胱天蛋白酶募集域蛋白9的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及脫天蛋白酶募集域蛋白9(CA畑9)的 新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性膜腺炎（A巧是常見的急腹癥之一，常伴發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功 能障礙綜合征，嚴(yán)重危及患者生命。因此，早期診斷和預(yù)測膜腺炎的嚴(yán)重程度具有十分重要 的臨床意義。
[000引 20世紀(jì)70年代初，Ranson在研究了 100名急性膜腺炎患者入院48小時(shí)的情況 后，提出了 Ranson評分系統(tǒng)。該評分系統(tǒng)包括入院時(shí)的5項(xiàng)臨床指標(biāo)和48小時(shí)的6項(xiàng)指 標(biāo)各項(xiàng)1分，合計(jì)11分，評分在3分W上時(shí)即為重癥膜腺炎。3分W下病死率0. 9%，3-4分 為16%，5-6分為40%，6分W上為100%。Ranson評分系統(tǒng)在重癥膜腺炎的診療過程中曾 發(fā)揮了很大的作用，但對比CT等影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)其敏感性不高。
[0004] 迄今為止，急性膜腺炎起始和發(fā)展的確切發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。而單核巨瞻細(xì) 胞系統(tǒng)的激活已被證實(shí)是AP發(fā)展的最初事件的啟動因子，在多器官功能衰竭發(fā)展過程中 是重要的病理生理步驟。CARD9是在巨瞻細(xì)胞內(nèi)高度表達(dá)的一種新型銜接蛋白，CARD9在抗 微生物感染的天然免疫反應(yīng)發(fā)揮著重要作用，而重癥急性膜腺炎（SA巧病程早期的特點(diǎn)無 菌性炎癥，因此CARD9在急性膜腺炎發(fā)病期早是否起著作用是未知的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供了脫天蛋白酶募集域蛋白CARD9的新用 途及相應(yīng)檢測急性膜腺炎嚴(yán)重程度的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明檢測了 AP患者外周血單核細(xì)胞中的CA畑9mRNA和蛋白的表達(dá)，棍奇地發(fā) 現(xiàn)，AP外周血單核細(xì)胞中CA畑9mRNA和蛋白的表達(dá)在入院24小時(shí)內(nèi)高于健康對照組，尤 其是SAP患者CA畑9mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于健康對照組和MAP (輕癥A巧組，提示早期檢 測CA畑9可能有助于判斷AP病情，CA畑9水平越高，病情越嚴(yán)重。
[0007] 本發(fā)明首先提供了 CARD9作為生物標(biāo)志物在制備診斷急性膜腺炎嚴(yán)重程度的試 劑盒中的用途。
[0008] 所述診斷急性膜腺炎嚴(yán)重程度的試劑盒W檢測CA畑9的mRNA表達(dá)水平或CA畑9 蛋白表達(dá)水平為檢測指標(biāo)。
[0009] 當(dāng)W檢測CA畑9的mRNA表達(dá)水平為檢測指標(biāo)時(shí)，所述試劑盒至少包括CA畑9的特 異性引物、內(nèi)參引物、陰性對照和陽性對照。
[0010] 進(jìn)一步的，所述試劑盒還應(yīng)當(dāng)包括正常對照。
[0011] 在獲得CARD9的特異性引物的情況下，可配合常規(guī)的外周血單核細(xì)胞提取試劑、 RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、real time PCR試劑，通過從樣本中分離出外周血單核細(xì)胞，進(jìn) 一步提取外周血單核細(xì)胞的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和real time PCR的方法來檢測CA畑9的mRNA 的表達(dá)水平。
[0012] 當(dāng)W檢測CARD9蛋白表達(dá)水平為檢測指標(biāo)時(shí)，所述試劑盒至少包括CARD9的單克 隆抗體。
[001引在獲得CA畑9的單克隆抗體的情況下，可配合常規(guī)的western blot試劑、SDS-聚 丙帰醜胺凝膠電泳，采用western blot檢測CA畑9蛋白表達(dá)水平。
[0014] 考慮CA畑9蛋白表達(dá)滯后于基因?qū)哟伪磉_(dá)，且SAP患者CA畑9高表達(dá)，雖然治療 后，mRNA表達(dá)有所下降仍高于正常水平，故蛋白表達(dá)仍然處于高水平。所W認(rèn)為選擇CARD9 的mRNA表達(dá)比蛋白表達(dá)能更準(zhǔn)確評估急性膜腺炎嚴(yán)重程度。
[0015] 本發(fā)明還進(jìn)一步公開了一種診斷急性膜腺炎嚴(yán)重程度的試劑盒，所述試劑盒包括 CARD9的特異性引物、內(nèi)參引物、陰性對照和陽性對照。
[0016] 進(jìn)一步的，所述試劑盒還應(yīng)當(dāng)包括正常對照。
[0017] 如實(shí)施例列舉的，所述CARD9的特異性引物為：
[001引上游引物
[001引下游引物
[0020] 內(nèi)參選用GAPDH (甘油醒-3-磯酸脫氨酶），所述內(nèi)參引物為：
[00川上游引物
[0022] 下游引物
[0023] 內(nèi)參引物亦可選擇目-actin的引物。
[0024] 所述陰性對照為；DEPC去離子水
[002引所述陽性對照為；構(gòu)建的CA畑9基因質(zhì)粒DNA
[0026] 所述正常對照為；健康成人的靜脈血
[0027] 進(jìn)一步的，所述試劑盒中還可W包括W下試劑中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：人外周血單核細(xì) 胞提取試劑、RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、除引物W外的PCR試劑。
[0028] 所述人外周血單核細(xì)胞提取試劑、RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、除引物W外的PCR 試劑均為現(xiàn)有技術(shù)。
[0029] 所述人外周血單核細(xì)胞提取試劑可采用常規(guī)，如Ficol 1淋己細(xì)胞分離液、PBS緩 沖液、細(xì)胞培養(yǎng)基等。
[0030] 所述RNA提取試劑可采用常規(guī)，如TriZO1 (或RNAISO Plus)、氯仿、異丙醇、75 %的 己醇、去離子水等。
[0031] 所述逆轉(zhuǎn)錄試劑可采用常規(guī)，如PrimeScript 1st Strand C化a Synthesis Kit 等。
[0032] 所述除引物W外的PCR試劑一般包括；Taq酶、dNTPs、英光染料（如SYBR Green 染料等）、Mg2+及PCR緩沖液等。均為常見組分，其用量亦為常規(guī)。
[003引 W上PCR試劑可與引物一起配置成PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，也可直接W市售的不含引物 的通用PCR擴(kuò)增反應(yīng)液加入引物及染料配置獲得。
[0034] 具體的，基于本發(fā)明，可采用下列方法診斷急性膜腺炎嚴(yán)重程度：
[0035] (1)提取人外周血單核細(xì)胞；使用Ficol 1淋己細(xì)胞分離液按照密度梯度離必法 分人外周血單核細(xì)胞。
[0036] 似提取外周血總RNA ;使用Trizol提取外周血單核細(xì)胞中總RNA。
[0037] 做逆轉(zhuǎn)錄：
[00測 （4)英光定量PCR。
[003引 妨根據(jù)英光定量PCR檢測的CARD9水平，相比健康對照，CARD9水平越高則急性 膜腺炎越嚴(yán)重。
[0040] 本發(fā)明基于CARD9的表達(dá)與急性膜腺炎嚴(yán)重程度的關(guān)聯(lián)的掲示，提供了早期檢測 急性膜腺炎嚴(yán)重程度的新方法。采用本發(fā)明的方法及試劑盒診斷急性膜腺炎嚴(yán)重程度，相 比RANSON評分的敏感性更高。
【附圖說明】
[0041] 圖1離必管中PBMC沉淀加入1ml PBS液吹打均勻后接種于O 60mm玻璃培養(yǎng)平皿 (40 X 10倍鏡下）
[0042] 圖2CA畑9蛋白在急性膜腺炎中的表達(dá)。*SAP組與正常組相比P<0. 05 ;#MAP組入 院第H天與SAP組相比P<0. 05, ##MAP組入院第五天與SAP患者相比P<0. 05。
[0043] 圖3CA畑9mRNA在急性膜腺炎的表達(dá)。*與正常組相比P<0. 05 ;#AP患者入院第五 天與第一天相比P<〇. 05 ;##SAP與MAP入院第一天相比P<0. 05。
[0044] 圖4AP患者入院后第一天CA畑9mRNA表達(dá)水平、RANSON評分、LDH、血淀粉酶的ROC 曲線
【具體實(shí)施方式】
[0045] W下列舉具體實(shí)例W進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，實(shí)例并非用于限制本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0046] 實(shí)施例1試劑盒的制備
[0047] 將W下試劑裝配成試劑盒：
[004引 1) CA畑9的特異性引物對：
[0049] 上游引物
[0050] 下游引物
[0051] 2)內(nèi)參引物對：
[0052] 上游引物
[0053] 下游引物
[0054] 3)陰性對照；DEPC去離子水
[005引 4)陽性對照；構(gòu)建CA畑9基因質(zhì)粒DNA
[0056] 4. 1引物設(shè)計(jì)：
[0057] 從GenBank中查詢目的基因上下游的序列，用Vector NTI軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。
[0058] 引物序列為：
[0059] 上游引物
[0060] 下游引物
[0061] 模板來源：正常人外周血單核細(xì)胞 [00的]PCR擴(kuò)增目的片段：
[0063] 使用高保真的PrimeSTAR酶擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)體系和條件如下：
[0065] PCR反應(yīng)條件；98°C 10砂55°C 5砂72°C I分鐘Ab 30個循環(huán)
[0066] 4. 2瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果：
[0067] 目的片段PCR擴(kuò)增成功后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過和DNA Marker的對比， 目標(biāo)片段大小為：62. 3化，判斷目的片段擴(kuò)增成功。
[006引 4. 3膠回收目的片段：
[0069] 把目的片段條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來，用TaKaRaMiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3.0做膠回收，具體步驟參考試劑盒說明書。
[0070] 4. 4線性化表達(dá)載體的制備：
[0071] 用限制性內(nèi)切酶使用EcoRI和BamHI雙酶切（構(gòu)建好W后的Card9的C端帶有 SFl