一株高產(chǎn)脂肽抗生素和聚-γ-谷氨酸的枯草芽孢桿菌菌株的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域或者農(nóng)業(yè)微生物技術領域，涉及一株同時高產(chǎn)脂肽抗生 素 Surfactin和聚-γ -谷氨酸的功能菌株。
【背景技術】
[0002] 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是土壤中一類比較重要的微生物群體，在防 治植物的根部、葉部和枝干病害中發(fā)揮了重要作用?？莶菅挎邨U菌用于防治植物病害的作 用已受到國外企業(yè)的充分重視，作為生物殺菌劑已有多個廠商進行了登記?？莶菅挎邨U菌 中通過非核糖體途徑合成的脂肽類化合物是一類主要的抑菌物質(zhì)，主要有表面活性素 (surfactin)、豐產(chǎn)素(fengycin)、伊枯草菌素（iturin)、桿菌霉素(bacillomycin)、抗霉枯 草菌素 (mycosubtil in)和制磷脂菌素 (pi ipstatin)。其中，surfactin是表面活性最強的脂 肽類抗生素，具有廣譜高效的抗菌活性，不僅對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、霉菌等多種 細菌或真菌具有抗菌作用，而且對病毒、支原體和原蟲等也具有顯著的抑制效果。
[0003] 聚-γ -谷氨酸，由微生物合成的一種細胞外高分子多氨基酸聚合物，由谷氨酸單 體通過α-氨基和γ-羧基縮合而成，同樣具有生物可降解性，并具有緩釋性、吸水性等功能。 許多菌株都能在胞外產(chǎn)生γ -PGA，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生γ -PGA的菌株均屬于芽孢桿菌 屬。聚谷氨酸在土壤和肥料等方面的應用已經(jīng)成為了農(nóng)業(yè)領域一個新的生長點，如:可用于 土壤保水劑、包埋尿素提高肥料利用率。聚谷氨酸自身也具有良好的肥料效應，在玉米、小 白菜等作物上開展的實驗表明，較低濃度的細菌源聚谷氨酸對低營養(yǎng)條件下植物的生長有 顯著的促進作用。
[0004] 因此，同時產(chǎn)生脂肽抗生素 surfactin和高分子量γ-聚谷氨酸兩種功能物質(zhì)的芽 孢桿菌菌株在農(nóng)業(yè)應用領域具有顯著的價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一株可以高產(chǎn)脂肽抗生素和聚-γ -谷氨酸的枯草芽孢桿 菌。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的技術目的，本發(fā)明的技術方案為：
[0007] -株枯草芽孢桿菌，該菌株分類命名為枯草芽孢桿菌（Bacillus Bubtilis) NJtech 489,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2015561。
[0008]該菌株能夠同時高產(chǎn)脂肽抗生素 Surfactin和聚-γ -谷氨酸。
[0009] -種同時生產(chǎn)脂肽抗生素 Surfactin和聚-γ-谷氨酸的方法，發(fā)酵培養(yǎng)本發(fā)明所 述的菌株，分離發(fā)酵液和菌體，從發(fā)酵液中分別純化獲取Surfactin和聚-γ-谷氨酸。
[0010] 本發(fā)明所述的菌株具有以下特征：
[0011] (1)菌株的菌落形態(tài)特征：形狀不規(guī)則，邊緣不整齊，表面皺褶，濕潤，挑起菌落會 形成長細絲。
[0012] (2)菌體的形態(tài)特征:菌株是革蘭氏陽性桿菌，形成芽孢，芽孢較大，圓柱形，居中。 半固體穿刺運動，有鞭毛，有莢膜。
[0013] (3)菌體的代謝特征：在羊血平板上生長時，有產(chǎn)生溶血圈；發(fā)酵生產(chǎn)過程中會生 成大量氣泡，并且發(fā)酵液粘度會增大，即可以同時產(chǎn)生生物表面活性素 Surfactin和聚-γ- 谷氨酸。
[0014] (4)菌體分子特征，16SDNA鑒定同源性最近的種屬為枯草芽孢桿菌。
[0015] (5)菌株的代謝生長特征:可以高效利用木糖進行自身生長，但低產(chǎn)本身能夠高產(chǎn) 的surf act in與聚谷氨酸。
【附圖說明】
[0016] 圖1可視化分析圖。
[0017] 本發(fā)明涉及的生物材料是一株枯草芽孢桿菌，該菌株分類命名為枯草芽孢桿菌 (Bacillus Bubtilis)NJtech 489,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC，地址：中 國.武漢.武漢大學），保藏日期是2015年9月18號，其保藏編號為CCTCC NO:M 2015561。
【具體實施方式】
[0018] 實施例1:本實施例說明分離、鑒定菌株的過程
[0019] (1) 土壤樣品處理:取lg勝利油田的土壤放入100mL無菌水(放有磁力攪拌器，少量 玻璃珠)中，在37°C，攪拌30min，再將土樣液在沸水中煮沸8-10min。
[0020] (2)將步驟1中獲得的液體，靜止10-20min，取上清液lmL放入50mL種子培養(yǎng)液中， 37' c，200rpm 下培養(yǎng) 12h。
[0021] 其中，種子培養(yǎng)液培養(yǎng)基組成為:蛋白粉l〇g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10 g/L。
[0022] (3)在超凈工作臺用移液槍取上述步驟2中培養(yǎng)液lmL于①號9mL生理鹽水的無菌 試管中，充分震蕩，使樣品均勻分散，即為ΠΓ 1的樣品稀釋液;再取ΠΓ1的樣品稀釋液lmL于 ②號9mL生理鹽水的無菌試管中，以此類推，依次標記10- 2、10-4、10-5、10-6、10一7。
[0023] (4)血平板培養(yǎng):分別取10-5-10-7稀釋度稀釋液0.15mL無菌涂布棒涂布均勻于血 平板上，平放靜置20min，后倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。其中血平板培養(yǎng)基組成為:酵 母膏5-10g/L，蛋白胨10-12g/L，氯化鈉10-12g/L，脫纖維除菌棉羊血8%，瓊脂2%。
[0024] (5)取步驟1.4中溶血圈較大的菌株進行排油圈試驗。取直徑為9cm的培養(yǎng)皿，加入 20mL的蒸餾水，在水中央加入200yL的用蘇丹紅ΙΠ 染色的煤油形成一薄層油膜，在煤油中間 慢慢加入一滴發(fā)酵上清液，測定排油圈的直徑。煤油是經(jīng)過蘇丹紅m染色的，煤油：蘇丹紅 m的比例為200:1。選取排油圈較大的幾個菌株進行分別平板劃線后平放靜置20min，后倒 置于37 °C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。分別標記BS-1、BS-2、BS-3….。
[0025] (6)通過對1.5步驟所分離出來的菌株進行平板觀察，有菌落形態(tài)為中間凸起，且 挑起有長絲，不易脫離平板。
[0026] 獲得了一株菌株，初步命名為Bacillus Bubtilis-NJtech 489。
[0027] (7)將步驟6所得菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37°C，200rpm搖床下培養(yǎng)12h。再 分別按1%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C，200rpm搖床下培養(yǎng)48h，對發(fā)酵液進行處理 (進行Surfactin含量的測定），有不溶于有機溶劑物質(zhì)，因此，用無水乙醇對發(fā)酵液進行醇 提，有部分沉淀（由于太少，無法定量），故采用凝膠滲透色譜進行定量及分子量的分析。測 得發(fā)酵液中含有Surfactin與聚谷氨酸含量分別為262mg/L、1.5g/L，并得聚谷氨酸分子量 為40萬-200萬Da。
[0028] 發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：蔗糖30g/L，氯化銨5g/L，磷酸二氫鉀2g/L，7水合硫酸亞鐵 0.02g/L，7 水合硫酸鎂 0.2g/L，pH為 7.00。
[0029] 凝膠滲透色譜條件：色譜柱為Superose 6(Pharmacia Co ·)，流動相為50mmol/L pH 7.5的磷酸緩沖液，流速0.4mL/min，經(jīng)計算，所產(chǎn)聚谷氨酸分子量范圍：40萬-200萬Da。
[0030] 高效液相色譜條件:色譜柱為Synchronis C18(4 · 6 X 250mm，5μηι)，流動相為甲醇： 水(含有〇 · 05 %的三氟乙酸）=9:1;流速為0 · 8ml/L，波長214nm，溫度35°C。
[0031]實施例2:本實施例說明菌株了16sDNA鑒定、命名與保藏的過程 [0032] 1、細菌DNA的提?。?br>[0033] 1.1搖瓶接種:挑去單菌落于液體LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm搖床下培養(yǎng)12LLB液 體培養(yǎng)基配方為:蛋白粉1 〇g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉1 Og/L。
[0034] 1.2細菌基因組的提?。?br>[0035] ①：取lmL細菌菌液于1.5mL離心管中，室溫12000rpm，離心2min棄上清。若為革蘭 氏陰性菌，加入18(^1^81^€6161^、2(^以2〇11^/1111)的蛋白酶和1(^1^的1?^86厶（1〇11^/1111)充 分振蕩混合均勻，于56°C水浴溫育10min。若為革蘭氏陽性菌，500yL的Buffer BS重懸細胞、 加入5(^1^的1^8〇2：71116(2〇11^/1111)，充分吸打均勾，與37°(^水浴溫育6〇111；[11(每隔20111；[11混勾一 次），后 12000rpm離心5min，棄上清，再加入 180yL的Buf f er GL、20yL的Proteinanse K (20mg/ml)和10yL的RNase A(10mg/ml)充分振蕩混合均勾，于56°C水浴溫育10min。
[0036] ②：再加入200yL的Buffer GB和200yL的100 %的乙醇，充分吸打混勻。將Spin Column放置新離心管中，12000rpm離心2min，棄濾液。
[0037] ③：加入500yL Buffer WA，12000rpm離心2min，棄濾液。再加入700yL Buffer WB， 12000rpm 離心2min，棄濾液。再12000rpm 離心2min。
[0038] ④:最后將Spin Column放置新的1.5ml離心管中，加入50-200yL的滅菌蒸餾水，靜 置5min，最后12000rpm離心2min，得DNA提取液。
[0039]⑤將提取到的基因組DNA通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。
[0040] 2、16s rDNA的PCR擴增：以提取的細菌DNA作為模板，用細菌通用引物擴增16S rDNA序列。引物序列為：
[0041 ] BSF(27f)：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；
[0042] BSR(1492r)：TACGGCTACCTTGTTTACGACTT〇
[0043] 反應條件： 1 94〇C5 min 預變性
[0044] 2 94Γ45 s 變·丨1: 3 55 U45 s ill·；； 4 72 °C Imin 延#
[0045] goto 2 30 個循環(huán) 5 72 °C 5min 6 4 T： hold.,
[0046] PCR反應產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離后，然后將電泳膠回收，得純化后的DNA 片段。
[0047] 3.連接：
[0048]將純化后的DNA片段連接到載體上，以備測序。載體采用大連寶生物工程有限公司 的PMD-18T Vector。
[0049] 連接體系：
[0050] 反應體系對照體系
[0051]
[0052] 4、轉化：
[0053] 取2組感受態(tài)細胞50ul在冰上溶解，第一組加連接液5ul，另一組作為對照組不加 外源DNA，輕輕旋轉，混勻內(nèi)容物，在冰上放置30min。之后取出，42°C，90s熱激，不能搖動。冰 浴2min。每管加入900ul LB培養(yǎng)基（37°C預熱），不含抗生素。溫浴4511^11，（160印111，37°(：)離 心，12000rpm，lmin，不要棄盡上清，剩余約200ul涂平板，37°C，培養(yǎng)24h。
[0054]