當歸多糖在骨髓間質(zhì)干細胞中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及當歸多糖在骨髓間質(zhì)干細胞中的應用，尤其涉及當歸多糖在炎性因子 微環(huán)境中對骨髓間質(zhì)干細胞增殖的影響和遺傳穩(wěn)定性的保護作用。
【背景技術】
[0002] 骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是典型的成體干細胞之一，來源于骨髓，具有高度自我 更新、較強增殖能力與多向分化能力，在體外特定條件下可誘導分化為軟骨細胞、骨細胞、 心肌細胞、干細胞、脂肪細胞等，被認為是組織器官損傷修復的重要細胞來源。此外BMSCs具 有免疫原性低、腫瘤趨向性及易于導入各種基因的優(yōu)良特性。BMSCs作為靶向抗癌載體運用 于腫瘤生物治療研究引起越來越多的關注。經(jīng)過基因修飾的BMSCs到達腫瘤所在部位后表 達治療相關分子或自殺基因，從而達到緩解或治愈腫瘤的目的。MSCs作為載體攜帶IFN-β、 TRAIL等抗癌分子治療腫瘤獲得了明顯療效，開啟了腫瘤新型的治療途徑。
[0003] 近期研究表明，干細胞的命運受其所處的微環(huán)境的影響。正常機體微環(huán)境中，干細 胞的增殖和凋亡處于平衡狀態(tài)以保證干細胞功能的正常，一旦這種平衡被破壞后，干細胞 將會分化為腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)或發(fā)生惡性 轉(zhuǎn)化。Weber CE等研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白（Osteopontin, 0ΡΝ)能夠使乳腺癌微環(huán)境中的MSCs轉(zhuǎn) 化為TAFs，此過程依賴于TGF-βΙ的介導。!1〇11 [等發(fā)現(xiàn)在C6膠質(zhì)瘤微環(huán)境中MSCs可表現(xiàn)出惡 性腫瘤細胞的特征，增殖能力明顯增強，GP130，STAT-3，CyclinDl和BCL-xl的表達明顯增 加，并且IL-6和IL-6R水平明顯升高；SIL-R/GP130的活化可能是腫瘤微環(huán)境中MSCs出現(xiàn)惡 性轉(zhuǎn)化的重要原因之一。通過STA-21阻斷STAT3信號通路可以降低腫瘤微環(huán)境中MSCs腫瘤 樣轉(zhuǎn)化的風險。IFN-γ和TNF-α通過NFKB/SMAD7信號通路協(xié)同誘導MSCs損傷和通過NFkB調(diào) 節(jié)的癌基因激活導致腫瘤的發(fā)生。
[0004] 干細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化與其微環(huán)境中的炎癥密切相關。炎癥已被認為是腫瘤的一大 特征。在生物體損傷或病原體入侵后，炎癥需要一系列復雜的防御機制協(xié)調(diào)來恢復自我平 衡。炎癥是一把雙刃劍。機體在正常生理情況下，能對外來或者內(nèi)在刺激作出炎癥反應，具 有消除損傷因子、修復組織損傷等重要防御作用，通常此反應對機體是有利的;但在一些情 況下，如長期的慢性炎癥存在時，炎癥對機體的反應又是潛在有害的。Luo等研究發(fā)現(xiàn)亞硝 酸鹽誘導的炎癥可促進細胞惡性轉(zhuǎn)化和EMT，其中的分子機制是由于炎性因子IL-6的分泌 進一步活化STAT3和miR-21的表達;通過抗IL-6抗體培養(yǎng)人支氣管上皮細胞，亞硝酸鹽誘導 細胞惡性轉(zhuǎn)化和EMT可被逆轉(zhuǎn)。已有研究報道，多種腫瘤的形成與其長期的炎癥存在密切相 關。各種化學、生物因素等誘導腫瘤形成的過程中，炎性因子起著十分重要的作用，如IL-6、 TGF-βΙ〇
[0005] IL-6是存在于腫瘤微環(huán)境中的細胞因子，通過活化STAT3，MAPK和AKt信號通路促 進腫瘤細胞的增殖，血管形成，侵襲和轉(zhuǎn)移；IL-6可通過改變N-cadherin，vimentin， snail, twist 和 E-cadherin的表達來促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition, EMT)，進一步導致腫瘤的轉(zhuǎn)移；IL-6可促進干細胞微球體形成和自我更新， 有助于腫瘤細胞干性的維持，具有招募MSCs的作用；IL-6通過gpl30/MAPK/STAT3調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn) 錄因子C/ΕΒΡβ/δ的活化、p-glycoprotein的過度表達、EMT轉(zhuǎn)化和干細胞的擴增促進腫瘤細 胞的多重耐藥。IL-6已經(jīng)被認為是一種促瘤因子，參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與神經(jīng)膠質(zhì) 瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌等中路密切相關。IL-6可通過與gpl30結合形成復合體，進一 步與其下游的JAK激酶結合，發(fā)揮生物效應，進而與轉(zhuǎn)錄激活子-3(STAT3)調(diào)控靶基因。 Jak/STAT3信號通路被認為是聯(lián)系炎癥與腫瘤的橋梁。已有研究表明，肺癌患者血清IL-6水 平與臨床分期及治療效果有一定的關聯(lián)性，臨床分期與血清IL-6含量呈正相關;治療效果 與血清IL-6含量負相關。此外IL-6在乳腺癌中還能誘導EMT發(fā)生，同時也與腫瘤干細胞 (CSC)活性關系密切，而EMT與CSC進一步又影響著EGFR-TKI藥物的耐藥發(fā)生。最近的研究報 道揭示，IL-6/STAT3信號通路與NF-κΒ通路起到協(xié)同作用，進一步誘導某些細胞因子的表 達，從而以正反饋調(diào)節(jié)方式促進腫瘤干細胞的形成。研究發(fā)現(xiàn)BMSCs與C6腦膠質(zhì)瘤細胞間 接共培養(yǎng)后BMSCs發(fā)生了瘤化，重要機制之一為C6腦膠質(zhì)瘤細胞高分泌白介素6，從而激活 下游相關信號通路，包括IL-6/JAK/STAT3信號通路，從而導致BMSCs發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，證實了 C6腦膠質(zhì)瘤細胞微環(huán)境中某些分泌性因子可以誘導BMSCs發(fā)生惡變。Iliopoulos等研究發(fā) 現(xiàn)，IL-6能夠誘導非腫瘤干細胞向腫瘤干細胞的轉(zhuǎn)變。最近，Marotta等利用shRNA文庫篩 選發(fā)現(xiàn)，IL-6 /STAT3信號通路是乳腺癌干細胞的增殖所必需的。
[0006] 正常情況下，TGF-β與T淋巴細胞之間相互作用，使機體處于平衡狀態(tài)。病理情況 下，TGF-m過度表達，過高水平的TGF-m打破了這種平衡導致轉(zhuǎn)化生長因子對淋巴細胞抑 制作用增強，導致機體的免疫監(jiān)督功能受到破壞，使機體對病原體、腫瘤細胞的免疫監(jiān)視、 免疫反應能力遭到削弱或喪失，導致疾病或腫瘤的發(fā)生。Chen等測定了 TGF-m在原發(fā)性肝 癌患者癌組織與癌旁組織中的表達水平，結果顯示肝癌組織TGF-m表達陽性率明顯高于 癌旁組織，結果有統(tǒng)計學意義。在腫瘤微環(huán)境中，TGF-m言號通路在BMSCs向癌癥相關成纖維 細胞分化過程中起非常重要作用，將誘餌TGF-β受體基因骨形態(tài)發(fā)生蛋白和激活素結合抑 制劑導入BMSCs中，成功阻斷了TGF-i3/Smad信號通路的活化和CAF相關標志物的表達，并且 成功抑制了 BMSCS對乳腺癌生長的促進作用。
[0007] 炎性因子作為炎癥微環(huán)境的重要成員之一，也參與了腫瘤的起始與演進。研究者 將膠質(zhì)瘤微環(huán)境中同等水平濃度的外來IL-6誘導大鼠 BMSCs，結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過2個月長時間 誘導后BMSCs生長接觸抑制減弱，蛋白結果表明p53蛋白表達明顯降低，MDM2蛋白明顯升高， 接種裸鼠皮下可形成腫瘤。文獻報道，通過IL-4和GM-CSF培養(yǎng)人MSCs，發(fā)現(xiàn)MSCs出現(xiàn)與腫瘤 細胞相似的形態(tài)和表型，將其注入免疫缺陷鼠體內(nèi)，能引起肺結節(jié)的快速增長。炎癥反應微 環(huán)境不僅通過調(diào)控干細胞的自我更新和分化潛能，還能夠增加細胞突變的概率，并且能夠 增加突變細胞的增殖能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了當歸多糖在骨髓間質(zhì)干細胞中的應用，具體來說是提供當歸多糖在 炎性因子微環(huán)境中對骨髓間質(zhì)干細胞增殖的影響和遺傳穩(wěn)定性的保護作用。
[0009] 本發(fā)明提供當歸多糖在骨髓間質(zhì)干細胞中的應用。
[0010] 作為優(yōu)選，所述應用為當歸多糖對炎性因子微環(huán)境下的骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖 和遺傳穩(wěn)定性的保護作用。
[0011] 作為優(yōu)選，所述炎性因子為IL-6和/或TGF-m。
[0012] 作為優(yōu)選，所述應用為當歸多糖抑制炎性因子微環(huán)境下的骨髓間充質(zhì)干細胞的遺 傳穩(wěn)定性變化。
[0013] 作為優(yōu)選，所述應用為當歸多糖抑制炎性因子微環(huán)境下的骨髓間充質(zhì)干細胞的增 殖。
[0014] 作為優(yōu)選，所述當歸多糖的濃度為50μg/ml。
[0015] 本發(fā)明還提供當歸多糖在制備炎性因子微環(huán)境下骨髓間質(zhì)干細胞抑制劑中的應 用。該抑制劑以當歸多糖作為有效成分。當歸多糖的濃度優(yōu)選為SOμg/ml。
[0016] 作為優(yōu)選，所述當歸多糖的制備方法為:將當歸先醇提，然后水提得到水提液;將 水提液去除蛋白后，醇沉得到當歸多糖。
[0017] 作為優(yōu)選，所述醇提是用90-95%乙醇提取兩次，每次0.5-1.5h，加液重量分別為6 倍和4倍。
[0018] 作為優(yōu)選，所述水提是用水煎法提取3次，每次0.5-1.5h，加水重量分別為8、6、6 倍。
[0019] 作為優(yōu)選，所述醇沉是在去除蛋白質(zhì)的水提液中加入95%乙醇至醇體積濃度為75-80%，低溫靜置22-26h后，再次用相同的方法進行沉淀。
[0020] 作為優(yōu)選，在醇沉后還包括減壓干燥的步驟。
[0021] 本發(fā)明利用IL-6和TGF-m建立腫瘤相關炎性微環(huán)境，觀察IL-6、TGF-m單獨或聯(lián) 合對BMSCs的形態(tài)、微絲、增殖及增殖基因 Bcl-2、癌基因 Ras蛋白表達的變化;分析并探討當 歸主要有效成分-當歸多糖(Angelica sinensis polysaccharide, ASP)等對腫瘤相關炎 性微環(huán)境中BMSCs增殖的影響及遺傳穩(wěn)定性保護作用。
[0022] 腫瘤相關炎性微環(huán)境