung C.ff.,Cho E.J.et al,Real-Time Rolling Circle Amplification for Protein Detection!! J], Anal · Chem. , 2007,79,3320-3329)設(shè)計(jì)了基于適配體識(shí)別誘導(dǎo)的 滾環(huán)循環(huán)放大（rolling circle ampl if i cat ion，RCA)，提高了檢測(cè)靈敏度及選擇性。 Wiliner小組提出了基于革E識(shí)別誘導(dǎo)構(gòu)象轉(zhuǎn)變的鏈置換放大（strand displacement amplification，SDA)，在聚合酶和剪切酶的作用下，祀與適體結(jié)合形成的分子機(jī)器能夠被 激活，持續(xù)地生成大量的短鏈寡核苷酸，利用分子信標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，簡(jiǎn)化了操作步驟，提高了 檢測(cè)靈敏度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是為了解決上述問(wèn)題，提供一種基于酶循環(huán)放大及納米顆粒增強(qiáng) SPR檢測(cè)核酸或細(xì)胞的方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 一種基于酶循環(huán)放大及納米顆粒增強(qiáng)SPR檢測(cè)核酸的方法，
[0009] (1)在羧基修飾的磁珠表面標(biāo)記兩種氨基修飾的DNA，分別是能與打開(kāi)的發(fā)夾探針 DNA S2互補(bǔ)的DNA S3和RCA引物DNA S4,形成磁珠生物條碼探針；
[0010] ⑵將巰基修飾的發(fā)夾探針DNA S2固定到基底上，當(dāng)待測(cè)體系中具有祀DNA時(shí)，靶 DNA與發(fā)夾探針DNA S2的環(huán)部互補(bǔ)雜交，使發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)，暴露出被封閉的莖部，打開(kāi)的發(fā) 夾結(jié)構(gòu)的莖部與磁珠上的DNA S3互補(bǔ)雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)，從而把磁珠生物條碼探針捕獲到 基底上；
[0011] (3)被捕獲的DNA S3以打開(kāi)的發(fā)夾探針為模板進(jìn)行復(fù)制，同時(shí)將靶DNA從模板上替 換下來(lái)，釋放出的靶DNA再與發(fā)夾探針DNA S2互補(bǔ)，繼續(xù)引發(fā)聚合鏈置換反應(yīng)；
[0012] (4)聚合鏈置換反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入鎖式探針DNAS5，磁珠上的條碼探 針DNA S4與鎖式探針DNA S5的兩端完全互補(bǔ)，連接成環(huán)，在酶的作用下，以成環(huán)的DNA為模 板，生物條碼DNA S4為引物發(fā)生滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)，在檢測(cè)基底上，形成以磁珠為載體的具有大 量重復(fù)序列的DNA長(zhǎng)鏈；
[0013] (5)將步驟(4)得到的檢測(cè)基底進(jìn)行表面等離子共振檢測(cè)。
[0014] 所述步驟(5)具體為:將檢測(cè)基底固定在SPR檢測(cè)儀上，通入DNA功能化的金納米信 號(hào)探針，進(jìn)行表面等離子共振檢測(cè)，所述金納米信號(hào)探針上固定的DNA S6能夠與滾環(huán)的產(chǎn) 物互補(bǔ)雜交，增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)。
[0015] 優(yōu)選:所述步驟⑵中DNAS2的濃度為5 · 0 X 10-8M到1 · 0 X 10-5M，更優(yōu)選5 · 0 X 10-7M。
[0016] 優(yōu)選:所述步驟(1)所述S4/S3為10:1-70:1，更優(yōu)選30:1。
[0017] 優(yōu)選:所述步驟(3)中鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選10-140min，更優(yōu)選90min。 [0018] 優(yōu)選:所述步驟(4)中滾環(huán)復(fù)制放大反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選5-120min，更優(yōu)選60min。
[0019] 所述步驟(3)中鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)和步驟(4)中滾環(huán)復(fù)制放大反應(yīng)的溫度為20-45°(：，更優(yōu)選:37°(：。
[0020] 優(yōu)選:所述步驟(4)中反應(yīng)結(jié)束后，用PBS緩沖溶液沖洗，所述PBS緩沖溶液的pH值 為6.5-8.5，更優(yōu)選:pH值為7.4。
[0021] 優(yōu)選：所述步驟（5)中DNAS6功能化的納米金探針的粒徑為12-71.5nm，更優(yōu)選 24.5nm〇
[0022] -種基于酶循環(huán)放大及納米顆粒增強(qiáng)SPR檢測(cè)細(xì)胞的方法，在上述方法的步驟(1) 之前還包括:將羧基修飾的靶細(xì)胞適體DNAS0固定到磁珠表面，將與靶細(xì)胞對(duì)應(yīng)的靶DNAS1 加入體系中，通過(guò)互補(bǔ)雜交，形成target-DNA/aptamer/MB探針，在祀細(xì)胞存在的條件下，磁 珠上的適體鏈與靶細(xì)胞特異性結(jié)合，將DNAS1釋放到溶液中，取上清液，溶液中的DNA S1繼 而引發(fā)鏈置換反應(yīng)，
[0023] -種利用表面等離子共振檢測(cè)核酸或細(xì)胞的試劑盒，包括磁珠生物條碼探針、固 定了巰基修飾的發(fā)夾探針DNA S2的基底、鎖式探針DNAS5、鏈置換反應(yīng)、滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)體系， 所述磁珠生物條碼探針是在羧基修飾的磁珠表面標(biāo)記兩種氨基修飾的DNA，分別是能與打 開(kāi)的發(fā)夾探針DNA S2互補(bǔ)的DNA S3和RCA引物DNA S4,發(fā)夾探針DNA S2的環(huán)部與靶DNA互補(bǔ) 雜交后，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)，暴露出被封閉的莖部，打開(kāi)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖部與磁珠上的DNA S3互 補(bǔ)雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)，釋放出的靶DNA，所述鎖式探針DNAS5與磁珠上的條碼探針DNA S4兩 端完全互補(bǔ)，連接成環(huán)，在酶的作用下，以成環(huán)的DNA為模板，生物條碼DNA S4為引物發(fā)生滾 環(huán)復(fù)制反應(yīng)。
[0024]本發(fā)明的有益效果：
[0025] 本發(fā)明是一種基于多級(jí)信號(hào)放大的檢測(cè)DNA及細(xì)胞的檢測(cè)方法。將基于適體特異 性識(shí)別靶向激活的鏈置換反應(yīng)與滾環(huán)復(fù)制放大相結(jié)合，以磁珠作為信號(hào)二次放大的"中轉(zhuǎn) 站"，納米金生物條碼作為信號(hào)探針，采用表面等離子共振技術(shù)實(shí)現(xiàn)了DNA及腫瘤細(xì)胞的高 靈敏檢測(cè)。磁珠生物條碼探針不僅作為反應(yīng)單元，發(fā)生鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)，還作為信號(hào)放 大的載體，增大了滾環(huán)產(chǎn)物的負(fù)載量，能夠進(jìn)一步提高檢測(cè)基底上探針的覆蓋率，以鏈置換 放大及基于磁珠的滾環(huán)復(fù)制放大作為信號(hào)放大裝置，將靶分子的識(shí)別轉(zhuǎn)化成大量的納米金 信號(hào)標(biāo)記，增大了放大效率，提高了檢測(cè)靈敏度。該方法不需要復(fù)雜的化學(xué)處理過(guò)程，反應(yīng) 條件溫和，而且線性范圍較寬，重現(xiàn)性好。以適體識(shí)別為基礎(chǔ)的檢測(cè)體系，增強(qiáng)了該方法的 廣泛適用性。通過(guò)集成適體識(shí)別，DNA分子生物技術(shù)，納米生物技術(shù)及表面等離子共振檢測(cè) 技術(shù)，該研究為納米生物技術(shù)及生化分析學(xué)科的交叉開(kāi)啟了新的思路，促進(jìn)了基礎(chǔ)及臨床 研究，在生物學(xué)研究及臨床診斷方面具有重要意義。
[0026] 將酶循環(huán)放大體系與表面等離子共振技術(shù)結(jié)合，構(gòu)建了多級(jí)信號(hào)放大SPR技術(shù)高 靈敏檢測(cè)DNA和細(xì)胞的新方法。
[0027] 磁珠生物條碼探針不僅作為反應(yīng)單元，發(fā)生鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)，還作為信號(hào)放 大的載體，增大了滾環(huán)產(chǎn)物的負(fù)載量，提高了檢測(cè)基底上探針的覆蓋率，增強(qiáng)了放大效率。 [0028]本發(fā)明的DNA檢測(cè)限可達(dá)lfM。通過(guò)細(xì)胞適體負(fù)載的磁珠進(jìn)行磁性分離，降低了體 系的背景噪音，對(duì)細(xì)胞的檢測(cè)限可達(dá)76個(gè)細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的高靈敏檢測(cè)并具有良好的選 擇性，適用于復(fù)雜生物樣品的檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1為基于酶循環(huán)放大及納米顆粒增強(qiáng)的SPR檢測(cè)DNA示意圖；
[0030] 圖2為金納米粒子的透射電鏡圖片；
[0031] 圖3為紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖：（a)金納米粒子；（b)DNA功能化的納米金探針；（c) DNA S6；
[0032]圖4為AuNP-SDA-RCA檢測(cè)體系信號(hào)放大性能的研究：（a)納米金放大；（b)納米金-鏈置換放大；（c)納米金-鏈置換-滾環(huán)放大;DNA濃度，1.0 X 1 0-12Μ;
[0033]圖5為酶循環(huán)反應(yīng)溫度的優(yōu)化，靶DNA濃度，5.0 Χ10-14Μ，所述酶循環(huán)反應(yīng)為鏈置換 循環(huán)放大反應(yīng)和滾環(huán)復(fù)制放大反應(yīng)；
[0034] 圖6為捕獲探針濃度對(duì)SPR響應(yīng)信號(hào)的影響，