一種艾納香植物葉片內(nèi)生真菌的分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種艾納香植物葉片內(nèi)生真菌的分離方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物內(nèi)生菌是指生活在健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌或細(xì)菌，在其生活 過程中宿主植物不表現(xiàn)出外在的病癥，植物與其內(nèi)生菌屬于互惠共生的關(guān)系。植物為內(nèi)生 菌提供光合產(chǎn)物和礦物質(zhì)，而內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物則能刺激植物的生長發(fā)育，提高宿主植物 對生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力。植物內(nèi)生真菌通過"共生"現(xiàn)象，對寄主植物的生理 生化和次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生影響，是天然產(chǎn)物的重要來源。由于將植物內(nèi)生菌作為生防因子 具有獨(dú)特的優(yōu)勢：它們分布于植物的不同組織中，受到植物組織的保護(hù)，具有穩(wěn)定的生態(tài)環(huán) 境，與附生菌相比更易于發(fā)揮生防作用，因此，有關(guān)植物內(nèi)生菌的研究正成為國內(nèi)外環(huán)境、 生物、化學(xué)等領(lǐng)域的焦點(diǎn)。
[0003] 現(xiàn)有內(nèi)生菌分離技術(shù)主要是將植物組織直接消毒后，通過組織切片培養(yǎng)、內(nèi)生菌 浸出涂布培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)后內(nèi)生菌浸出涂布培養(yǎng)等方式。因存在很多內(nèi)生菌可能仍然 存在植物組織中未被分離，因而，常常導(dǎo)致所分離獲取的植物內(nèi)生菌種類和數(shù)量降低。目 前，為了克服上述技術(shù)缺陷，造成植物內(nèi)生真菌釋放不充分，如中國發(fā)明專利CN10312233IA 公開的一種植物內(nèi)生菌的分離方法，中國發(fā)明專利CN104250616A公開的一種植物內(nèi)生菌 的分離方法，均有采用組織研磨方法進(jìn)行培養(yǎng)，但在實(shí)際操作中，對植物組研磨處理往往采 取的是經(jīng)驗(yàn)值，并未充分考慮到不同植物或植物的不同組織，在不同的生育期因其結(jié)構(gòu)或 生理特性的不同而造成的處理效果特異性，造成不合適的機(jī)械外力操作導(dǎo)致菌株細(xì)胞損傷 或使得內(nèi)生真菌不能充分釋放出來，因而，常常導(dǎo)致所分離獲取的植物內(nèi)生菌種類和數(shù)量 降低。另外，含菌液涂布培養(yǎng)過程中，若濃度過高而出現(xiàn)真菌生長相互干擾的問題；若濃度 過低而出現(xiàn)消耗大量培養(yǎng)基，增加人力和物力成本。
[0004] 艾納香（Blumea flavanones)為菊科艾納香屬植物，具有鎮(zhèn)痛、發(fā)汗、祛風(fēng)除濕、 祛痰止咳、通經(jīng)止血等功效。其屬重要中藥材之一，藥物價(jià)值較高；因此，研究艾納香植物內(nèi) 生真菌對艾納香植物生理生化和代謝產(chǎn)物影響，對研究艾納香植物種植和病蟲害防治以及 其他基礎(chǔ)性研究將具有重要意義。目前，國內(nèi)外以艾納香植物葉片作為材料分離內(nèi)生真菌 菌株的研究較為少見，技術(shù)尚未成熟。
[0005] 本發(fā)明為更好地考查艾納香單個(gè)葉片為單位的內(nèi)生真菌的分布狀況，采用完整葉 片全培養(yǎng)的方式，為內(nèi)生真菌對植物葉片的生理生化和代謝產(chǎn)物產(chǎn)生怎樣的影響提供進(jìn)一 步研究的基礎(chǔ)；提出了以限制尺寸的細(xì)沙為輔助材料共同研磨、采用改善植物組織的破碎 程度和顆粒的均勻度的"尺度限制性沙磨"技術(shù)，和以接種針挑取、在約束范圍內(nèi)盡量散開 接種的"約束性散接培養(yǎng)"方式，針對現(xiàn)有方法中存在的某些菌種丟失的缺陷或培養(yǎng)過程中 真菌生長相互干擾等問題，提出進(jìn)一步完善或解決方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有植物葉片內(nèi)生真菌的分離方法中存在的某些菌種丟失的缺陷或 培養(yǎng)過程中真菌生長相互干擾等現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種艾納香植物葉片內(nèi)生真菌的 分離方法。
[0007] 所述技術(shù)方案如下：
[0008] -種艾納香植物葉片內(nèi)生真菌的分離方法，其特征在于：包括以下步驟：
[0009] (1)艾納香植物葉片組織的準(zhǔn)備：采集、保存艾納香植物健康葉片；
[0010] (2)艾納香植物葉片組織的表面消毒和無菌檢測：將新鮮的艾納香植物葉片樣品 用流動清潔水沖洗干凈，放入超凈工作臺內(nèi)；然后無菌水沖洗2-3次，用75%的酒精消毒 2-3min ;再用無菌水沖洗2-3次，0. 1 %的升萊浸泡2-3min，最后用無菌水沖洗3次；將最后 一次沖洗用的無菌水，分別汲取3次，按每次0. 5mL平鋪在3個(gè)PDA培養(yǎng)基上，置于恒溫培 養(yǎng)箱內(nèi)，28°C黑暗條件下培養(yǎng)7天，無任何菌株生長；
[0011] (3)艾納香植物葉片組織內(nèi)生真菌的分離：在無菌條件下，剪去葉柄，再將葉片剪 成小片，放入研缽，混入滅菌細(xì)沙，加入無菌水，共同研磨至粘稠狀，得到植物組織、滅菌細(xì) 沙和無菌水的混合物；用接種針挑取混合物至培養(yǎng)基接種后，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-10 天，進(jìn)一步純化，得到內(nèi)生真菌純菌株。
[0012] 進(jìn)一步地，步驟（1)中葉片的采集是從葉柄與莖連接處剪下，并用保鮮膜封纏剪 切面；
[0013] 步驟（1)中葉片的保存是將采集的樣品平整、無折皺、無擠壓放入自封口袋中， 4°C保存；
[0014] 步驟（1)中健康葉片是指完整葉片，無蟲咬、無機(jī)械損傷和無菌斑。
[0015] 進(jìn)一步地，步驟（2)中葉片組織的表面消毒優(yōu)選用75%的酒精消毒2min，0. 1%的 升萊浸泡2min ;
[0016] 步驟（2)中流動清潔水沖洗是采用水流方向與葉面平行與地面垂直的垂直平行 沖洗方式，出水口距離沖洗點(diǎn)高度15cm，沖洗流量為2L/min，沖洗面積為50cm2，沖洗時(shí)間為 5min〇
[0017] 進(jìn)一步地，步驟（3)中研磨使用"尺度限制性沙磨"技術(shù)：所用葉片大小為 0.5X0. 5cm2，滅菌細(xì)沙顆粒大小為通過100目篩同時(shí)200目篩截留的細(xì)沙，葉片、細(xì)沙和無 菌水的比例為1:3:2 ;
[0018] 步驟（3)中混合物采用人力手工研磨；
[0019] 步驟（3)中真菌培養(yǎng)使用"約束性散接培養(yǎng)"技術(shù)：挑取植物組織、細(xì)沙和水混合 物體積〇. 5X0. 5X0. 2cm3;接種面積Icm2;混合物在約束面積內(nèi)均勻鋪開；
[0020] 步驟（3)中真菌培養(yǎng)使用PDA培養(yǎng)基。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：
[0022] (1)提出"單葉內(nèi)生真菌分布"概念，主要針對植株葉片，不進(jìn)行任何修剪，采用 完整葉片全培養(yǎng)的方式，更好地考查以單個(gè)葉片為單位的生長環(huán)境內(nèi)的內(nèi)生真菌的分布狀 況，為內(nèi)生真菌對植物葉片的生理生化和代謝產(chǎn)物產(chǎn)生怎樣的影響提供進(jìn)一步研究的基 礎(chǔ)；
[0023] (2)該方法主要采用限制尺寸的細(xì)沙為輔助材料進(jìn)行共同研磨，改善植物組織的 破碎程度和顆粒的均勻度的"尺度限制性沙磨"技術(shù)；和以接種針挑取，在約束范圍內(nèi)盡量 散開接種的"約束性散接培養(yǎng)"方式，解決了組織研磨過程植物內(nèi)生真菌受損及不能充分釋 放以及培養(yǎng)過程中的問題。同時(shí)，有利于增加植物組織與培養(yǎng)基的接觸面積，提高菌種與培 養(yǎng)基的接觸幾率，改善菌種初期的營養(yǎng)利用環(huán)境，縮短菌株生長周期中的調(diào)整期，又給菌株 提供相對獨(dú)立的生長空間，為后續(xù)的菌株純化提供方便。
[0024] 進(jìn)一步地，為了更具體地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明還作出了如下部分試驗(yàn)， 旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限定。
[0025] 試驗(yàn)例：
[0026] 本發(fā)明人通過大量的研究試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，影響艾納香植物葉片內(nèi)生真菌分離效果的因 素主要有：葉片處理方式、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基的選擇等，本發(fā)明采取擇優(yōu)原則，進(jìn)行了如下的 篩選試驗(yàn)：
[0027] 試驗(yàn)1 :組織研磨培養(yǎng)分離的方法考察
[0028] 采用采集自貴州省羅甸縣紅水河鎮(zhèn)的同一植株相鄰、大小相似的艾納香植物葉 片，采用本發(fā)明培養(yǎng)分離的方法進(jìn)行培養(yǎng)，按照如下不同的葉片組織研磨的方式進(jìn)行試驗(yàn)， 結(jié)果如下表1 :
[0029] 表1 :組織研磨培養(yǎng)分離艾納香植物組織內(nèi)生真菌的考察
[0031] 上述試驗(yàn)表明：影響艾納香植物組織內(nèi)生真菌分離效果與組織研磨的物料比例及 細(xì)沙尺寸有關(guān)，其物料比例、滅菌細(xì)沙尺寸是葉片組織研磨是否充分與葉片組織內(nèi)生真菌 是否遭到破壞的關(guān)鍵控制點(diǎn)，其中試驗(yàn)組3,其葉片、細(xì)沙和無菌水比例為1:3:2,滅菌細(xì)沙 尺寸為過100目篩，同時(shí)200目篩截留最佳。因此，
[0032] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方案。
[0033] 試驗(yàn)2 :不同接種方式培養(yǎng)考察試驗(yàn)
[0034] 采用采集自貴州省羅甸縣紅水河鎮(zhèn)的同一植株相鄰、大小相似的艾納香植物葉 片，進(jìn)行內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)，按照如下不同接種培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果如下表2 :
[0035] 表2 :培養(yǎng)基考察試驗(yàn)結(jié)果
CN 105176841 A 說明書 4/6 頁
[0038] 上述試驗(yàn)表明：不同的接種方式會對內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)造成影響，組織切片培養(yǎng) 及組織研磨后，菌液涂布接種培養(yǎng)方式，操作過程難以控制，容易造成培養(yǎng)過程中真菌互相 干擾難以鑒別及分離，本發(fā)明采用約束性散接培養(yǎng)方法，真菌分離培養(yǎng)效果最佳，并且有利 于增加植物組織與培養(yǎng)基的接觸面積，提高菌種與培養(yǎng)基的接觸幾率，改善菌種初期的營 養(yǎng)利用環(huán)境，縮短菌株生長周期中的調(diào)整期，方法簡單，又能節(jié)約成本。
[0039] 試驗(yàn)組3 :內(nèi)生真菌不同培養(yǎng)分離方式的考察
[0040] 采用采集自貴州省羅甸縣紅水河鎮(zhèn)的艾納香植物葉片，同一植株相鄰、大小相似 的兩枚葉片，通過組織切片培養(yǎng)和本發(fā)明方法培養(yǎng)進(jìn)行對比，具體試驗(yàn)步驟如下：
[0041] (1)組織切片培養(yǎng)法
[0042] ①艾納香植物葉片組織的準(zhǔn)備：采集、保存艾納香植物健康葉片。
[0043] ②艾納香植物葉片組織的表面消毒和無菌檢測：將新鮮的艾納香植物葉片樣品用 流動清潔水沖洗干凈