一株消化乳桿菌 w369及其功能應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明具體涉及一株具有亞硝酸鹽降解能力、膽固醇清除能力和抗氧化能力的消 化乳桿菌新菌株W369及其用途，屬于微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳酸菌被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，形成的食品占食品總量的25%以上，乳酸菌發(fā) 酵食品被譽(yù)為"21世紀(jì)的食品"和"健康食品"。乳酸菌具有很好的調(diào)節(jié)腸道菌群平衡形成 抗菌生物屏障，產(chǎn)生半乳糖苷酶具有緩解乳糖不適癥的作用、抗過敏、降低膽固醇、緩解腸 炎、調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫力、抗氧化延緩衰老、降低直腸癌的患病幾率等生物學(xué)功能。雖然目前 對于乳酸菌的功能研究和菌株的開發(fā)日益增多，但多數(shù)卻集中在同一菌株的單一功能，對 于新多功能單菌株的開發(fā)利用較少。
[0003] 發(fā)酵蔬菜是我國傳統(tǒng)的蔬菜加工制品之一，風(fēng)味獨特，具有開胃健脾的功效，自古 以來在餐桌上占有不可替代的一席之地。但是傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜存在發(fā)酵周期長，生產(chǎn)力不高， 產(chǎn)品質(zhì)量不易控制，不利于工廠化、規(guī)模化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，同時泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽會 出現(xiàn)一個峰值，影響了泡菜的食用安全性和發(fā)展前景。因此，嚴(yán)格控制發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽 含量是保證其食用安全的一個重要措施。接種發(fā)酵技術(shù)不僅避免了季節(jié)的限制，而且通過 發(fā)酵過程的控制能有效的避免有害微生物的侵害，縮短發(fā)酵周期，降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸 鹽的含量，提高發(fā)酵蔬菜制品的穩(wěn)定性。
[0004] 而在生產(chǎn)發(fā)酵肉制品時為了取得理想的發(fā)色效果，傳統(tǒng)做法通常是添加適量的亞 硝酸鹽作為發(fā)色劑。但隨著人們對健康的重視程度越來越高，對發(fā)酵食品中因添加亞硝酸 鹽所帶來的危害性也給予了更多的關(guān)注，開發(fā)具有降解亞硝酸鹽能力的功能性菌株，有效 降低亞硝酸鹽的最終殘留變得越來越重要。另外，由血液中膽固醇含量偏髙引起的動脈粥 樣硬化、冠心病、腦中風(fēng)等疾病也已嚴(yán)重威脅著人類健康，深入研究降低人體血清中膽固醇 的方法和開發(fā)低膽固醇食品也成為當(dāng)今功能食品研究的一個發(fā)展趨勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏多功能單菌株的問題，提供一株同時具有亞 硝酸鹽分解能力、膽固醇降解能力和抗氧化能力的消化乳桿菌新菌株W369及其在發(fā)酵食 品中的應(yīng)用。
[0006] 技術(shù)方案：
[0007] 一 ：一株消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius)W369,該菌株保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國 科學(xué)院微生物研究所，保藏日期是2015年10月16日，保藏號是：CGMCC No. 11510,建議分 類命名為 Lactobacillus alimentarius。
[0008] 該菌株最適發(fā)酵溫度為37 °C。
[0009] 二：一種消化乳桿菌W369的發(fā)酵劑的制備：消化乳桿菌W369在液體MRS培養(yǎng)基中 37°C厭氧培養(yǎng)16~18h生長至穩(wěn)定前期的菌液經(jīng)離心濃縮后，加凍干保護(hù)液重懸后，-80°C 預(yù)凍4h后冷凍干燥，獲得消化乳桿菌W369的凍干粉，凍干粉的菌體密度在1.0 X 101°~ 5. OX IO10CFlVg0
[0010] 三：消化乳桿菌W369在發(fā)酵食品中的用途。
[0011] 其中所述發(fā)酵食品是常規(guī)的發(fā)酵類食品，特別是發(fā)酵蔬菜、發(fā)酵肉制品等。
[0012] 1、發(fā)酵蔬菜的制備
[0013] 所述的發(fā)酵蔬菜是按照下述步驟制備的：新鮮蔬菜經(jīng)過挑選、清洗、瀝干，然后用 冷開水制作泡菜汁，其中食鹽占總質(zhì)量的3%~4%，白砂糖占2%~3%。接種消化乳桿菌 W369發(fā)酵劑，接種量1%。~2%。，室溫密封發(fā)酵3d。
[0014] 其中所述新鮮蔬菜是適合制作泡菜的蔬菜種類，例如白菜、黃瓜、萵苣、蘿卜、辣 椒、豇豆等。
[0015] 2、發(fā)酵肉制品的制備
[0016] 所述的發(fā)酵肉制品是按照下述步驟制備的：選用優(yōu)質(zhì)鮮肉，將其分割為1千克左 右大塊，入冷室冷卻至2°C。將冷卻后的瘦肉用絞肉機(jī)絞制為1~1. 5厘米見方的顆粒，然 后入斬拌機(jī)與肥肉混合斬拌，至肥肉成米粒大小，再加入香辛料和W369發(fā)酵菌劑混勻，其 中發(fā)酵劑占總質(zhì)量的0.5%，食鹽1 %~3%，糖1 %~2%，香辛料0.3%~2.0%。灌裝， 30~40°C發(fā)酵24h，包裝，將包裝后的香腸入85~90°C保溫50~70min，至腸體中心溫度 為70~75°C。將產(chǎn)品放入冷庫充分冷卻至2°C。
[0017] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：本發(fā)明提供了一株消化乳桿菌W369,該菌同時具有亞 硝酸鹽降解能力、膽固醇清除能力和抗氧化的三大特性，并且生長速度快，耐酸耐膽鹽、耐 NaCl，能夠順利通過胃腸道發(fā)揮其益生功能；該益生菌發(fā)酵劑應(yīng)用于泡菜發(fā)酵可以降低亞 硝酸鹽含量；應(yīng)用于肉制品發(fā)酵，能夠替代亞硝酸鹽作為發(fā)色劑，與其他防腐劑配合使用能 夠控制因微生物引起的腐敗并能夠延長貨架期，在食品的應(yīng)用方面具有廣闊的前景。
【附圖說明】
[0018] 圖1示本發(fā)明所述消化乳桿菌W369的菌落形態(tài)。
[0019] 圖2示本發(fā)明所述消化乳桿菌W369在掃描電鏡下的細(xì)胞形態(tài)（X 10.0 k)。
[0020] 圖3示本發(fā)明所述消化乳桿菌W369的生長曲線和產(chǎn)酸特性。
[0021] 圖4示本發(fā)明所述消化乳桿菌W369在不同NaCl濃度下的存活特性。
[0022] 圖5示本發(fā)明所述消化乳桿菌W369在不同pH值下的存活特性。
[0023] 圖6示本發(fā)明所述消化乳桿菌W369在不同膽鹽濃度下的存活特性。
【具體實施方式】
[0024] 下述實施例中所試用的試驗方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。
[0025] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明均可從商業(yè)途徑得到。
[0026] 實施例1、消化乳桿菌W369的鑒定
[0027] 本發(fā)明所述的從傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中篩選出的一株乳酸菌W369,利用形態(tài)學(xué)、生理生 化和分子生物學(xué)等方法將該乳酸菌鑒定為消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius)，該 菌株已于2015年10月16日保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，其保藏編 號為 CGMCC No. 11510。
[0028] I、形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定
[0029] 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對W369進(jìn)行形態(tài)特征和生理生化特性等鑒定。并 對其進(jìn)行掃描電鏡觀察。在MRS瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈灰白色，直徑約2mm，圓形，表面凸起， 濕潤易挑取（圖1)。經(jīng)戊二醛固定，乙醇梯度脫水，冷凍干燥后電鏡觀察W369形態(tài)，細(xì)胞 呈短桿狀，寬〇· 6~0· 8 μ m，長L 5~2. 3 μ m，無芽孢，無鞭毛（圖2)。革蘭氏陽性菌；過 氧化氫酶試驗呈陰性；不凝乳；在低于8°C或高于42°C不生長；在MRS液體培養(yǎng)基中最終pH 為4. 0 ;在pH 9. 2條件下不生長；不運(yùn)動。
[0030] 2、16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增與序列分析
[0031] ①細(xì)菌總DNA提?。簠⒄赵噭┖胁僮髡f明進(jìn)行。②16S rDNA擴(kuò)增：以基因組DNA 為模板，利用細(xì)菌通用引物（正向引物27F :5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ';反向引物 為 1492R :5' -GGTTACGTTACGACTT-3')進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95°C 4min ;95°C 30s， 56°C 30s，72°C 90s，30個循環(huán)；72°C lOmin。PCR產(chǎn)物切膠回收純化后送華大基因測序。 ③序列分析：將所得的16S rDNA基因序列用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性 比對，運(yùn)用MEGA 6. 0軟件采用Neighbor Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。W369與消化乳 桿菌的其他菌株處于同一個分支，與菌株L. alimentariusNBRC 106464的16S rDNA序列 (AB626058)同源性為99%，結(jié)合生理生化鑒定進(jìn)一步確認(rèn)W369為消化乳桿菌種，序列登錄 號為 KJ737424。
[0032] 實施例2、消化乳桿菌W369的特性研究
[0033] 1、菌株生長特性
[0034] 將活化好的菌株按2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中37°C靜置培養(yǎng)，每隔2h 采用比濁法在600nm處測定細(xì)菌細(xì)胞生長量和pH值直到穩(wěn)定期為止，以培養(yǎng)時間為橫坐 標(biāo)，對應(yīng)的吸光度值pH值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線和產(chǎn)酸特性曲線。在培養(yǎng)的前6h處于生 長適應(yīng)期，生長代謝緩慢，產(chǎn)酸較小；6h后緩慢進(jìn)入對數(shù)生長期，菌體呈幾何級數(shù)遞增，由 生長代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸也在不斷的積累，PH下降；到20h進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體數(shù)量趨于