腸桿菌耐草甘膦基因argF、編碼蛋白及其應用
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領域，具體涉及一種腸桿菌耐草甘膦基因 argF、編碼蛋 白及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因資源的獲得是抗草甘膦轉(zhuǎn)基因育種的關鍵，抗草甘膦基因可分為靶基因和非 靶基因。草甘膦在細胞中的靶標是芳香氨基酸生物合成中的關鍵酶5-烯醇丙酮酸-莽草 酸-3_磷酸合酶（EPSPS)，EPSPS僅在細菌和植物中存在（SteinrUcken&Amrhein，1980)， 參與莽草酸途徑合成生物體所必須的芳香族氨基酸，在細胞對草甘膦的耐性中起著重要作 用。除靶基因外，抗草甘膦生物中非靶基因的研究也受到一定的關注。目前發(fā)現(xiàn)的非靶基因 包括C-N鍵氧化裂解基因，如草甘膦氧化還原酶基因 GOX ;參與裂解C-P鍵的C-P裂解酶；磷 酸轉(zhuǎn)移酶基因 glpA、glpB和igrA，甘氨酸氧化酶基因 GO ;草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因 GAT使 草甘膦發(fā)生乙?；?，無法與EPSPS結(jié)合，將草甘膦轉(zhuǎn)化為低毒的乙酰草甘膦；此外轉(zhuǎn)運蛋白 能夠主動運輸某些磷酸化合物，推測草甘膦也可能被轉(zhuǎn)運蛋白運出細胞外（朱金文，2008， 李亮，2010, Pollegioni, et al.，2011)。
[0003] 抗草甘膦基因被廣泛應用于轉(zhuǎn)基因育種研究，如Barry將細菌中獲得的GOX轉(zhuǎn)入 小麥獲得了抗性植株（Barry，2002) Jazquez也將磷酸轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化煙草，提高了其抗 性（Penaloza-Viizquez, et al.，1995) ;Smart等則證實過表達EPSP合酶能夠提高植物的抗 性（Smart, et al.，1985);謝龍旭將抗性基因 aroAM12轉(zhuǎn)入棉花得到抗草甘膦的棉花（謝 龍旭，et al.，2004,劉錫娟，2007)。在目前被挖掘的一系列抗性基因中，已被用于商業(yè)化 轉(zhuǎn)基因作物中的有aroA-cp4(根癌土壤桿菌）、G0X (人蒼白桿菌）、2mepsps(玉米的雙突變 EPSPS)、gat (地衣芽孢桿菌）、epsps (Ag)(球形節(jié)桿菌）、mepsps (玉米的經(jīng)修飾的EPSPS)、 epsps grg23ace5(人工合成的類似于epsps(Ag)的基因）。
[0004] 由于抗草甘膦轉(zhuǎn)基因中除靶基因的耐草甘膦能力較強外，目前大部分挖掘的基因 耐性較弱，挖掘的基因相對較少。生物對草甘膦的抗性涉及大量調(diào)控不同層面抗性的相關 基因 （Fei et al.，2013)，因此挖掘不同層面且耐草甘膦能力強的基因?qū)共莞熟⑥D(zhuǎn)基因 育種至關重要。
[0005] 基因 argF編碼鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶，該轉(zhuǎn)移酶利用鳥氨酸合成精氨酸，在各種 生長環(huán)境中該基因都被反向調(diào)節(jié)，過多或過少的精氨酸或其他C源都會抑制argF的表達 (Voellmy&Leisinger, 1978)，該基因的下調(diào)一方面能夠使鳥氨酸積累，具有抗?jié)B透的作用， 另一方面可以幫助合成其他氨基酸如脯氨酸、芳香族氨基酸等（Weglenski，1967)。
[0006] 目前，國內(nèi)外已克隆多個對草甘膦有一定抗性的突變體基因。新基因的分離和 克隆對轉(zhuǎn)基因抗除草劑植物的培育及防止抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生交叉抗性，具有重要意 義。本發(fā)明就是從草甘膦抗性進化的腸桿菌中分離得到了具有耐草甘膦能力的基因 argF。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] I、發(fā)明要解決的技術(shù)問題
[0008] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供了一種腸桿菌耐草甘膦基因 argF〇
[0009] 本發(fā)明的另一個目的是提供耐草甘膦基因 argF所編碼的蛋白。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的是提供含有上述抗性基因的重組載體。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述基因或重組載體在調(diào)控植物對草甘膦抗性及培 育耐草甘膦作物品種中的應用。
[0012] 2、技術(shù)方案
[0013] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0014] -種腸桿菌中耐草甘膦基因 argF，其核苷酸序列如序列表Seq ID NO. 1所示。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種耐草甘膦基因 argF所編碼的蛋白，其氨基酸序列如序列表 Seq ID NO. 2 所示。
[0016] 進一步地，本發(fā)明提供了一種含有該耐草甘膦基因 argF的重組載體，是將耐草甘 膦基因 argF插入pMDC83植物過表達載體中而成的。
[0017] 進一步地，本發(fā)明提供了擴增所述耐草甘膦基因 argF全長或其任意片段的引物 對，該引物對的上游引物如序列表Seq ID No. 3所示，下游引物如序列表Seq ID No. 4所示。
[0018] 進一步地，本發(fā)明提供了所述耐草甘膦基因 argF或所述重組載體在調(diào)控植物對 草甘膦抗性中的應用。
[0019] 進一步地，本發(fā)明提供了所述耐草甘膦基因 argF或所述重組載體在培育耐草甘 膦作物品種中的應用。
[0020] 進一步地，本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，就是將所述耐草甘膦基因 argF通過重組載體導入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物抗草甘膦性高于所述 目的植物。
[0021] 3、有益效果
[0022] ⑴本發(fā)明所提供基因 argF的功能是參與腸桿菌耐草甘膦脅迫應答反應，過量表 達argF的擬南芥與未轉(zhuǎn)基因的擬南芥相比，耐草甘膦的能力得到顯著提高，表明該基因?qū)?提高植物的耐草甘膦方面起著一定的作用。
[0023] ⑵本發(fā)明的argF可作為目的基因?qū)胫参铮岣咧参锬统輨┑哪芰?，以進行植 物品種改良，所編碼的蛋白質(zhì)具有耐逆功能。
[0024] ⑶利用任何一種可以導入外源基因并在植物中表達的載體，可將本發(fā)明argF基 因?qū)胫参锛毎色@得耐草甘膦能力得以提高的轉(zhuǎn)基因植物。
[0025] ⑷使用本發(fā)明的基因 argF構(gòu)建植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上 任何一種增強型啟動子或誘導型啟動子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及 篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的選擇性標記基因（GUS基 因、熒光素酶基因等）或具有抗性的抗生素標記物（慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等）。 從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以除草劑逆境篩選轉(zhuǎn)化植 株。
[0026] (5)攜帶有本發(fā)明argF的植物表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載 體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導、農(nóng)桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并 將轉(zhuǎn)化的植物組織培養(yǎng)成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物如水稻、小麥、玉米 等，也可以是雙子葉植物如大豆、黃瓜、苜蓿、番茄等。
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發(fā)明腸桿菌中耐草甘膦基因 argF的克隆PCR檢測電泳圖。
[0028] 圖2為基因 argF在工程菌大腸桿菌BL21中的蛋白質(zhì)表達情況分析（SDS-PAGE 圖）；注：marker 從上至下分別是 116. 0KD、66. 2KD、45. 0KD、35. 0KD、25. 0KD、18. 4KD、 14. 4KD，圖從左往右分別是marker、誘導前對照、誘導后菌的總蛋白、總蛋白經(jīng)超聲波裂解 后的沉淀、總蛋白經(jīng)超聲波裂解后的上清。
[0029] 圖3為工程菌大腸桿菌BL21對草甘膦的耐性分析圖。
[0030] 圖4為轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代陽性苗（潮霉素抗性）的效果圖。
[0031] 圖5為轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代陽性苗argF基因插入情況的PCR檢測電泳圖。
[0032] 圖6為轉(zhuǎn)基因擬南芥耐草甘膦性狀分析對比圖；注：對生長了約14天的植株進行 草甘膦（終濃度〇. 5mM)的48h的處理，觀察其表型。
[0033] 圖7為草甘膦處理下argF在擬南芥中的表達分析圖；注：對生長了約14天的植株 進行草甘膦（終濃度0. 5mM)的24h的處理，每隔6h取一次樣。
[0034] 圖8為基因 argF與革巴基因 aroA關系的信息學分析圖。
[0035] 圖9為細菌雙雜中基因的westernblot驗證的PCR檢測電泳圖；注：基因 argF編 碼的蛋白大小為47KD，Marker從上至下分別是100、70、50、40、30、25KD。從圖中可以看到 基因得到了良好的表達。
[0036] 圖10為細菌雙雜圖；注：圖中1為陽性對照；2、3為陰性對照；4為雙雜實驗。
【具體實施方式】
[0037] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0038] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0039] 實施例1 :腸桿菌耐草甘膦基因 argF的克隆
[0040] (1)設計引物，提取微生物腸桿菌DNA :
[0041] 用細菌總DNA提取試劑盒（購自天根公司）提取微生物腸桿菌 (Enterobacteriaceae)的DNA，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的大腸桿菌argF基因序列設計引 物進行同源克隆。擴增的引物序列為：
[0042] Seq ID NO. 3 :