一種可異體移植的嵌合抗原受體t細(xì)胞及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及腫瘤治療領(lǐng)域，尤其涉及一種可異體移植的嵌合抗原受體T細(xì)胞及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤一直以來(lái)都是困擾全世界的重大疾病，嚴(yán)重危害人類健康。因此，尋找有效的腫瘤治療方法，徹底攻克腫瘤是世界醫(yī)學(xué)界的重要研究課題。目前，傳統(tǒng)的三大主要治療手段即手術(shù)治療、化療、放療這三大主要治療手段雖然是全球腫瘤治療的基本手段方法，然而其治療效果有限。
[0003]其中傳統(tǒng)手術(shù)切除是腫瘤行業(yè)中最基本、最重要的腫瘤治療手段。放療是用放射線照射癌組織，以抑制和殺滅癌細(xì)胞的一種治療方法，是大多數(shù)腫瘤的輔助療法，然而由于放療對(duì)癌細(xì)胞和正常細(xì)胞沒(méi)有分辨能力，多次放療后，患者會(huì)產(chǎn)生一系列毒副作用和反應(yīng)，對(duì)中晚期腫瘤患者，放療作用有限?；熓抢没瘜W(xué)藥物殺死腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的一種治療方式，但對(duì)大多數(shù)腫瘤的治療的有效性較低。并且，化療與放療一樣，其在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也將正常細(xì)胞和免疫細(xì)胞一同殺滅，導(dǎo)致病患者免疫能力和身體機(jī)能下降，生活質(zhì)量降低。
[0004]目前，免疫腫瘤療法正在全世界興起，為腫瘤患者帶來(lái)了曙光。而免疫療法中最有效果的療法是基于嵌合抗原受體T細(xì)胞(Chimeric antigen receptor T cells , CART)療法。其基本原理是利用基因工程改造從腫瘤患者自身身體中分離培養(yǎng)的T細(xì)胞，即通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體給T細(xì)胞加入一個(gè)能特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞，并且同時(shí)激活T細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞的嵌合抗體。然后將這些基因工程改造的T細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，使免疫細(xì)胞具有特異性識(shí)別和殺傷腫瘤的能力，從而達(dá)到治療腫瘤的效果。
[0005]嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)主要由三部分組成，位于細(xì)胞外的抗原結(jié)合區(qū)scFv，跨膜區(qū)以及胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組成。其中，根據(jù)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的研究發(fā)展，CAR可以分為第一代CAR、第二代CAR以及第三代CAR。第一代CAR僅含有一個(gè)信號(hào)單元，大多來(lái)自于CD3G，對(duì)腫瘤的殺傷效果很不理想。第二代CAR是在第一代CAR的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域基礎(chǔ)之上增加了一個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域，比如⑶28、0X40或者4-1BB，能夠提高CART細(xì)胞殺傷腫瘤的療效，但是效果還不能令人滿意。目前，大多數(shù)CAR都是第三代CAR，其主要是在在第二代CAR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域基礎(chǔ)之上再增加一個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域，因此具有三個(gè)個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域，研究發(fā)現(xiàn)這樣極大地提高了CART細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)以及T細(xì)胞在體內(nèi)存活的時(shí)間，達(dá)到治療腫瘤的效果。
[0006]雖然CART技術(shù)在治療腫瘤上面顯示出了巨大的優(yōu)勢(shì)和效果，然而，由于CART治療腫瘤非常的個(gè)體化，即必須要分離腫瘤患者自身的T細(xì)胞，這在實(shí)際應(yīng)用之中具有相當(dāng)大的困難，也存在許多的不足。首先是絕大多數(shù)腫瘤患者采用CART治療腫瘤時(shí)都是在其他腫瘤治療方法失去效果的情況下進(jìn)行的，在經(jīng)過(guò)手術(shù)治療，尤其是在經(jīng)過(guò)化療和放療之后，患者的免疫系統(tǒng)遭到毀滅性的破壞，其自身的T細(xì)胞數(shù)量極其有限，這會(huì)造成分離T細(xì)胞困難。第二，經(jīng)過(guò)放化療至后，患者自身的T細(xì)胞遭受化學(xué)藥物及射線的破壞，T細(xì)胞的活性非常低，尤其是細(xì)胞增殖能力非常低，分泌腫瘤殺傷因子的能力也大幅下降，進(jìn)而不能夠有效殺傷腫瘤細(xì)胞。第三，CART治療前分離腫瘤患者自身的T細(xì)胞，在分離細(xì)胞的同時(shí)，無(wú)法完全避免分離的T細(xì)胞里面有少量的腫瘤細(xì)胞也混雜在分離的細(xì)胞里面，即便經(jīng)過(guò)大規(guī)模的體外擴(kuò)增，由于放化療之后的腫瘤細(xì)胞活性更高，因此獲得的T細(xì)胞里面也具有大量的腫瘤細(xì)胞，在輸入患者體內(nèi)之后，這些腫瘤細(xì)胞也會(huì)再次輸入患者體內(nèi)，為患者造成了致命打擊。第四，經(jīng)過(guò)放化療的腫瘤患者身體極其脆弱，腫瘤隨時(shí)都可能復(fù)發(fā)，留給患者的時(shí)間非常不足，往往在經(jīng)過(guò)極其短的時(shí)間，甚至一兩周之內(nèi)就會(huì)復(fù)發(fā)，然而，個(gè)體化分離患者的T細(xì)胞、然后在經(jīng)過(guò)基因改造成CART細(xì)胞，其后再大規(guī)模體外培養(yǎng)、最后輸入患者，這段時(shí)間會(huì)經(jīng)歷非常長(zhǎng)的時(shí)間，往往會(huì)需要幾個(gè)月的時(shí)間，而這段準(zhǔn)備CART的時(shí)間之內(nèi)，患者可能已經(jīng)失去生命O
[0007]因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可異體移植的嵌合抗原受體T細(xì)胞及制備方法，旨在解決現(xiàn)有T細(xì)胞分離困難、不能夠有效殺傷腫瘤細(xì)胞及混雜有腫瘤細(xì)胞的問(wèn)題。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種可異體移植的嵌合抗原受體T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體T細(xì)胞包括T細(xì)胞和嵌合抗原受體，其中，所述T細(xì)胞為經(jīng)過(guò)基因工程改造的能夠進(jìn)行異體移植的T細(xì)胞。
[0010]所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細(xì)胞，其中，所述T細(xì)胞為經(jīng)過(guò)基因定點(diǎn)敲除技術(shù)在特定基因改造的T細(xì)胞。
[0011]所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細(xì)胞，其中，所述特定基因?yàn)門CR基因，所述TCR包括α鏈和β鏈，所述基因改造具體為:在TCR的α和β鏈中的一種或兩種鏈的恒定區(qū)域的相應(yīng)編碼基因的外顯子用基因定點(diǎn)敲除技術(shù)，使T細(xì)胞的TCR不具有活性，進(jìn)而使T細(xì)胞能夠進(jìn)行異體移植。
[0012]所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細(xì)胞，其中，所述基因定點(diǎn)敲除技術(shù)為CRISPR/Cas9。
[0013]所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細(xì)胞，其中，所述嵌合抗原受體由scFv抗原結(jié)合序列、跨膜序列及胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)序列組成。
[0014]所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細(xì)胞，其中，所述scFv抗原結(jié)合序列包括輕鏈可變區(qū)序列和重鏈可變區(qū)序列。
[0015]所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細(xì)胞，其中，所述scFv抗原結(jié)合序列為CD19、CD30、CD33、CEA、cMet、EGFRvII1、FAP、Her2、⑶2、PSMA、Mesothelin和NCAM中的一種o
[0016]所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細(xì)胞，其特征在于，所述跨膜序列為CD8。
[0017]所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細(xì)胞，其特征在于，所述胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)序列包括CD28胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域序列、4-1BB胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域序列和CD3G胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域序列。
[0018]—種如上任一所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法，其中，包括步驟: A、在TCR的α和β鏈中的一種或兩種鏈的恒定區(qū)域的相應(yīng)編碼基因的外顯子用基因定點(diǎn)敲除技術(shù)，使T細(xì)胞的TCR不具有活性，進(jìn)而得到能夠進(jìn)行異體移植的T細(xì)胞；
B、將攜帶嵌合抗原受體的慢病毒感染上述得到的能夠進(jìn)行異體移植的T細(xì)胞，感染完成后得到可異體移植的嵌合抗原受體T細(xì)胞。
[0019]有益效果:本發(fā)明異體來(lái)源的T細(xì)胞經(jīng)過(guò)基因工程改造，進(jìn)而可以使這種T細(xì)胞異體移植而不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥。然后將這種異體移植不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥的T細(xì)胞結(jié)合第三代CAR技術(shù)制備成一種可以異體移植的通用型的嵌合抗原受體T細(xì)胞，以便于腫瘤治療。
【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中T細(xì)胞α鏈恒定區(qū)TRAC的外顯子用CRISPR/Cas9敲除及結(jié)合CAR治療腫瘤的流程示意圖。
[0021]圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中T細(xì)胞β鏈恒定區(qū)域一TCRBCl的外顯子用CRISPR/Cas9敲除及結(jié)合CAR治療腫瘤的流程示意圖。
[0022]圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中T細(xì)胞β鏈恒定區(qū)域二 TCRBC2的外顯子用CRISPR/Cas9敲除及結(jié)合CAR治療腫瘤的流程示意圖。
[0023]圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中T細(xì)胞α鏈恒定區(qū)TRAC以及β鏈恒定區(qū)域一 TCRBCl的外顯子用CRISPR/Cas9同時(shí)敲除及結(jié)合CAR治療腫瘤的流程示意圖。
[0024]圖5為本發(fā)明實(shí)施例5中T細(xì)胞α鏈恒定區(qū)TRAC以及β鏈恒定區(qū)域二 TCRBC2的外顯子用CRISPR/Cas9同時(shí)敲除及結(jié)合CAR治療腫瘤的流程示意圖。
[0025]圖6為本發(fā)明實(shí)施例6中T細(xì)胞α鏈恒定區(qū)TRAC以及β鏈恒定區(qū)域一 TCRBCGPM^g定區(qū)域二 TCRBC2的外顯子用CRISPR/Cas9同時(shí)敲除及結(jié)合CAR治療腫瘤的流程示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]本發(fā)明提供一種可異體移植的嵌合抗原受體T細(xì)胞及制備方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0027]本發(fā)明提供一種可異體移植的嵌合抗原受體T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體T細(xì)胞包括T細(xì)胞和嵌合抗原受體，其中，所述T細(xì)胞為經(jīng)過(guò)基因工程改造的能夠進(jìn)行異體移植的T細(xì)胞。其中，本發(fā)明T細(xì)胞的來(lái)源包括健康成年人采血分離獲取或者患者自身血液分離提取或者其他符合相應(yīng)條件的人的血液提取分離。本發(fā)明異體來(lái)源的T細(xì)胞經(jīng)過(guò)基因工程改造，進(jìn)而可以使這種T細(xì)胞異體移植而不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥。然后將這種異體移植不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥的T細(xì)胞結(jié)合第三代CAR技術(shù)制備成一種可以異體移植的通用型的嵌合抗原受體T細(xì)胞，以便于腫瘤治療。
[0028]具體地，本發(fā)明所述T細(xì)胞為經(jīng)過(guò)基因定點(diǎn)敲除技術(shù)在特定基因改造的T細(xì)胞。其中，所述特定基因可以為但不限于TCR基因，所述TCR包括α鏈和β鏈，所述基因改造具體為:在TCR的α和β鏈中的一種或兩種鏈的恒定區(qū)域的相應(yīng)編碼基因的外顯子用基因定點(diǎn)敲除技術(shù)，使T細(xì)胞的TCR不具有活性，進(jìn)而使T細(xì)胞能夠進(jìn)行異體移植。
[0029]具體地，本發(fā)明所述TCR的α鏈的恒定區(qū)域?yàn)門RAC，TCR的β鏈的恒定區(qū)域具有兩個(gè)區(qū)域，分別為TCRBCl和TCRBC2。
[0030]具體地，所述基因定點(diǎn)敲除技術(shù)優(yōu)選為CRISPR/Cas9(Clustered regularlyinterspaced shortpalindromic repeats (CRISPR) /CRISPR-associated systems(Cas)，CRISPR/Cas9)技術(shù)。CRISPR/Cas9技術(shù)是最近發(fā)展起來(lái)的基因定點(diǎn)敲除技術(shù)之一，之前基因定點(diǎn)敲除技術(shù)還有鋅指核酸酶(Zinc Finger Nuclease , ZFN)技術(shù)以及TALEN(Transcript1n activator-like effector nucleases, TALEN)技術(shù)。而CRISPR/Cas9技術(shù)相較于ZFN技術(shù)和TALEN技術(shù)而言，其操作更加簡(jiǎn)單，同時(shí)脫靶效應(yīng)也小于另兩種技術(shù)，因此，在最近獲得了巨大的關(guān)注和發(fā)展。Cas9酶含有兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA這兩種結(jié)合成復(fù)合物，然后再通過(guò)PAM序列結(jié)合并侵入DNA，形成RNA-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)，進(jìn)而