構(gòu)建生產(chǎn)或高產(chǎn)目的基因產(chǎn)物重組菌的方法及構(gòu)建的重組菌與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種構(gòu)建生產(chǎn)或高產(chǎn)目的基因產(chǎn)物重組菌的 方法及構(gòu)建的重組菌與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然界中的動(dòng)植物、微生物可以合成許多具有結(jié)構(gòu)和功能多樣性的有機(jī)小分子化 合物。與蛋白質(zhì)、核酸、脂類等生物大分子相比，它們并不直接參與生物體的生長和發(fā)育，但 卻具有重要的生物活性及生理功能。人們把這樣的活性小分子化合物稱為天然產(chǎn)物。許多 天然產(chǎn)物在醫(yī)學(xué)上或工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有重要用途。
[0003] 傳統(tǒng)的開發(fā)和挖掘活性天然產(chǎn)物方法，如高通量篩選和OSMAC("one strain many compounds"）手段都已很難發(fā)現(xiàn)新穎藥物先導(dǎo)化合物（Zhu H，Sandiford SK, van Wezel GP (2014)Triggers and cues that activate antibiotic production by actinomycetes. J Ind Microbiol Biotechnol 41 (2):371 - 386.)，與已發(fā)掘的化合物分子數(shù)相比，已測序 的微生物基因組中，仍然存在大量的次級(jí)代謝基因未表達(dá)，而且這些相關(guān)基因在基因組中 成簇存在，稱為基因簇。這些未表達(dá)的基因簇稱為"沉默"或"潛在"基因簇，這些沉默基 因簇提示著我們，微生物中仍然蘊(yùn)含著一個(gè)等待開發(fā)的天然產(chǎn)物寶庫（Rebets Y，Br^Z Ej Tokovenko Bj Luzhetskyy A(2014)Actinomycetes biosynthetic potential:How to bridge in silico and in vivo ? J Ind Microbiol Biotechnol.41 (2):387 - 402.)〇
[0004] 造成這些基因簇沉默的重要原因之一是：在微生物的基因組中，蘊(yùn)含大量轉(zhuǎn) 錄和翻譯的調(diào)控基因，這些調(diào)控基因構(gòu)成了一個(gè)負(fù)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，抑制了基因簇的表達(dá)。而 如何解除這些嚴(yán)密的調(diào)控，或利用調(diào)控激活沉默基因簇，正是挖掘活性天然產(chǎn)物所遇 到的難點(diǎn)。為了激活這些沉默的基因簇，獲得活性的天然產(chǎn)物，研究者開發(fā)了很多挖 掘的方法，大致分為針對(duì)菌體細(xì)胞的生理刺激和合成或遺傳生物學(xué)的操作，以及兩者 兼?zhèn)?Aigle Bj Corre C(2012)Waking up Streptomyces secondary metabolism by constitutive expression of activators or genetic disruption of repressors. Methods Enzymol. 517:343 - 366. Luo Yjet al. (2013)Activation and characterization of a cryptic polycyclic tetramate macrolactam biosynthetic gene cluster. Nat Commun. 4(4):2894. Zhuo Y，et al. (2010)Reverse biological engineering of hrdB to enhance the production of avermectins in an industrial strain of Streptomyces avermitilis. Proc Natl Acad Sci USA. 107(25) :11250 - 11254·)。合成或遺傳生物學(xué)的 操作則針對(duì)目的基因采用外源表達(dá)元件繞開菌體自身負(fù)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，促使目的基因表達(dá)。而 使用外源表達(dá)元件過表達(dá)目的基因的工作中，表達(dá)元件之間會(huì)產(chǎn)生部件交互干擾，特別在 強(qiáng)表達(dá)元件之間，或各元件在轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中，均會(huì)出現(xiàn)一些干擾，從而使得過表達(dá)的 效果大大降低（Lou C，Stanton B，Chen Y_J，Munsky B，Voigt CA(2012)Ribozyme_based insulator parts buffer synthetic circuits from genetic context. Nat Biotechnol 30(11) :1137 - 1142.) ο
[0005] 鏈霉菌屬革蘭氏陽性放線菌，在系統(tǒng)生物學(xué)上歸于鏈霉菌屬（Str印tomyces)， 具有復(fù)雜生活周期和次生代謝途徑。該屬的許多成員都能產(chǎn)生豐富的具有生物活性的 次級(jí)代謝產(chǎn)物。目前已知的上萬種抗生素中，有70%以上是由鏈霉菌產(chǎn)生的。除此之 外，它還能產(chǎn)生免疫抑制劑、抗腫瘤劑、殺蟲劑和多種胞外水解酶，如纖維素酶、淀粉酶、果 膠酶和蛋白酶等。（Zhu F，et al. (2011)Clustered patterns of species origins of nature-derived drugs and clues for future bioprospecting. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (31) : 12943 - 12948.)這些特性提示我們，鏈霉菌具有這些類別天然產(chǎn)物的前體 代謝途徑，是天然產(chǎn)物異源合成的理想宿主之一。目前某些鏈霉菌已經(jīng)完成全基因組測 序并建立起了標(biāo)準(zhǔn)的遺傳操作規(guī)程，為天然產(chǎn)物的異源合成提供了便利，如阿維鏈霉菌 Streptomyces avermitilis。
[0006] 番茄紅素是一類具有抗氧化能力的二萜化合物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健、食品 化工和化妝品產(chǎn)業(yè)中（Namitha KK, Negi PS(2010)Chemistry and biotechnology of carotenoids. Crit Rev Food Sci 50:728-760)，商用的番前紅素多以番前或番前產(chǎn) 物為原料，采用多級(jí)化學(xué)合成和化學(xué)萃取獲得（Lin Y，Jain R，Yan Y(2014)Microbial production of antioxidant food ingredients via metabolic engineering. Curr Opin Biotechnol. 26:71-78)。但是，原料受季節(jié)和地緣的影響，化學(xué)合成的復(fù)雜度、有機(jī)廢物的 污染都限制了番茄紅素的工業(yè)應(yīng)用。而近年來，隨著代謝工程和合成生物學(xué)的興起，研究者 們希望利用微生物來發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種構(gòu)建生產(chǎn)或高產(chǎn)目的基因產(chǎn)物重組菌的方法及構(gòu)建的重組菌 與應(yīng)用，本發(fā)明的重組菌替換了目的基因原有調(diào)控元件，并且消除了啟動(dòng)子與RBS等表達(dá) 元件之間的干擾，提高了目的基因的表達(dá)，從而增加了目的基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。
[0008] 本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種構(gòu)建生產(chǎn)或高產(chǎn)目的基因產(chǎn)物重組菌的方法，包括 如下步驟：
[0009] (1)選擇出發(fā)菌株和目的基因；
[0010] (2)構(gòu)建包含所述目的基因的表達(dá)載體；
[0011] (3)在步驟（2)中所述目的基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)之前插入有絕緣子功能的序 列，并且在所述有絕緣子功能的序列之前插入有異源或人工合成啟動(dòng)子序列；
[0012] (4)將步驟（3)中構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入出發(fā)菌。
[0013] 以上所述的構(gòu)建方法中，所述出發(fā)菌包括野生型或經(jīng)基因工程改造的原核微生 物；優(yōu)選地，包括大腸桿菌、鏈霉菌和放線菌。
[0014] 以上所述的構(gòu)建方法中，所述鏈霉菌包括野生型鏈霉菌或經(jīng)修飾、突變、誘變或基 因重組獲得的鏈霉菌；優(yōu)選地，所述鏈霉菌為Streptomyces avermitilis MA4680。
[0015] 以上所述的構(gòu)建方法中，所述目的基因包括原核生物基因組編碼的基因，真核生 物cDNA中編碼的基因。
[0016] 以上所述的構(gòu)建方法中，所述原核生物基因組編碼的基因包括在鏈霉菌中編 碼的基因；優(yōu)選地，包括 Geranylgeranyl diphosphate synthase (crtE)、Phytoene desaturase (crtl)和 Phytoene synthase (crtB)基因。
[0017] 以上所述的構(gòu)建方法中，所述異源或人工合成啟動(dòng)子包括經(jīng)修飾改造的原啟動(dòng)子 序列、所述出發(fā)菌中其他基因啟動(dòng)子序列、異源菌株中的啟動(dòng)子序列或經(jīng)人工合成的啟動(dòng) 子序列；優(yōu)選地，包括 SP12、SP18、SP23、SP26、kasOp*、SP43 或 SP44 啟動(dòng)子。
[0018] 以上所述的構(gòu)建方法中，所述有絕緣子功能的序列是在轉(zhuǎn)錄形成RNA后具有5'端 剪切的核酶功能，并通過切除所述有絕緣子功能的序列前的序列，減弱核糖體結(jié)合序列所 受干擾并且轉(zhuǎn)錄后形成RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列；優(yōu)選地，包括LtsvJ、SCCJ Rib〇J、SarJ、PlmJ、 VtmoJ、ChmJ、ScvmJ、SltJ 或 PlmvJ 序列。
[0019] 以上所述的構(gòu)建方法中，步驟（2)中采用整合型質(zhì)粒載體表達(dá)所述目的基因。
[0020] 以上所述的構(gòu)建方法中，所述整合型表達(dá)載體為大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體 PIJ8660。
[0021] 本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種高產(chǎn)目的基因的重組菌，所述重組菌中具有包含 目的基因的表達(dá)載體，所述目的基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)之前插入有絕緣子功能的序列，并 且在所述有絕緣子功能的序列之前插入有異源或人工合成啟動(dòng)子。
[0022] 以上所述的重組菌，所述目的基因?yàn)榘琧rtE基因、crtl基因和crtB基因的基 因簇。
[0023] 以上所述的重組菌，所述異源或人工合成啟動(dòng)子包括經(jīng)修飾改造的原啟動(dòng)子序 列、出發(fā)菌株中其他基因啟動(dòng)子序列、異源菌株中的啟動(dòng)子序列或經(jīng)人工合成的啟動(dòng)子序 列；優(yōu)選地，包括 SP12、SP18、SP23、SP26、kasOp*、SP43 或 SP44 啟動(dòng)子。
[0024] 以上所述的重組菌，所述有絕緣子功能的序列是在轉(zhuǎn)錄形成RNA后具有5'端剪 切的核酶功能，并通過切除所述有絕緣子功能的序列前的序列，減弱核糖體結(jié)合序列所受 干擾并且轉(zhuǎn)錄后形成RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列；優(yōu)選地，包括LtsvJ、SccJ RiboJ、SarJ、PlmJ、 VtmoJ、ChmJ、ScvmJ、SltJ 或 PlmvJ 序列。
[0025] 以上所述的重組菌，所述包含目的基因的表達(dá)為整合型質(zhì)粒載體表達(dá)載體。
[0026] 以上所述的重組菌，所述整合型質(zhì)粒表達(dá)載體為大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體 PIJ8660。
[0027] 以上所述的重組菌，構(gòu)建所述重組菌使用的出發(fā)菌包括野生型或經(jīng)基因工程改造 的原核微生物；優(yōu)選地，包括大腸桿菌、放線菌和鏈霉菌。
[0028] 以上所述的重組菌，所述鏈霉菌包括野生型鏈霉菌或經(jīng)修飾、突