g，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積 百分比為6%，萃取壓力30MPa，溫度60°C，CO 2流量3ml/g生藥· min，萃取時(shí)間800min，得超臨 界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重 0·50g〇
[0025] 經(jīng)檢測(cè)，成品中大黃素的含量為2.08mg/片。
[0026] 實(shí)施例4:綠及咳喘片抑制人宮頸癌細(xì)胞U14細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究資料 1.實(shí)驗(yàn)材料 1.1實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株 小鼠宮頸癌細(xì)胞U14細(xì)胞，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0027] 1.2實(shí)驗(yàn)藥物 研究藥物:本發(fā)明綠及咳喘片:按實(shí)施例1方法制備。
[0028] 藥液儲(chǔ)液：稱取IOOmg綠及咳喘片，溶于5ml無(wú)水乙醇中，0.2μηι濾器過濾，500μ Idoff管分裝，-20 °C存儲(chǔ)，同時(shí)0.2μπι濾器過濾無(wú)水乙醇以備對(duì)照組之用。
[0029] 1.3實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM( GIBCO公司Cat · No · 12100-061 Lot · No · 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技 有限公司Lot. No. 100419); NaHCO3 (上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat. No. 11810-033 Lot.No. 1088387) ;Trypsin(AMRESC0公司）；EDTA(AMRESC0公司）！Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0公司I) ; Streptomycin Sulfate(AMRESCO);無(wú)水乙醇（溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限 公司）；MTT (Biosharp批號(hào)：0793) :PBS(實(shí)驗(yàn)室自配）； 1.4實(shí)驗(yàn)器材 萊卡倒置顯微鏡（德國(guó)Leica型號(hào):DMIL);可見-紫外光微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)MD公司型 號(hào)：SPECTRAMAX 190) ; CO2培養(yǎng)箱(FORMA型號(hào)：3111);超凈臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司制造型號(hào)： SW-CJ-ZFD);純水儀(美國(guó)SprIng公司型號(hào)：S/N 020579);精密移液器(法國(guó)吉爾森公司型 號(hào):P2);電子天平(德國(guó)賽多利斯有限公司型號(hào):BT323S);全自動(dòng)高壓滅菌鍋（日本SANYO公 司型號(hào):MLS-3020);臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司型號(hào)：DHG9123A);冰箱 (西門子公司型號(hào):KG18V21TI);液氮罐(CBS型號(hào):2001);低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠 型號(hào):KA-1000) ;O · 2μπι濾器(MILLIPORE型號(hào)：SLGP033RB) ; Icm培養(yǎng)皿(NEST公司）、96孔培養(yǎng) 板(NEST公司）;細(xì)胞計(jì)數(shù)板;離心管、移液管、Tips若干。
[0030] 2.實(shí)驗(yàn)方法 I )U14細(xì)胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C〇2進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)（IOcm培養(yǎng)皿），當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì) 數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA，37 °C消 化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)入離心管中，1000 rpm離 心5min，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度3 X IO4個(gè)/ml。
[0031 ] 2)將細(xì)胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180μ1，培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中 (37°C，5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。
[0032] 3)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，一般長(zhǎng)至50%-70%，加入綠及咳喘片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0033] 4)24h 后加入 20μ1 MTT 溶液（5mg/ml，即0·5%ΜΤΤ)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h。
[0034] 5)4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入200μ1二甲基亞砜，置搖床 上低速振蕩l〇min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值。
[0035] 6)同時(shí)設(shè)置本底(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液），對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介 質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定6個(gè)復(fù)孔。
[0036] 7)結(jié)果以藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率表示:細(xì)胞增值抑制率(％ )=(對(duì)照孔OD值-給藥孔OD 值）、對(duì)照孔OD值X 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0037] 3.統(tǒng)計(jì)處理 采用Microsoft Excel 2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以mean土S.D. 表不。
[0038] 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 MTT法實(shí)驗(yàn)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，當(dāng)劑量達(dá)到5mg/ml時(shí)，對(duì)U14細(xì)胞增殖抑制 有差異(P〈〇. 05)，劑量在10mg/ml時(shí)該差異具有顯著性(P〈0.01)，當(dāng)劑量達(dá)到15-20mg/ml時(shí) 有極顯著性差異(P〈〇. 001)。
[0039] 衷1綠及眩喘片對(duì)Ul 4細(xì)朐增葙抑制影晌研究（X土SD) 注：與對(duì)照組比較，*P〈〇 · 01; #P〈〇 · 001。
[0040] 5.實(shí)驗(yàn)結(jié)論 本發(fā)明的綠及咳喘片可以抑制U14細(xì)胞增殖，減少U14細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)目，該作用呈 劑量依賴性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 綠及咳喘片在制備抑制宮頸癌細(xì)胞U14細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述綠及咳喘片由 小綠芨200g、雞矢藤200g、功勞木100g、通關(guān)藤100g、白及100g、虎杖100g、透骨草100g、黃精 l〇〇g作為原料藥制成，其特征在于，所述綠及咳喘片的制備方法包括如下步驟:取小綠芨 200g、雞矢藤200g、功勞木100g、通關(guān)藤100g、白及100g、虎杖100g、透骨草100g、黃精100g， 加入到C0 2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%， 萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C，C0 2流量l-3ml/g生藥· min，萃取時(shí)間700-800min，得超 臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重 0·50g〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的綠及咳喘片在制備抑制宮頸癌細(xì)胞U14細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng) 用，其特征在于，所述綠及咳喘片的制備方法包括如下步驟:取小綠芨200g、雞矢藤200g、功 勞木100g、通關(guān)藤100g、白及100g、虎杖100g、透骨草100g、黃精100g，加入到C0 2超臨界萃取 器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力25MPa，溫度40 °C，C0 2流量2ml/g生藥· min，萃取時(shí)間750min，得超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀 粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成200片，每片重0.50g。
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種綠及咳喘片在制備抑制宮頸癌細(xì)胞U14細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用及綠及咳喘片的制備方法。所述綠及咳喘片由小綠芨200g、雞矢藤200g、功勞木100g、通關(guān)藤100g、白及100g、虎杖100g、透骨草100g、黃精100g作為原料藥制成，采用超臨界萃取制備而成，使得大黃素含量有很大提高。
【IPC分類】A61P35/00, A61K47/36, A61K36/898, A61K9/20
【公開號(hào)】CN105641448
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】劉芳
【申請(qǐng)人】濟(jì)南新時(shí)代醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2016年2月17日