Ems離體誘變提高火龍果抗寒性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及果樹(shù)誘變育種技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種EMS離體誘變提高火龍果抗寒性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]火龍果為仙人掌科多年生攀援性肉莖植物，原產(chǎn)中美洲，是熱帶、亞熱帶的名優(yōu)水果之一?；瘕埞购^差，即使在熱量豐富的亞熱帶地區(qū)栽培也可能受低溫凍害的影響，如2007年底至2008年初的低溫凝凍天氣、2013年12月的低溫冷害及2014年2月的倒春寒天氣，造成廣西、貴州、云南等南亞熱帶地區(qū)大面積火龍果園受凍嚴(yán)重。有研究表明，當(dāng)溫度低于5°C時(shí)將可能導(dǎo)致火果受凍，其幼芽、嫩枝，甚至包括部分成熟枝條也會(huì)被凍傷或凍死。溫度越低，持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)后期火龍果產(chǎn)量和品質(zhì)的影響越嚴(yán)重，(TC是大多數(shù)栽培品種能忍受的最小閾值。但目前生產(chǎn)上耐低溫的火龍果資源相當(dāng)缺乏，且受區(qū)域的限制，國(guó)內(nèi)外有關(guān)火龍果抗寒及育種等方面的研究相當(dāng)少見(jiàn)。
EMS誘變技術(shù)是現(xiàn)代分子育種及資源創(chuàng)新的一種行之有效的方法之一。特別是誘變劑與組織培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，可提高細(xì)胞有益突變率10-100倍。而誘變材料的選擇園藝植物誘變育種成敗的關(guān)鍵之一。在離體化學(xué)誘變中，莖尖、葉片、愈傷組織等均可作為誘變材料使用，但必須保證誘變劑的有效滲入和誘變后材料能進(jìn)一步生長(zhǎng)、發(fā)育，最終產(chǎn)生新的個(gè)體。因此，提高誘變頻率和減少外植體的損傷是化學(xué)誘變處理中的一個(gè)矛盾，如何確定誘變劑濃度和處理時(shí)間因材料不同而異，即使同一材料的不同形態(tài)采用EMS誘變效果也存在較大差異。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是:提供一種EMS離體誘變提高火龍果抗寒性的方法，它成功率高，所獲得的火龍果無(wú)菌幼苗具有較強(qiáng)的抗寒能力。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:EMS離體誘變提高火龍果抗寒性的方法，包括如下步驟:
1)以從火龍果成熟莖段上培育的單個(gè)無(wú)菌苗為試材，將試材浸泡在體積濃度為3.71-3.95%的EMS處理液中，使試材與EMS處理液完全接觸，處理期間經(jīng)常搖動(dòng)，使溶液與無(wú)菌苗均勻接觸，處理時(shí)間為8.26-9.32小時(shí)；
2)在步驟I)的處理時(shí)間完畢后，用無(wú)菌水沖洗5次以上，去除毒性，吸干表面水份，將單株苗接種于繼代培養(yǎng)基上恢復(fù)生長(zhǎng)25-35d，促進(jìn)其生長(zhǎng)分化；
3)在步驟2)中將恢復(fù)生長(zhǎng)后分化出的不定芽進(jìn)行HYP逐步篩選，在最大耐受濃度為20mmol/L的HYP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選12-18d后，存活的芽繼續(xù)接入含有20 mmol/L的HYP的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)18-25d;再將存活的材料轉(zhuǎn)入不含HYP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)18-25d;
4)在步驟3)中最后存活的材料在0-4°C下進(jìn)行低溫誘導(dǎo)7-24d，從而增強(qiáng)火龍果的抗寒性。
所述的HYP篩選采用多步篩選法，將EMS誘變處理后新增殖的不定芽依次轉(zhuǎn)入含不同濃度的HYP選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d，以未經(jīng)EMS處理的芽作為對(duì)照;篩選出火龍果對(duì)HYP的最大耐受濃度20 mmol/L，即為選擇壓。
步驟2)中的繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L+AC 0.05% +CCC 0.5mg/
L0
步驟3)中采用篩選培養(yǎng)基均為MS+6-BA1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L+AC 0.05% +CCC
0.5mg/L+HYP 20 mmol/L;步驟3)中不含HYP的培養(yǎng)基即為步驟2)中的繼代培養(yǎng)基。
由于采用了上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以從火龍果成熟枝條上誘導(dǎo)的無(wú)菌幼苗為試材，通過(guò)EMS誘變處理，對(duì)成活的幼苗施加HYP選擇壓，通過(guò)選擇壓能夠成活的幼苗再經(jīng)低溫誘導(dǎo)，獲得的火龍果無(wú)菌幼苗具有良好的抗寒能力。這樣的方法不僅有利于保存母本的優(yōu)良性狀和后代的遺傳穩(wěn)定性。同時(shí)采用離體誘導(dǎo)，操作條件可控，突變率相對(duì)較高，為火龍果的抗寒新品種選育及尋找提高抗寒性的新途徑提供重要的理論依據(jù)和參考。本發(fā)明簡(jiǎn)單易行，成本低廉，使用效果好。
【附圖說(shuō)明】，
圖1為O °C持續(xù)低溫處理下REC的變化情況；
圖1中，E5代表3.8%EMS，H6代表20 mmol/L HYP，下同；
圖2為O °C持續(xù)低溫處理下MDA含量的變化情況；
圖3為(TC持續(xù)低溫處理下Pro含量變化情況；
圖4為O 0C持續(xù)低溫處理下SOD酶活性變化情況；
圖5為4 °C持續(xù)低溫處理下REC的變化情況；
圖6為4°C持續(xù)低溫處理下MDA含量的變化情況；
圖7為4 °C持續(xù)低溫處理下Pro含量變化情況；
圖8為4 °C持續(xù)低溫處理下SOD酶活性變化情況。
【具體實(shí)施方式】，
本發(fā)明的實(shí)施例1: EMS離體誘變提高火龍果抗寒性的方法，包括如下步驟:
1)以從火龍果成熟枝條上培育的單個(gè)無(wú)菌苗為試材，將試材試材放置到配好的濃度為3.8%(體積比)的EMS處理液中，輕微搖晃使試材與EMS處理液完全接觸，處理期間經(jīng)常搖動(dòng)，使溶液與無(wú)菌苗均勻接觸，處理時(shí)間為9小時(shí)；
2)在步驟I)的處理時(shí)間完畢后，用無(wú)菌水沖洗5次以上，去除毒性，吸干表面水份，將單株苗接種于繼代培養(yǎng)基上恢復(fù)生長(zhǎng)20d，促進(jìn)其生長(zhǎng)分化；
3 )在步驟2 )中將恢復(fù)生長(zhǎng)分化出的不定芽進(jìn)行HYP篩選。HYP篩選采用多步篩選法，將EMS誘變處理后新增殖的不定芽依次轉(zhuǎn)入含不同濃度的HYP(2 mmol/L,4 mmol/L,6 mmol/L、8 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L)選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng) 15 d，以未經(jīng)EMS處理的芽作為對(duì)照;篩選出火龍果對(duì)HYP的最大耐受濃度20 mmol/L，即為選擇壓;將篩選存活的芽繼續(xù)接入含有20 mmol/L的HYP的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)20d;再將存活的材料接入不含HYP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20d;
4)在(TC下進(jìn)行低溫誘導(dǎo)處理，處理時(shí)間為0-72 h，每隔12 h隨機(jī)取樣進(jìn)行初步的抗寒性分析鑒定，以未經(jīng)EMS和HYP處理的無(wú)菌幼苗為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。
試驗(yàn)結(jié)果如圖1-4所示。
大量研究表明，電解質(zhì)滲出率(REC)作為抗寒性鑒定的重要指標(biāo)，其大小與植物的抗寒性呈顯著負(fù)相關(guān)。從圖1中可以看出，無(wú)論是對(duì)照組還是處理組，REC均隨低溫持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，且以對(duì)照組的REC顯著高于處理組，說(shuō)明處理組細(xì)胞受傷害的程度明顯低于對(duì)照，其抗寒性較對(duì)照大大提高。
丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過(guò)氧化作用的終產(chǎn)物，其含量與植物受逆境脅迫程度有關(guān)，是衡量脂質(zhì)過(guò)氧化作用強(qiáng)弱的主要指標(biāo)。常溫下