一種同時(shí)分析煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的色譜檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種同時(shí)分析煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的色譜檢測(cè)方法，包括以下步驟：A、煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的提取；B、煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的衍生化；C、煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的衍生化產(chǎn)物色譜分析。D、煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的定量分析。本發(fā)明建立的一種微波輔助提取?乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯衍生?超高效液相色譜?紫外檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定煙草中的銨離子、25種氨基酸與8種生物胺的方法，具有簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度且穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可以提高樣品檢測(cè)通量與數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種同時(shí)分析煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的色譜檢測(cè) 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的同時(shí)分析煙草中銨離子、氨基酸及生物胺的色 譜檢測(cè)方法，屬于煙草化學(xué)成分的測(cè)定方法技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 銨離子是植物能夠直接利用的氮源，是合成煙草重要含氮化合物-蛋白質(zhì)、氨基 酸、生物堿、核苷酸等的重要原料之一，盡管硝態(tài)氮也能被植物直接吸收，但不能夠直接利 用。硝態(tài)氮進(jìn)入植物體后，必須經(jīng)過(guò)硝酸還原酶與亞硝酸還原酶轉(zhuǎn)化為銨離子后才能進(jìn)入 代謝合成途徑，從而被植物利用并真正發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)元素的作用。
[0003] 氨基酸是一類(lèi)帶有氨基(-NH2)或亞氨基(-NH)的有機(jī)酸的總稱(chēng)，是細(xì)胞的重要組 成部分，在植物生命活動(dòng)中擔(dān)負(fù)著各種生理作用。氨基酸主要通過(guò)以下方式對(duì)植物產(chǎn)生影 響，如水分生理中的作用、光呼吸氮代謝中的作用、花粉生理中的作用、衰老中的作用、細(xì)胞 生長(zhǎng)的作用與解毒作用等。此外，氨基酸的含量與煙草的品質(zhì)也有著密切的關(guān)系，其含量的 高低直接影響到煙的味道和煙氣的豐滿(mǎn)度，在煙葉的烘烤、陳化、調(diào)制及抽吸過(guò)程中均會(huì)與 煙葉中的還原糖發(fā)生梅拉德反應(yīng)而形成多種重要的致香成分，故煙葉中氨基酸種類(lèi)的多少 和含量的高低會(huì)直接影響煙葉的內(nèi)在品質(zhì)。
[0004] 生物胺是一類(lèi)含氮的低分子量有機(jī)化合物的總稱(chēng)。根據(jù)其組成成分可以分為單胺 與多胺。生物胺在煙草生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的作用。例如一些生物胺通過(guò)生物 學(xué)作用可以生成激素、核酸和蛋白質(zhì)的前提物。多胺可以刺激生長(zhǎng)，延緩衰老的作用，在植 物逆境抵抗體系的構(gòu)建中起重要的推動(dòng)作用。此外，多胺也是合成煙堿的重要前體物之一， 多胺中的腐胺經(jīng)過(guò)腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶形成N-甲基腐胺，進(jìn)一步由腐胺N-甲基氧化酶氧化得 到N-甲基氨基丁醛，N-甲基氨基丁醛自發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣蔁焿A所必須的吡咯烷環(huán)，從而與煙酸 反應(yīng)形成煙堿。
[0005] 銨離子進(jìn)入根部細(xì)胞質(zhì)后可很快地與代謝過(guò)程產(chǎn)生的有機(jī)酸結(jié)合形成氨基酸與 酰胺，并且釋放質(zhì)子以補(bǔ)償電荷。如果植物中存在過(guò)量的銨離子，植物就會(huì)產(chǎn)生銨中毒，氨 基酸中的谷氨酰胺與天冬酰胺可以通過(guò)GS和G0GAT酶合成對(duì)應(yīng)的谷氨酰胺與天冬酰胺，從 而緩解植物的銨中毒反應(yīng)。生物胺都是通過(guò)對(duì)應(yīng)氨基酸的脫羧基化后形成，例如合成煙堿 的重要前提物多胺(腐胺)有二條合成途徑，一條為精氨酸脫羧酶，另一條為鳥(niǎo)氨酸途徑， 其關(guān)鍵酶分別為精氨酸脫羧酶與是鳥(niǎo)氨酸脫羧酶。因此，銨離子、氨基酸及生物胺之間有這 密切的聯(lián)系，具體表現(xiàn)為銨離子為初始階段，氨基酸為中間階段，最后階段為生物胺。因此， 對(duì)這三類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行同時(shí)定性與定量尤為重要。
[0006] 由于氨基酸與生物胺類(lèi)物質(zhì)極性強(qiáng)，揮發(fā)性差，且未有紫外吸收的生色團(tuán)等特性， 采用直接檢測(cè)法存在峰形不對(duì)稱(chēng)、靈敏度低，選擇性不強(qiáng)等缺陷，而銨離子是無(wú)機(jī)離子，常 常需要離子色譜才能進(jìn)行分析，但離子色譜無(wú)法同時(shí)對(duì)氨基酸與多胺進(jìn)行分析。因此，目前 對(duì)這三類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)主要為柱前衍生化方法，衍生方法主要有氣相衍生與液相衍生。其中 氣相衍生化主要為硅烷化與乙?；磻?yīng)，這2種反應(yīng)都需要在嚴(yán)格無(wú)水的條件下進(jìn)行，且衍 生化產(chǎn)物穩(wěn)定性也較差。此外，氨基酸硅烷化的重復(fù)性較差，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在20%左右。液相 衍生化主要是將生色團(tuán)引入到未有紫外吸收的物質(zhì)結(jié)構(gòu)中，從而使其有紫外吸收或發(fā)出熒 光。主要的液相衍生試劑有鄰苯二甲醛、諱三酮、氯甲酸-9-芴甲酯、6-氨基喹啉基-N-羥基 琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯與異硫氰酸苯酯等，但這些衍生試劑都存在衍生反應(yīng)慢，衍生產(chǎn) 物穩(wěn)定性差，且價(jià)格較昂貴等缺陷。
[0007] 綜上所述，在煙草化學(xué)成分的測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域中，目前還沒(méi)有一套簡(jiǎn)單、快速、高靈 敏度且穩(wěn)定性好的關(guān)于煙葉中銨離子、氨基酸及多胺類(lèi)物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種能夠同時(shí)分析煙葉中銨離子、氨基酸及生 物胺的色譜檢測(cè)方法，該方法具有簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度且穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可以提高樣品 檢測(cè)通量與數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性；另外，三類(lèi)物質(zhì)的同時(shí)分析，也大大降低了分析工作量，可以有效 的克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種同時(shí)分析煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的色譜檢測(cè) 方法，包括以下步驟： A、 煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的提取:稱(chēng)取烤煙粉末或鮮煙葉于離心管中，然后加 入兩種內(nèi)標(biāo)溶液，再加入1.8 mL提取溶液進(jìn)行微波輔助提取，離心后，上層清液過(guò)水系濾膜 得濾液； B、 煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的衍生化:取步驟A中濾液1 mL于離心管中，加入8.5 此3 M氫氧化鈉溶液，禍旋后加入1 mL緩沖溶液、0.3 mL有機(jī)溶劑與30 yL衍生化試劑，禍 旋混勻后進(jìn)行超聲衍生化，反應(yīng)后加入60 yL 3 M的氫氧化鈉溶液，混勻后放入水浴中除去 過(guò)量的衍生化試劑，反應(yīng)后冷卻，過(guò)有機(jī)濾膜后于色譜瓶中； C、 煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的衍生化產(chǎn)物色譜分析:采用超高效液相色譜-光電 二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行色譜分析； D、 煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的定量分析:對(duì)有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物進(jìn)行絕對(duì)定量，對(duì) 未有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物進(jìn)行相對(duì)定量。
[0010] 所述步驟A中微波輔助提取的條件為微波能量800 W、提取時(shí)間40 S。
[0011]所述步驟A中兩種內(nèi)標(biāo)為1 mg/mL的氨基己二酸和1 mg/mL的正繳氨酸。
[0012] 所述步驟A中提取溶液為0.1%的甲酸水溶液。
[0013] 所述步驟B中緩沖溶液是pH為9.0-9.2的0.8 M硼酸緩沖液。
[0014]所述步驟B中有機(jī)溶劑為甲醇或已腈。
[0015]所述步驟B中衍生化試劑為乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯。
[0016] 所述步驟B中水浴條件為80°C水浴50 min。
[0017]所述步驟C中超高效液相色譜使用的流動(dòng)相為25 mM乙酸銨與已腈，利用梯度洗脫 方式進(jìn)行分離。
[0018]本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明建立了一種微波輔助提取-乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯衍生-超高效液相色譜-紫外檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定煙草中的銨離子、25種氨基酸與8種生物胺的方法。本發(fā)明為了獲得最 大的提取效率，對(duì)微波輔助提取采用了析因設(shè)計(jì)和Doehlert設(shè)計(jì)進(jìn)行方法優(yōu)化，與現(xiàn)有技 術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1)微波輔助提取大大減少了提取時(shí)間，從40-60 min減少到40 s;2)乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯衍生化試劑價(jià)格便宜，可以同時(shí)衍生化氨基與亞氨基，反 應(yīng)簡(jiǎn)單且副產(chǎn)物較少，衍生化產(chǎn)物檢測(cè)靈敏度高且穩(wěn)定;3)能同時(shí)分析三類(lèi)物質(zhì)(銨離子、 25種氨基酸與8種生物胺），大大降低了分析工作量;4)具有簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度且穩(wěn)定性 好的特點(diǎn)，可以有效提高樣品檢測(cè)通量與數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1煙葉中銨離子、25種氨基酸及8種生物胺的檢測(cè)方法流程圖； 圖2煙葉中銨離子、23種氨基酸及5種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)品衍生化產(chǎn)物UPLC-PDA色譜圖 (280 nm)； 圖3煙葉中銨離子、25種氨基酸及8種生物胺的煙葉樣品衍生化產(chǎn)物UPLC-PDA色譜圖 (280 nm)。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例1: 參考圖1，本發(fā)明檢測(cè)方法包括以下步驟： (1) 稱(chēng)取烤煙粉末100 mg或鮮煙葉50 mg(凍干樣品）于離心管中，然后加入40 yL內(nèi)標(biāo) (氨基己二酸-1 mg/mL;正纈氨酸-1 mg/mL)，再加入1.8 mL 0.1%的甲酸水溶液進(jìn)行微波 (800 W)輔助提取40 s，3000 rpm離心5 min后，上層清液過(guò)0.45 ym水系濾膜； (2) 取1 mL上層濾液于離心管中，加入8.5 yL 3 M氫氧化鈉溶液，渦旋后加入1 mL 0.8 M硼酸緩沖液(pH=9.0-9.2)，再加入0.3 mL甲醇或已腈及30 uL的乙氧基亞甲基丙二酸二乙 酯，渦旋1 min后常溫超聲35 min反應(yīng)。反應(yīng)完成后加入60 yL 3 M的氫氧化鈉溶液，渦旋后 加入80°C的水浴中50 min除去過(guò)量的衍生化試劑，反應(yīng)后冷卻，過(guò)有機(jī)濾膜后于色譜瓶中。 [0021] (3)將衍生化產(chǎn)物進(jìn)行超高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)器分析。Acquity UPLC ?超高效液相色譜儀配PDA檢測(cè)器，色譜柱為Acquity UPLC HSS T3色譜柱，（2.1 mm X 100 mm, 1.8 _，），柱溫40 °C，進(jìn)樣量為1.0此，流動(dòng)相B為超純水(含25 mM乙酸銨），A 為乙腈，流速為0.35 mL/min，梯度洗脫如下表1所示。PDA同時(shí)監(jiān)測(cè)292、268與280 nm分別定 量分析脯氨酸與哌啶酸、銨尚子及其它氨基酸與多胺類(lèi)物質(zhì)，總分析時(shí)間42 min，其中標(biāo)樣 色譜圖與樣品色譜圖如圖2與3所示。
[0022]表1液相色譜梯度洗脫步驟

(4)對(duì)未有標(biāo)準(zhǔn)品的5種化合物，分別為哌啶酸、正亮氨酸、酪胺、色胺和苯乙胺進(jìn)行相 對(duì)定量，采用內(nèi)標(biāo)按照校正因子F=1相對(duì)定量。對(duì)有標(biāo)準(zhǔn)品的29種化合物，分別為氯化銨、 精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、蛋氨酸、苯 丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、氨基丁 酸、鳥(niǎo)氨酸、瓜氨酸、色氨酸、硫酸胍基丁胺、腐胺，尸胺、亞精胺、精胺進(jìn)行絕對(duì)定量。利用氨 基己二酸內(nèi)標(biāo)法定量lOmin之前化合物(包括L-精氨酸之前的化合物），正纈氨酸內(nèi)標(biāo)法定 量lOmin之后化合物(包括Y -氨基丁酸之后的化合物）。
[0023] (5)配制相應(yīng)濃度的母液，將母液混合并用超純水稀釋成5個(gè)濃度梯度的混合標(biāo)樣 (由于多胺標(biāo)準(zhǔn)品中可能存在銨離子與氨基酸，因此，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分為三個(gè)，第一個(gè)為銨 離子、第二個(gè)為23種氨基酸，第三個(gè)為5種生物胺），按照(2)與（3)的條件進(jìn)行衍生化與色譜 分析(標(biāo)樣色譜圖如圖2所示），以目標(biāo)化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比為縱坐標(biāo)(y)，目 標(biāo)化合物的量與內(nèi)標(biāo)量(40 yg)的比值為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程及相關(guān)參 數(shù)，將最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液按照信噪比為3(S/N=3)計(jì)算方法的最低檢測(cè)限(LOD)，同時(shí)向煙 葉中添加兩個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行提取，衍生化與色譜分析，計(jì)算其回收率?；厥章?為添加后樣品的氨基酸含量減去空白樣品氨基酸的含量除以添加的氨基酸含量，添加濃度 分別大約為空白樣品中含量的1/2與1倍添加進(jìn)行，方法的精密度為將低濃度與高濃度添加 在同一天內(nèi)重復(fù)5次，為其日內(nèi)精密度，同一樣品在5天內(nèi)重復(fù)5次為日間精密度。樣品氨基 酸衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性測(cè)試在常溫條件下1 d、2 d、3 d、5 d及7 d后的峰面積變化，得到 對(duì)應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如表2與3所示。
[0024] 表2主要氨基酸的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、線(xiàn)性范圍、L0D及線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)

結(jié)果表明：銨離子、氨基酸及多胺類(lèi)物質(zhì)的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)都大于0.999,只有尸胺為 0.9986,表明方法的線(xiàn)性較好。通過(guò)優(yōu)化甲醇的加入量，提高了氨基酸的檢測(cè)靈敏度，所有 氨基酸的LOD都小于0. lyg/mL，只有色氨酸與精氨酸為0.12與0.18yg/mL。氨基酸的回收率 在85.8 %-111.5 %之間，回收率良好，日內(nèi)與日間精密度范圍分別在0.48-6.12 %與0.56-6.88 %之間，符合嚴(yán)格的定量要求。衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性結(jié)果表明：衍生化產(chǎn)物常溫7d內(nèi)RSD 小于4.12%，穩(wěn)定性較好，能較好的對(duì)氨基酸進(jìn)行定量分析。未有標(biāo)準(zhǔn)品的哌啶酸、正亮氨 酸、酪胺、色胺和苯乙胺5種物質(zhì)，保留時(shí)間分別為14.05、19.50、28.19、30.19與30.621^11， 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)都為y = x，衍生化產(chǎn)物常溫7d內(nèi)RSD分別為3.98 %、3.56 %、1.56%、2.43 %與 3.11%〇
[0025] 實(shí)施例2: 為了比較煙葉烘烤過(guò)程中銨離子、氨基酸及多胺類(lèi)物質(zhì)的變化，采用如實(shí)施例1的方法 分別對(duì)烤前鮮煙葉與烤后煙葉進(jìn)行分析。樣品品種為K326,在煙株第12葉位(從下往上數(shù)） 成熟采烤前取樣，采用半葉法將葉片從主脈分開(kāi)，一半立即放入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室采用真 空冷凍干燥；另一半帶主脈正常烘烤。每個(gè)重復(fù)取8片混合，共5個(gè)重復(fù)。為避免烘烤前后煙 葉樣品水分含量不同，將烘烤后的煙葉樣品去主脈，置40°C恒溫烘箱中烘至恒重，煙葉粉碎 后過(guò)80目篩并低溫密封保存。采用散葉密集烘烤的方式進(jìn)行烘烤。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4,從檢測(cè) 結(jié)果可知，銨離子、氨基酸及多胺類(lèi)物質(zhì)烘烤前后的變化差異明顯，銨離子顯著增加有5倍 多，生物胺類(lèi)物質(zhì)都表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，其中腐胺、色胺、苯乙胺、亞精胺與精胺減少有2倍以 上，氨基酸類(lèi)物質(zhì)一部分表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，另一部分表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，下降趨勢(shì)的氨基酸為 天冬氨酸、谷氨酸、Y _氨基丁酸、酪氨酸、蛋氨酸、正亮氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、鳥(niǎo)氨酸和賴(lài) 氨酸，其中天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、蛋氨酸和亮氨酸減少有2倍以上;上升趨勢(shì)的氨基酸 為天門(mén)冬酰胺、絲氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、甘氨酸、瓜氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨 酸、哌啶酸、纈氨酸、色氨酸及苯丙氨酸。其中天門(mén)冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、甘氨酸、瓜氨 酸、丙氨酸、脯氨酸、哌啶酸、色氨酸及苯丙氨酸增加有2倍以上。
[0026] 表4 K326煙葉烘烤過(guò)程中銨離子、氨基酸及多胺類(lèi)物質(zhì)的變化規(guī)律
aND，未檢測(cè)到，丨表示含量升高，丨表示含量降低，雙箭頭表示含量變化2倍及以上 結(jié)果表明：采用本發(fā)明的檢測(cè)方法可快速、準(zhǔn)確的得出煙葉中銨離子、25種氨基酸及8 種生物胺在烤前和烤后的變化規(guī)律。
[0027]以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種同時(shí)分析煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的色譜檢測(cè)方法，其特征在于，包括以 下步驟： A、 煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的提取:稱(chēng)取烤煙粉末或鮮煙葉于離心管中，然后加 入兩種內(nèi)標(biāo)溶液，再加入1.8 mL提取溶液進(jìn)行微波輔助提取，離心后，上層清液過(guò)水系濾膜 得濾液； B、 煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的衍生化:取步驟A中濾液1 mL于離心管中，加入8.5 yL 3 Μ氫氧化鈉溶液，禍旋后加入1 mL緩沖溶液、0.3 mL有機(jī)溶劑與30 yL衍生化試劑，禍 旋混勻后進(jìn)行超聲衍生化，反應(yīng)后加入60 yL 3 Μ的氫氧化鈉溶液，混勻后放入水浴中除去 過(guò)量的衍生化試劑，反應(yīng)后冷卻，過(guò)有機(jī)濾膜后于色譜瓶中； C、 煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的衍生化產(chǎn)物色譜分析:采用超高效液相色譜-光電 二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行色譜分析； D、 煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的定量分析:對(duì)有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物進(jìn)行絕對(duì)定量，對(duì) 未有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物進(jìn)行相對(duì)定量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)分析煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的色譜檢測(cè)方法，其 特征在于:所述步驟Α中微波輔助提取的條件為微波能量800 W、提取時(shí)間40 s。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)分析煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的色譜檢測(cè)方法，其 特征在于:所述步驟A中兩種內(nèi)標(biāo)為1 mg/mL的氨基己二酸和1 mg/mL的正纈氨酸。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)分析煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的色譜檢測(cè)方法，其 特征在于:所述步驟A中提取溶液為0.1%的甲酸水溶液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)分析煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的色譜檢測(cè)方法，其 特征在于:所述步驟B中緩沖溶液是pH為9.0-9.2的0.8 Μ硼酸緩沖液。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)分析煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的色譜檢測(cè)方法，其 特征在于:所述步驟Β中有機(jī)溶劑為甲醇或已腈。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)分析煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的色譜檢測(cè)方法，其 特征在于:所述步驟Β中衍生化試劑為乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)分析煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的色譜檢測(cè)方法，其 特征在于:所述步驟Β中水浴條件為80 °C水浴50 min。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)分析煙葉中銨離子、氨基酸及生物胺的色譜檢測(cè)方法，其 特征在于:所述步驟C中超高效液相色譜使用的流動(dòng)相為25 mM乙酸銨與已腈，利用梯度洗 脫方式進(jìn)行分離。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK106053674SQ201610623775
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年8月3日
【發(fā)明人】蔡凱, 趙會(huì)納, 向章敏, 蔡斌, 雷波, 潘文杰, 高維常
【申請(qǐng)人】貴州省煙草科學(xué)研究院