一種糧食樣品中硒形態(tài)的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種糧食樣品中硒形態(tài)的測定方法，包括如下步驟：1）檢測的前期準(zhǔn)備；2）糧食樣品硒形態(tài)的提??；3）建立HPLC-HGAFS聯(lián)用技術(shù)；4）上機(jī)測試與結(jié)果計(jì)算。該方法成本低，操作簡便，提取效率高，可同時準(zhǔn)確測定硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亞硒酸鈉（Na2SeO4）、硒代蛋氨酸（SeMet）和硒酸鈉（Na2SeO4）五種硒形態(tài)和含量。
【專利說明】
一種糧食樣品中砸形態(tài)的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種糧食樣品中硒形態(tài)的測定方法，屬于分析化學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 硒是人體必須的微量元素之一，是谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px)的組成成分，具 有清除體內(nèi)自由基、抗細(xì)胞脂膜過氧化、抗衰老、抗癌防癌、拮抗重金屬毒性等生物學(xué)功能。 硒缺乏會導(dǎo)致克山病、白肌病、地方性癌癥等疾病的發(fā)病率增高。我國有2/3的地區(qū)缺硒， 其中1/3地方嚴(yán)重缺硒。根據(jù)我國13省份普查顯示，人均每日硒攝入量僅為36微克，低于 世界衛(wèi)生組織推薦的日常攝入量50微克的標(biāo)準(zhǔn)，也達(dá)不到中國營養(yǎng)學(xué)院建議的50-200微 克的攝入量，我國居民普遍缺硒。提高我國居民的日常硒攝入量，對于改善國民健康有重大 意義。
[0003] 但是，科學(xué)、合理地補(bǔ)硒不但要提高人體攝入硒的總量，也要關(guān)注人體對于硒的可 吸收利用性。研究表明，不同形態(tài)硒的吸收利用性、安全性有較大差異。無機(jī)硒的吸收效果 和安全性遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及有機(jī)硒。
[0004] 我國居民的膳食結(jié)構(gòu)以植物性食品為主，且植物性食品也是居民攝入硒的主要來 源。因此，測定植物中的硒形態(tài)，對于指導(dǎo)居民科學(xué)補(bǔ)硒，開發(fā)安全高效的富硒食品，具有指 導(dǎo)意義。
[0005] 目前，測試主要硒形態(tài)的主要技術(shù)為氣相色譜（GC)、電泳（CE)高效液相色譜 (HPLC)等與HGAFS (高壓液相色譜一氫化物發(fā)生原子熒光分析)、ICP-MS (電感耦合等離 子體質(zhì)譜）聯(lián)用技術(shù)。但是GC對于硒代氨基酸和硒代蛋白等非揮發(fā)性的硒化物的檢測 存在較多的困難；CE在與ICP-MS聯(lián)用時，所需流速不同，限制其發(fā)展應(yīng)用；現(xiàn)在主要采用 HPLC技術(shù)。如：富硒植物材料中硒形態(tài)的測定方法（中國專利申請?zhí)?01110428248. 4)中 利用HPLC-HGAFS檢測富硒植物中硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys )、 硒代蛋氨酸（SeMet)和亞硒酸鈉（Na2Se04)四種硒態(tài)。但由于所用試劑的差異，該方法無 法檢測出硒的六價形態(tài)。植物硒形態(tài)的檢測方法（中國專利申請?zhí)?01210215457. 5)中 采用HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)分析植物樣品中的硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸 (1〇36〇5^)、硒代蛋氨酸（36161:)、亞硒酸鈉（似 236〇4)和硒酸鈉（似236〇4)五種硒態(tài)。水 產(chǎn)品中硒形態(tài)的檢測方法（中國專利申請?zhí)?01310376921. 3)利用HPLC-HGAFS聯(lián)用技術(shù) 分析水產(chǎn)品中的硒代胱氨酸（SeCys2)、硒代蛋氨酸（SeMet)、亞硒酸鈉（Na 2Se04)和硒酸鈉 (Na2Se04)四種硒態(tài)，該方法主要用于對水產(chǎn)品中硒形態(tài)的測定，沒有探討對糧食樣品中硒 形態(tài)測定的適用性。但是，目前ICP-MS價格昂貴，檢測成本高，不易推廣；而采用HGAFS技 術(shù)的方法檢測硒形態(tài)種類又不完善，并且這些方法中都沒有提到樣品中硒的提取率，有可 能檢出硒僅為樣品中總硒的少部分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種成本相對較低、硒形態(tài)種類檢測完備且操 作簡便、提取效率高的糧食樣品中硒形態(tài)的測定方法。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 本發(fā)明所述糧食樣品中硒形態(tài)的測定方法，包括如下步驟： 1)檢測的前期準(zhǔn)備： i) 設(shè)備：HPLC-HGAFS (型號為 LC20AB-SAP-10-AFS9230,色譜柱 Hamilton PRP-X100)、 天平、粉碎機(jī)、烘箱、超聲清洗器(型號KQ-610)、搖床、離心機(jī)； ii) 試劑：Tris-HCl、蛋白酶K、蛋白酶XIV、纖維素酶、KI、NaOH、NaBH4、鹽酸、甲酸、 (ΝΗ4) 2ΗΡ04、硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys)、硒代蛋氨酸（SeMet)、亞硒 酸鈉（Na 2Se04)和硒酸鈉（Na2Se04)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、18. 2 ΜΩ水。
[0008] 2)糧食樣品砸形態(tài)的提?。?i) 稱取供干、粉碎、過篩后的糧食樣品，加入100 mmol/L Tris-HCl進(jìn)彳丁提取，超聲； ii) 提取后，加入纖維素酶對糧食樣品進(jìn)行破壁處理，恒溫振蕩； iii) 依次加入蛋白酶K、蛋白酶XIV進(jìn)行水解提取，恒溫振蕩，在4°C下，10000轉(zhuǎn)/分， 離心30 min，上清液過0. 22 μ m濾膜，得到待測溶液。
[0009] 3)建立HPLC-HGAFS (高壓液相色譜一氫化物發(fā)生原子熒光分析）聯(lián)用技術(shù)： i) 儀器條件：流動相（40 mmol/L(NH4)2HP04, pH 6. 0);流速 1 mL/min ;進(jìn)樣體積 100 μ L ;蠕動栗轉(zhuǎn)速65 rpm ;燈電流/輔陰極：100mA，45mA ;光電倍增管負(fù)高壓：300V ;載氣流 速：300mL/min ;屏蔽氣流速：700mL/min ; ii) 氫化物發(fā)生條件：還原劑成分：〇. 35wt%Na0H+l. 2wt%NaBH4，流速：6 mL/min ;氧化劑 成分：0· 5wt% NaOH+lwt% KI，流速：6 mL/min ;載流：10wt% HC1，流速：6 mL/min ； iii) 配制硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸（1636〇}^)、亞硒酸鈉（似236〇 4)、硒 代蛋氨酸（SeMet)和硒酸鈉（Na2Se04)混標(biāo)，建立五種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。
[0010] 4)上機(jī)測試與結(jié)果計(jì)算： 樣品中待測物硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys)、亞硒酸鈉 (Na2Se04)、硒代蛋氨酸（SeMet)和硒酸鈉（Na2Se0 4)的含量可由下式計(jì)算得： X=CXVXF/m 式中： X-樣品中待測物質(zhì)的含量，yg/kg; C一待測液中該物質(zhì)的濃度，μ g/L; V一測定液體總體積，mL ; F-稀釋倍數(shù)； m-稱樣質(zhì)量，g。
[0011] 作為優(yōu)選方案，其中所述步驟2)中，稱取樣品質(zhì)量為0. 1-0. 2 g。
[0012] 作為優(yōu)選方案，其中所述步驟2)中，樣品與提取液Tris-HCl的固液比為1 : 25-1:100。
[0013] 作為優(yōu)選方案，其中所述步驟2)中，超聲提取時間為10-30 min，超聲功率600 W， 超聲頻率40 KHZ。
[0014] 作為優(yōu)選方案，其中所述步驟2)中，纖維素酶與糧食樣品的質(zhì)量比為1:1-1:10， 破壁處理溫度控制在40-55°C，振蕩轉(zhuǎn)速150-200 rpm，振蕩時間30 min-2 h。
[0015] 作為優(yōu)選方案，其中所述步驟2)中，蛋白酶K與糧食樣品的質(zhì)量比為1 :20-1:100， 水解溫度控制在40-55°C，振蕩轉(zhuǎn)速150-200 rpm，振蕩時間4 h-12 h。
[0016] 作為優(yōu)選方案，其中所述步驟2)中，蛋白酶XIV與糧食樣品的質(zhì)量比為 1:20-1:100,水解溫度控制在30-45°C，振蕩轉(zhuǎn)速150-200 rpm，振蕩時間4 h-12 h。
[0017] 作為優(yōu)選方案，其中所述糧食樣品為小麥或玉米。
[0018] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果： 1、 采用超聲提取，結(jié)合多種酶，硒的提取效率高，提取率可達(dá)80%以上，且酶用量少，節(jié) 約成本，提取過程操作簡便，易于重復(fù)； 2、 相較于現(xiàn)有方法，可以同時準(zhǔn)確測定硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸 (MeSeCys)、亞硒酸鈉（Na 2Se04)、硒代蛋氨酸（SeMet)和硒酸鈉（Na2Se04)五種硒形態(tài)和含 量，且其最低檢出限相當(dāng)?shù)汀?br>【附圖說明】
[0019] 圖1為各種硒形態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)分離譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0021] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不能用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí) 施條件可以根據(jù)具體條件作進(jìn)一步調(diào)整，未說明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。
[0022] 實(shí)例1 :小麥中硒形態(tài)的測定 1)檢測的前期準(zhǔn)備： i) 設(shè)備：HPLC-HGAFS (型號為 LC20AB-SAP-10-AFS9230,色譜柱 Hamilton PRP-X100)、 天平、粉碎機(jī)、烘箱、超聲清洗器(型號KQ-610)、搖床、離心機(jī)； ii) 試劑：Tris-HCl、蛋白酶K、蛋白酶XIV、纖維素酶、KI、NaOH、NaBH4、鹽酸、甲酸、 (ΝΗ 4) 2ΗΡ04、硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys)、硒代蛋氨酸（SeMet)、亞硒 酸鈉（Na 2Se04)和硒酸鈉（Na2Se04)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、18. 2 ΜΩ 7K，酶和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均采購于Sigma公 司。
[0023] 2)小麥硒形態(tài)的提?。?i) 稱取烘干、粉碎、過100目篩后的〇.2g小麥粉于15 mL塑料離心管中，加入5 mL提 取緩沖液100 mm〇l/L Tris-HCl，超聲提取20 min，超聲功率600 W，超聲頻率40 KHZ; ii) 加入纖維素酶40 mg，50°C，恒溫振蕩培養(yǎng)lh，振蕩轉(zhuǎn)速為180 rpm ; iii) 加入0.5 mg蛋白酶K，50°C，恒溫振蕩培養(yǎng)8 h，振蕩轉(zhuǎn)速為180 rpm，再加入0.5 mg蛋白酶XIV，37°C，恒溫振蕩培養(yǎng)8 h，振蕩轉(zhuǎn)速為180 rpm，然后在4°C下，10000轉(zhuǎn)/ 分，離心30 min，上清液過0. 22 μ m的濾膜后，制備得到上機(jī)待測液； 3)建立HPLC-HGAFS (高壓液相色譜一氫化物發(fā)生原子熒光分析）聯(lián)用技術(shù)： i)將液相色譜設(shè)置為流動相（40 mmol/L(NH4)2HP04, pH 6. 0);流速1 mL/min ;進(jìn)樣體 積100 μ L ;蠕動栗轉(zhuǎn)速65 rpm ;燈電流/輔陰極：100mA，45mA ;光電倍增管負(fù)高壓：300V ; 載氣流速：300mL/min ;屏蔽氣流速：700mL/min ;氫化物發(fā)生條件設(shè)置為：還原劑成分：0. 35 wt %NaOH+l. 2 wt %NaBH4,流速：6 mL/min ;氧化劑成分：0· 5wt% NaOH+lwt% KI，流速：6 mL/ min ;載流：10 wt % HC1，流速：6 mL/min ; ii)配制20、40、60、80、100 ng/g混標(biāo)，待儀器穩(wěn)定后，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，上機(jī)測定待測溶 液；在上述條件下硒代胱氨酸（SeCys2)、硒甲基半胱氨酸（MeSeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸 (SeMet)和 Se (VI)的保留時間依次為：2. 6 min，3. 2 min，4. 0 min，5. 0 min 和 12. 2 min ; 待測液色譜峰保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比變化范圍在±5%之內(nèi)即認(rèn)為其為該待測物質(zhì)；根 據(jù)檢測結(jié)果計(jì)算得到樣品中各種硒形態(tài)含量。
[0024] 結(jié)果分析： 1)圖1顯示標(biāo)準(zhǔn)溶液中五種硒形態(tài)的色譜圖，表明五種硒形態(tài)均能得到有效分離，且 峰形良好。
[0025] 2)儀器的檢出限及精密度，見表1。
[0026] 表1.儀器的檢出限及精密度的要求
從表1中可以看出，五種硒形態(tài)均具有良好的線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限，說明本發(fā) 明檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好和精確度高。
[0027] 3)小麥中硒形態(tài)的結(jié)果，見表2。
[0028] 表2.小麥中硒形態(tài)的測定結(jié)果
從表2中可以看出，小麥中的總硒含量為22. 3 ± 0.025 mg/kg，則小麥硒提取率為 92%。表明本發(fā)明硒的提取效率高。
[0029] 4)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表3。表3結(jié)果顯示，五種硒形態(tài)的加標(biāo)回收率在 91. 1-120%之間，回收效果理想。
[0030] 表3五種硒形態(tài)加標(biāo)回收率的測定結(jié)果
實(shí)例2 :玉米中硒形態(tài)的測定 1)檢測的前期準(zhǔn)備： i) 設(shè)備：HPLC-HGAFS (型號為 LC20AB-SAP-10-AFS9230,色譜柱 Hamilton PRP-X100)、 天平、粉碎機(jī)、烘箱、超聲清洗器(型號KQ-610)、搖床、離心機(jī)； ii) 試劑：Tris-HCl、蛋白酶K、蛋白酶XIV、纖維素酶、KI、NaOH、NaBH4、鹽酸、甲酸、 (ΝΗ4) 2ΗΡ04、硒代胱氨酸（SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys)、硒代蛋氨酸（SeMet)、亞硒 酸鈉（Na 2Se04)和硒酸鈉（Na2Se04)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、18. 2 ΜΩ 7K，酶和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均采購于Sigma公 司。
[0031] 2)玉米硒形態(tài)的提?。?i) 稱取烘干、粉碎、過100目篩后的〇.2g玉米粉于15 mL塑料離心管中，加入5 mL提 取緩沖液100 mm〇l/L Tris-HCl，超聲提取20 min，超聲功率600 W，超聲頻率40 KHZ; ii) 加入纖維素酶40 mg，50°C，恒溫振蕩培養(yǎng)lh，振蕩轉(zhuǎn)速為180 rpm ; iii) 加入0.5 mg蛋白酶K，50°C，恒溫振蕩培養(yǎng)8 h，振蕩轉(zhuǎn)速為180 rpm，再加入0.5 mg蛋白酶XIV，37°C，恒溫振蕩培養(yǎng)8 h，振蕩轉(zhuǎn)速為180 rpm，然后在4°C下，10000轉(zhuǎn)/ 分，離心30 min，上清液過0. 22 μ m的濾膜后，制備得到上機(jī)待測液； 3)建立HPLC-HGAFS (高壓液相色譜一氫化物發(fā)生原子熒光分析）聯(lián)用技術(shù)： i) 將液相色譜設(shè)置為流動相（40 mmol/L(NH4)2HP04, pH 6. 0);流速1 mL/min ;進(jìn)樣體 積100 μ L ;蠕動栗轉(zhuǎn)速65 rpm ;燈電流/輔陰極：100mA，45mA ;光電倍增管負(fù)高壓：300V ; 載氣流速：300mL/min ;屏蔽氣流速：700mL/min ;氫化物發(fā)生條件設(shè)置為：還原劑成分：0. 35 wt %NaOH+l. 2 wt %NaBH4,流速：6 mL/min ;氧化劑成分：0· 5wt% NaOH+lwt% KI，流速：6 mL/ min ;載流：10 wt % HC1，流速：6 mL/min ; ii) 配制20、40、60、80、100 ng/g混標(biāo)，待儀器穩(wěn)定后，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，上機(jī)測定待測溶 液；在上述條件下硒代胱氨酸（SeCys2)、硒甲基半胱氨酸（MeSeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸 (SeMet)和 Se (VI)的保留時間依次為：2. 6 min，3. 2 min，4. 0 min，5. 0 min 和 12. 2 min ; 待測液色譜峰保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比變化范圍在±5%之內(nèi)即認(rèn)為其為該待測物質(zhì)；根 據(jù)檢測結(jié)果計(jì)算得到樣品中各種硒形態(tài)含量。
[0032] 結(jié)果分析： 1)玉米中硒形態(tài)的測定結(jié)果，見表4。表4結(jié)果顯示，玉米中的總硒含量為12.81 土 1. 56 mg/kg，則硒的提取率為91%，表明本發(fā)明硒的提取效率高。
[0033] 表4.玉米中硒形態(tài)的測定結(jié)果
2)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表5。表5結(jié)果顯不，五種硒形態(tài)的加標(biāo)回收率在90-107. 4% 之間，回收效果理想。
[0034] 表5.五種硒形態(tài)加標(biāo)回收率的測定結(jié)果
上述實(shí)例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人能夠了 解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì) 所作的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種糧食樣品中硒形態(tài)的測定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： 1)糧食樣品砸形態(tài)的提?。? 1) 稱取供干、粉碎、過篩后的糧食樣品，加入100 mmol/L Tris-HCl進(jìn)彳丁超聲提取； ii) 提取后，加入纖維素酶對糧食樣品進(jìn)行破壁處理，恒溫振蕩； iii) 依次加入蛋白酶K、蛋白酶XIV進(jìn)行水解提取，恒溫振蕩，在4°C下，10000轉(zhuǎn)/分， 離心30 min，上清液過0. 22 μ m濾膜，得到待測溶液； 2) 建立HPLC-HGAFS聯(lián)用技術(shù)： i) 儀器條件：流動相：40 mmol/L(NH4)2HP04, pH 6. 0 ;流速 1 mL/min ;進(jìn)樣體積 100 μ L ;蠕動栗轉(zhuǎn)速65 rpm ;燈電流/輔陰極：100mA，45mA ;光電倍增管負(fù)高壓：300V ;載氣流 速：300mL/min ;屏蔽氣流速：700mL/min ; ii) 氫化物發(fā)生條件：還原劑成分：〇. 35wt%NaOH+l. 2wt%NaBH4，流速：6 mL/min ;氧化劑 成分：0· 5wt% NaOH+lwt% KI，流速：6 mL/min ;載流：10wt% HC1，流速：6 mL/min ； iii) 配制硒代胱氨酸SeCys2、甲基硒代半胱氨酸MeSeCys、亞硒酸鈉 Na2Se04J?代蛋氨 酸SeMet和硒酸鈉 Na2Se<Vg#，建立五種硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖； 3) 上機(jī)測試與結(jié)果計(jì)算： 樣品中待測物硒代胱氨酸SeCys2、甲基硒代半胱氨酸MeSeCys、亞硒酸鈉 Na2Se04、硒代 蛋氨酸SeMet和硒酸鈉 Na2Se04的含量由下式計(jì)算得： X=CXVXF/m 式中： X-樣品中待測物質(zhì)的含量，yg/kg; C一待測液中該物質(zhì)的濃度，μ g/L; V一測定液體總體積，mL ; F-稀釋倍數(shù)； m-稱樣質(zhì)量，g。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，稱取樣品的質(zhì)量為 0. 1-0. 2 g〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，樣品與提取液Tris-HCl 的固液比為1 :25-1:100。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，超聲提取時間為10-30 min，超聲功率為600 W，超聲頻率40 KHZ。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，纖維素酶與糧食樣品的質(zhì) 量比為1:1-1:10,破壁處理溫度控制在40-55°C，振蕩轉(zhuǎn)速150-200 rpm，振蕩時間30 min-2 h〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，蛋白酶K與糧食樣品的質(zhì) 量比為1:20-1:100，水解溫度控制在40-55°(：，振蕩轉(zhuǎn)速150-200印111，振蕩時間4 11-12 11。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，蛋白酶XIV與糧食樣品的 質(zhì)量比為1:20-1:100,水解溫度控制在30-45°C，振蕩轉(zhuǎn)速150-200 rpm，振蕩時間4 h-12 h〇8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述糧食樣品為小麥或玉米。
【文檔編號】G01N30/88GK106033081SQ201510113923
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年3月16日
【發(fā)明人】黃陽, 劉穎, 朱元元
【申請人】中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)蘇州研究院