一種苜蓿腐霉根腐病菌特異性檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開(kāi)了一種苜蓿腐霉根腐病菌特異性檢測(cè)試劑盒，包括盒體、位于盒體內(nèi)的蓋膜、襯墊。其中，盒蓋與盒體通過(guò)盒蓋卡頭與盒體卡槽密封。盒體內(nèi)的襯墊上具有若干個(gè)固定模具形成的下凹瓶位和酶標(biāo)板卡槽。所述的下凹瓶位用于放置裝有溶液的試劑瓶；所述的酶標(biāo)板卡槽的大小與酶標(biāo)板的尺寸相匹配，酶標(biāo)板為48孔或者96孔聚苯乙烯試劑板。所述的蓋膜位于酶標(biāo)板的上方。該方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、便捷的優(yōu)點(diǎn)，可以滿足口岸實(shí)驗(yàn)室對(duì)該病菌快速檢測(cè)的需求，適合在口岸植物檢疫實(shí)驗(yàn)室推廣使用。
【專利說(shuō)明】
一種苜蓿腐霉根腐病菌特異性檢測(cè)試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于植物病原物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種苜蓿腐霉根腐病菌特異性檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]紫花苜蓿屬豆科、苜蓿屬多年生草本植物，是我國(guó)乃至世界上種植數(shù)量最大的牧草品種。由于其適應(yīng)性廣、產(chǎn)量高、品質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)，素有“牧草之王”的美稱。苜蓿根腐病是導(dǎo)致紫花苜蓿產(chǎn)量損失的主要病害之一。紫花苜蓿感病品種最多導(dǎo)致產(chǎn)量損失68%。此病病原為苜蓿疫霉根腐病菌(Phytophthora medicaginis)。隨著我國(guó)畜牧業(yè)的快速發(fā)展，每年天津口岸都進(jìn)口多批次苜蓿干草及苜蓿種子，該病菌一旦傳入，為害非常嚴(yán)重，而檢疫是防止該病菌在我國(guó)定植、傳播最經(jīng)濟(jì)、最有效的方法。準(zhǔn)確、快速、有效的檢測(cè)方法是實(shí)現(xiàn)有效檢疫的技術(shù)基礎(chǔ)。
[0003]目前，針對(duì)苜蓿疫霉根腐病菌的快速檢測(cè)方法有普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法。但是，這兩種PCR方法對(duì)儀器設(shè)備都有著較高的要求，需要使用昂貴的PCR儀，使用成本較高，不利于基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本實(shí)用新型提供一種苜蓿腐霉根腐病菌特異性檢測(cè)試劑盒，是一種新型的檢測(cè)方法，利用生物素和親和素均可偶聯(lián)抗原、抗體等生物大分子，同時(shí)也可偶聯(lián)酶、熒光素、膠體金、乳膠等示蹤物質(zhì)，同時(shí)生物素、親和素之間具有高度親和力和放大作用的特點(diǎn)，能夠在免疫反應(yīng)中起到信號(hào)放大作用，能夠提高反應(yīng)的靈敏度和特異性而被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)產(chǎn)品的試劑盒開(kāi)發(fā)。
[0005]該方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、便捷的優(yōu)點(diǎn)，可以滿足口岸實(shí)驗(yàn)室對(duì)該病菌快速檢測(cè)的需求，適合在口岸植物檢疫實(shí)驗(yàn)室推廣使用。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型提供一種苜蓿腐霉根腐病菌特異性檢測(cè)試劑盒，包括盒體、位于盒體內(nèi)的蓋膜、襯墊。其中，盒蓋與盒體通過(guò)盒蓋卡頭與盒體卡槽密封。盒體內(nèi)的襯墊上具有若干個(gè)固定模具形成的下凹瓶位和酶標(biāo)板卡槽。所述的下凹瓶位用于放置裝有溶液的試劑瓶;所述的酶標(biāo)板卡槽的大小與酶標(biāo)板的尺寸相匹配，酶標(biāo)板為48孔或者96孔聚苯乙烯試劑板。所述的蓋膜位于酶標(biāo)板的上方。優(yōu)選地，所述的酶標(biāo)板真空密封于鋁箔袋內(nèi)。
[0007]所述盒體內(nèi)的襯墊還設(shè)有分隔試劑槽，所述分隔試劑槽分隔各試劑瓶。
[0008]試劑盒包括有I瓶裝有苜蓿疫霉根腐病菌單克隆抗體工作液的試劑瓶，I瓶裝有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液的試劑瓶，1-4瓶裝有苜蓿疫霉根腐病菌標(biāo)準(zhǔn)液的試劑瓶，1-3瓶裝有底物顯色液的試劑瓶，1-2瓶裝有終止液的試劑瓶，1-2瓶裝有洗滌液的試劑瓶，1-2瓶裝有緩沖液的試劑瓶。
[0009]試劑盒的試劑瓶?jī)?nèi)的具體成分如下:
[0010](I)苜蓿疫霉根腐病菌單克隆抗體工作液I瓶/7ml;
[0011](2)苜蓿疫霉根腐病菌標(biāo)準(zhǔn)品溶液lml/瓶，濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5yg/L、13.5yg/L、40.5yg/L；
[0012](3)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液7ml /瓶；
[O 013 ] (4)底物顯色液，分別為底物顯色A液，底物顯色B液，底物顯色液A液為過(guò)氧化脲7ml/瓶，底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺7ml/瓶；
[0014](5)終止液 7ml/瓶；
[0015](6)緩沖液50ml /瓶，為含有I %甲醇、0.01-0.05mo 1/L磷酸鹽緩沖液。使用時(shí)2倍稀釋。
[0016](7)洗滌液40ml/瓶，為含有0.8 % -1.2 %吐溫-20,0.5%疊氮化鈉、0.0 lmol/L磷酸鹽緩沖液。使用時(shí)20倍稀釋。
[0017]優(yōu)選地，利用不同顏色或者大小的試劑瓶對(duì)裝有不同試劑的試劑瓶進(jìn)行區(qū)分，例如，所述裝有苜蓿疫霉根腐病菌單克隆抗體工作液的試劑瓶為黃色瓶帽的棕色塑料瓶，裝有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液的試劑瓶為粉色瓶帽的棕色塑料瓶，所述裝有苜蓿疫霉根腐病菌標(biāo)準(zhǔn)液的試劑瓶為綠色瓶帽的白色塑料瓶，所述裝有底物顯色液的試劑瓶為白色瓶帽的棕色玻璃瓶，所述裝有終止液的試劑瓶為藍(lán)色瓶帽的半透明塑料瓶，所述裝有洗滌液的試劑瓶為透明瓶帽的半透明塑料瓶，所述裝有緩沖液的試劑瓶為紅色瓶帽的黑色塑料瓶。這樣，所需試劑用不同顏色的試劑瓶封裝在盒體內(nèi)，易于快速區(qū)分。
[0018]本實(shí)用新型的有益效果是:提供一種苜蓿疫霉特異性檢測(cè)試劑盒，提高產(chǎn)品靈敏度和反應(yīng)特異性，該方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、便捷的優(yōu)點(diǎn)，可以滿足口岸實(shí)驗(yàn)室對(duì)該病菌快速檢測(cè)的需求，適合在口岸植物檢疫實(shí)驗(yàn)室推廣使用。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為本實(shí)用新型的俯視圖；
[0020]圖2為本實(shí)用新型酶標(biāo)板的俯視圖；
[0021 ]圖3為本實(shí)用新型襯墊的俯視圖；
[0022]圖中:1、盒蓋;2、盒體;3、酶標(biāo)板;4、蓋膜;5、襯墊;6、試劑瓶;7、分隔試劑槽
[0023]101、盒蓋卡頭；201、盒體卡槽；301、酶標(biāo)板外框支架；302、酶標(biāo)反應(yīng)微孔；501?504、下凹瓶位;505、酶標(biāo)板卡槽。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0025]圖1所示苜蓿疫霉特異性檢測(cè)試劑盒，包括盒體和包被有抗原的酶標(biāo)板。盒體內(nèi)的襯墊上具有若干個(gè)固定模具形成的下凹瓶位和酶標(biāo)板卡槽。所述的下凹瓶位用于放置裝有溶液的試劑瓶;所述試劑瓶包括:裝有苜蓿疫霉根腐病菌標(biāo)準(zhǔn)液的試劑瓶，裝有底物顯色液的試劑瓶，裝有終止液的試劑瓶，裝有洗滌液的試劑瓶，裝有緩沖液的試劑瓶。
[0026]所述的酶標(biāo)板卡槽的大小與酶標(biāo)板的尺寸相匹配，酶標(biāo)板為48孔或者96孔聚苯乙烯試劑板。
[0027]所述的蓋膜位于酶標(biāo)板的上方。
[0028]所述的酶標(biāo)板真空密封于鋁箔袋內(nèi)。
[0029]所述盒體內(nèi)的襯墊還設(shè)有分隔試劑槽，所述分隔試劑槽分隔各試劑瓶。
[0030]如圖2所示酶標(biāo)板2為設(shè)置有96個(gè)反應(yīng)孔的可拆卸微孔板。
[0031 ]試劑盒的試劑瓶?jī)?nèi)的具體成分如下:
[0032](I)苜蓿疫霉根腐病菌單克隆抗體工作液I瓶/7ml;
[0033](2)苜蓿疫霉根腐病菌標(biāo)準(zhǔn)品溶液lml/瓶，濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5yg/L、13.5yg/L、40.5yg/L；
[0034](3)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液7ml/瓶；
[0035](4)底物顯色液，分別為底物顯色A液，底物顯色B液，底物顯色液A液為過(guò)氧化脲7ml/瓶，底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺7ml/瓶；
[0036](5)終止液 7ml/瓶；
[0037](6)緩沖液50ml /瓶，為含有I %甲醇、0.01-0.05mo 1/L磷酸鹽緩沖液。使用時(shí)2倍稀釋。
[0038](7)洗滌液40ml/瓶，為含有0.8 % -1.2 %吐溫-20,0.5%疊氮化鈉、0.0 lmol/L磷酸鹽緩沖液。使用時(shí)20倍稀釋。
[0039]本實(shí)用新型的檢測(cè)過(guò)程:
[0040]I)樣品前處理:樣本要求如下:
[0041 ]操作時(shí)應(yīng)按照微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則進(jìn)行。
[0042]如果不能立即檢測(cè)，3天以內(nèi)的樣本可以4度保存，如果放置-20度至少保存3個(gè)月。
[0043]測(cè)試前將冷凍保存的樣本慢慢恢復(fù)至室溫后混勻使用，避免樣本反復(fù)凍融。
[0044]2)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立:向酶標(biāo)板中每孔先加入10yL試劑盒所提供8個(gè)系列的苜蓿疫霉根腐病菌標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入50yL稀釋后的酶標(biāo)抗體，酶標(biāo)抗體的稀釋度1:80K，在25°C溫育15分鐘，加入300μ!7孔的洗滌液，靜置2分鐘后拍干，重復(fù)用洗滌液洗滌5次后，每孔加入發(fā)光液ISOyL，5分鐘后在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)。以所得標(biāo)準(zhǔn)溶液的發(fā)光值，除以最低濃度對(duì)應(yīng)的發(fā)光值再乘以100，得到抑制率，以抑制率為縱坐標(biāo)，以苜蓿疫霉根腐病菌濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0045]3)待測(cè)樣品的檢測(cè)分析:向酶標(biāo)板中每孔先加入處理好的待測(cè)樣品，再加入50yL稀釋后的酶標(biāo)抗體，酶標(biāo)抗體的稀釋度1:80K，在25°C下溫育15分鐘，用洗滌液洗滌5次后，每孔加入發(fā)光液180yL，5分鐘后在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上檢測(cè)。以加入待測(cè)樣品的發(fā)光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算待測(cè)樣品中苜蓿疫霉根腐病菌的含量。
[0046]本實(shí)用新型的有益效果在于:本實(shí)用新型將具有高度靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，操作簡(jiǎn)便，用時(shí)短，無(wú)需長(zhǎng)時(shí)間顯色及終止，且靈敏度高，特異性好，能快速、簡(jiǎn)便、靈敏地用于苜蓿疫霉根腐病菌的檢測(cè)。該試劑盒可檢出的最低檢測(cè)限為0.0125ng/mL，可一次性進(jìn)行多個(gè)樣本的測(cè)定，減少檢測(cè)樣本所需要的時(shí)間。本實(shí)用新型具有節(jié)約成本、操作簡(jiǎn)便快速、可在非實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行、便于攜帶和運(yùn)輸?shù)奶攸c(diǎn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種苜蓿腐霉根腐病菌特異性檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括盒體、位于盒體內(nèi)的蓋膜、襯墊;其中，盒蓋與盒體通過(guò)盒蓋卡頭與盒體卡槽密封;盒體內(nèi)的襯墊上具有若干個(gè)固定模具形成的下凹瓶位和酶標(biāo)板卡槽;所述的下凹瓶位用于放置裝有溶液的試劑瓶;所述的酶標(biāo)板卡槽的大小與酶標(biāo)板的尺寸相匹配，酶標(biāo)板為48孔或者96孔聚苯乙烯試劑板;所述的蓋膜位于酶標(biāo)板的上方。2.如權(quán)利要求1所述的一種苜蓿腐霉根腐病菌特異性檢測(cè)試劑盒，所述的酶標(biāo)板真空密封于鋁箔袋內(nèi)。3.如權(quán)利要求1所述的一種苜蓿腐霉根腐病菌特異性檢測(cè)試劑盒，所述盒體內(nèi)的襯墊還設(shè)有分隔試劑槽，所述分隔試劑槽分隔各試劑瓶。4.如權(quán)利要求1所述的一種苜蓿腐霉根腐病菌特異性檢測(cè)試劑盒，所述試劑瓶包括:I瓶裝有苜蓿疫霉根腐病菌單克隆抗體工作液的試劑瓶，I瓶裝有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液的試劑瓶，1-4瓶裝有苜蓿疫霉根腐病菌標(biāo)準(zhǔn)液的試劑瓶，1-3瓶裝有底物顯色液的試劑瓶，1-2瓶裝有終止液的試劑瓶，1-2瓶裝有洗滌液的試劑瓶，1-2瓶裝有緩沖液的試劑瓶。5.如權(quán)利要求4所述的一種苜蓿腐霉根腐病菌特異性檢測(cè)試劑盒，所述裝有苜蓿疫霉根腐病菌單克隆抗體工作液的試劑瓶為黃色瓶帽的棕色塑料瓶，裝有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液的試劑瓶為粉色瓶帽的棕色塑料瓶，所述裝有苜蓿疫霉根腐病菌標(biāo)準(zhǔn)液的試劑瓶為綠色瓶帽的白色塑料瓶，所述裝有底物顯色液的試劑瓶為白色瓶帽的棕色玻璃瓶，所述裝有終止液的試劑瓶為藍(lán)色瓶帽的半透明塑料瓶，所述裝有洗滌液的試劑瓶為透明瓶帽的半透明塑料瓶，所述裝有緩沖液的試劑瓶為紅色瓶帽的黑色塑料瓶。6.如權(quán)利要求4所述的一種苜蓿腐霉根腐病菌特異性檢測(cè)試劑盒，所述裝有苜蓿疫霉根腐病菌單克隆抗體工作液的試劑瓶的規(guī)格為7ml/瓶，裝有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液的試劑瓶的規(guī)格為7ml /瓶，裝有苜蓿疫霉根腐病菌標(biāo)準(zhǔn)液的試劑瓶的規(guī)格為Iml/瓶，濃度分別為0yg/L、0.5yg/L、1.5yg/L、4.5yg/L、13.5yg/L、40.5yg/L;裝有底物顯色液的試劑瓶的規(guī)格為7ml/瓶，裝有終止液的試劑瓶的規(guī)格為7ml/瓶，裝有洗滌液的試劑瓶的規(guī)格為40ml/瓶，裝有緩沖液的試劑瓶的規(guī)格為50ml/瓶。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK205484362SQ201620179836
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年3月9日
【發(fā)明人】鄭春生, 高文娜, 邊勇
【申請(qǐng)人】中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局