一種基于宏基因技術(shù)的石油污染海洋生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是關(guān)于一種基于宏基因技術(shù)的石油污染海洋生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)方法，屬于石油 污染生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 海洋石油污染是全球性的問(wèn)題，也是我國(guó)沿海污染最嚴(yán)重的問(wèn)題之一。隨著海上 原油開(kāi)采和原油遠(yuǎn)洋運(yùn)輸?shù)葮I(yè)務(wù)的日益增加，海洋溢油事故頻繁發(fā)生。在近20年由于船舶 事故所引發(fā)的溢油污染中，溢油量在7t以上的事故約1 780起，其中700t以上的重大溢油 事故458起。隨著有史以來(lái)美國(guó)海域最嚴(yán)重的溢油事故一一"深水地平線"平臺(tái)溢油事故 的發(fā)生，海洋溢油污染已經(jīng)成為現(xiàn)階段海洋開(kāi)發(fā)與管理領(lǐng)域所關(guān)注的重點(diǎn)。
[0003] 溢油污染嚴(yán)重影響到海洋的生態(tài)安全。對(duì)于較低營(yíng)養(yǎng)級(jí)的細(xì)菌，溢油污染可能會(huì) 改變浮游細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)源（如，碳源），并進(jìn)一步影響其群落結(jié)構(gòu)的組成。對(duì)于浮游植物，溢油 在海上形成的油膜會(huì)影響其光合作用過(guò)程，從而影響其生長(zhǎng)；一些研宄也表明石油烴也可 能促進(jìn)浮游植物的生長(zhǎng)，進(jìn)而一定程度上促進(jìn)赤潮的發(fā)生。對(duì)于高營(yíng)養(yǎng)級(jí)的浮游動(dòng)物，溢油 污染物中的毒性物質(zhì)通過(guò)吸收和攝食等途徑進(jìn)入生物體內(nèi)后，會(huì)影響其代謝過(guò)程、造成神 經(jīng)以及生殖系統(tǒng)的損傷，如多環(huán)芳香烴類物質(zhì)能夠與DNA分子堿基共價(jià)結(jié)合，形成DNA加合 物，成為致突變或致癌因子。因此，準(zhǔn)確、快速檢測(cè)溢油濃度和分析溢油污染程度，不僅是客 觀評(píng)估溢油污染損害的基礎(chǔ)，而且是及時(shí)響應(yīng)和確定應(yīng)急處置措施以降低溢油污染對(duì)海洋 生態(tài)環(huán)境破壞的關(guān)鍵，因而是目前溢油污染防治領(lǐng)域研宄中的重點(diǎn)。
[0004] 目前，溢油污染主要通過(guò)化學(xué)方法檢測(cè)，包括：重量法、環(huán)己烷萃取熒光分光 光度法、氟利昂-環(huán)己烷體系熒光分光光度法、紫外分光光度法、紅外法和填充柱氣相 色譜法等。對(duì)于評(píng)價(jià)海水和海洋沉積物的石油污染，我國(guó)已頒布的《海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》 (GB3097-1997)、《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》（GB11607-1989)和權(quán)威機(jī)構(gòu)推薦的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中已作出了 規(guī)定，未受明顯油污染的開(kāi)放性大洋海水中，石油烴濃度一般小于l〇yg/L。在受污染海域 的海水中，油濃度可達(dá)nX10~nX102yg/L水平（n〈10,下同）；在嚴(yán)重污染的海域，曾有 12700yg/L的紀(jì)錄。一般而言，未受污染的海洋底質(zhì)的石油烴含量（干重）低于50mg/kg， 而受污染的底質(zhì)石油烴含量范圍較寬，一般為nX102~nX10 3mg/kg，某些海域底質(zhì)石油烴 含量甚至高達(dá)12000mg/kg。
[0005] 然而，海洋環(huán)境中的石油烴由于受物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)的作用，其各類組分會(huì) 隨時(shí)間發(fā)生不同程度的變化，主要特點(diǎn)包括：（1)正構(gòu)烷烴的半保留期較短，消失的速率較 快，脂環(huán)烴與其它飽和烴的比例隨油類風(fēng)化程度的加深而增高；（2)芳香烴化合物的降解 速度較慢，其在風(fēng)化油中所占比例隨風(fēng)化程度的加深而升高；（3)分子量較高的化合物比 分子量較低的同類化合物在海洋環(huán)境中滯留時(shí)間更長(zhǎng)，尤其是多環(huán)芳香烴化合物容易在底 質(zhì)中長(zhǎng)期積累。因此，海洋環(huán)境中已受風(fēng)化的油類就單位質(zhì)量而言，一般比未風(fēng)化的本油毒 性高。由此可見(jiàn)，應(yīng)用這些化學(xué)方法雖然能檢測(cè)石油烴的濃度，但是無(wú)法評(píng)價(jià)溢油污染物對(duì) 海洋生態(tài)系統(tǒng)的損害程度以及生態(tài)系統(tǒng)對(duì)溢油污染物的響應(yīng)變化。
[0006] 近年來(lái)，生物標(biāo)志物（biomarker或biologicalmarker)檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)被廣泛地 應(yīng)用于不同國(guó)家和地區(qū)的海洋環(huán)境污染的監(jiān)測(cè)中。生物標(biāo)志物是指能夠描述或表征生物機(jī) 體所產(chǎn)生的各種變化的標(biāo)志物或指標(biāo)。通過(guò)研宄生物標(biāo)志物的變化與污染物的劑量效應(yīng) 關(guān)系，可以揭示污染物對(duì)環(huán)境生物的致毒機(jī)理和其對(duì)生態(tài)環(huán)境的損害程度。全球海洋觀測(cè) 系統(tǒng)沿岸海洋觀測(cè)模塊綜合戰(zhàn)略設(shè)計(jì)方案（Theintegrated，strategicdesignplanfor thecoastaloceanobservationsmoduleofglobaloceanobservingsystem,GOOS) 中以生物標(biāo)志物為基礎(chǔ)制訂了評(píng)價(jià)污染物和環(huán)境壓力的海洋污染快速評(píng)價(jià)技術(shù)（rapid assessmentofmarinepollution，RAMP)，用以評(píng)價(jià)由污水和化學(xué)污染物排放而引起的海 洋環(huán)境污染以及由于沿岸開(kāi)墾、旅游和海洋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展而帶來(lái)的環(huán)境壓力。該設(shè)計(jì)方案在 1997年巴西沿岸海域成功實(shí)施的基礎(chǔ)上，確定進(jìn)一步評(píng)價(jià)的污染物有多環(huán)芳香烴、多氯聯(lián) 苯以及有機(jī)氯等污染物。我國(guó)目前尚未建立基于生物標(biāo)志物的溢油污染檢測(cè)和評(píng)價(jià)體系。 因此，針對(duì)目前溢油事故頻繁發(fā)生和溢油污染日益加劇的趨勢(shì)，非常有必要建立一種有效 的檢測(cè)溢油污染物和評(píng)價(jià)溢油污染環(huán)境影響的技術(shù)手段和標(biāo)準(zhǔn)體系，以服務(wù)于我國(guó)的海洋 開(kāi)發(fā)與管理。
[0007] 目前，被廣泛應(yīng)用于海洋污染檢測(cè)的生物標(biāo)志物有DNA加合物、DNA完整性、細(xì)胞 色素4501A、金屬硫因蛋白、乙酰膽堿酯酶和抗氧化防御系統(tǒng)等，主要的原理是以海洋動(dòng)物 如低棲魚(yú)類、腹足綱軟體動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)材料，分析生物體內(nèi)各種酶活性的變化特征，評(píng)價(jià)污染 海域的溢油污染。然而，石油烴在海洋動(dòng)物體中的行為特點(diǎn)隨石油烴組分不同而表現(xiàn)出不 同，正構(gòu)烷烴的半保留期比同碳數(shù)的支鏈烷烴和芳香烴化合物短；同系列的石油烴化臺(tái)物， 其在生物體中的半保留期隨分子量的增大而延長(zhǎng)；分子量較高、毒性較大的芳香烴化合物， 動(dòng)物體中某些脂類的特殊"隔離艙"，很難被釋放或代謝。上述行為特點(diǎn)使得積累在海洋動(dòng) 物體中毒性較大的石油烴組分的比率高于海洋環(huán)境中本源油組分。并且，現(xiàn)有這些技術(shù)以 低棲魚(yú)類、腹足綱軟體動(dòng)物為主要的被檢測(cè)物，在樣品采集中存在個(gè)體差異，生物體內(nèi)酶反 應(yīng)的復(fù)雜性，導(dǎo)致建立其對(duì)應(yīng)關(guān)系有一定的困難，缺乏相關(guān)性分析的模型。此外，常見(jiàn)的酶 學(xué)反應(yīng)檢測(cè)底物主要是多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯等污染物，其在動(dòng)物體內(nèi)存在特殊的"隔離艙"， 也會(huì)影響分析結(jié)果的客觀性。溢油污染物往往是烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴和硫化物的混合物， 只以一種或兩種污染物評(píng)估環(huán)境污染有所偏差。
[0008] 因此，有必要建立能夠全局性指示環(huán)境污染變化的廣譜性生物材料，并且使其在 不同海況自然條件下，均能夠準(zhǔn)確檢測(cè)溢油污染物產(chǎn)生的環(huán)境影響，人工修復(fù)效果等，這是 目前海洋溢油污染評(píng)價(jià)所需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明主要是為解決上述現(xiàn)有石油污染生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)技術(shù)無(wú)法全面準(zhǔn)確評(píng)價(jià)溢 油污染物對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)的損害程度以及生態(tài)系統(tǒng)對(duì)溢油污染物的響應(yīng)變化的問(wèn)題，提供 一種基于宏基因技術(shù)的石油污染海洋生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)方法，以宏基因組技術(shù)為依托，以微生 物區(qū)系結(jié)構(gòu)的變化、數(shù)量的改變客觀反映污染物對(duì)環(huán)境生物全局性的影響，合理評(píng)價(jià)環(huán)境 污染、生態(tài)修復(fù)的長(zhǎng)期效應(yīng)。
[0010] 具體而言，本發(fā)明提供了一種基于宏基因技術(shù)的石油污染海洋生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)方 法，該方法包括步驟：
[0011] (1)采集海水樣品：
[0012] (2)對(duì)樣品進(jìn)行宏基因組DNA的提取并測(cè)序；
[0013] (3)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行有效序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和優(yōu)化序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；
[0014] (4)使用mothur及chopseq軟件進(jìn)行OTU-based分析；
[0015] (5)進(jìn)行Alpha-diversity分析，該分析過(guò)程包括對(duì)菌群豐度、菌群多樣性、測(cè)序 覆蓋率進(jìn)行分析；并進(jìn)行稀釋性曲線分析；
[0016] (6)進(jìn)行分類學(xué)分析和群落結(jié)構(gòu)分析；
[0017] (7)進(jìn)行Heatmap聚類分析，獲得樣品微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)和種群數(shù)量參數(shù)值，用于評(píng) 價(jià)不同樣品中污染相似度及危害性。
[0018] 本發(fā)明的基于宏基因技術(shù)的石油污染海洋生態(tài)環(huán)境評(píng)價(jià)方法中，應(yīng)用基于高通量 測(cè)序（HighThroughputSequencing)的宏基因組技術(shù)對(duì)