羊耳菊藥材的多成分含量測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及藥物成份鑒別和質(zhì)量檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種測定羊耳菊藥材中 多種成分含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 羊耳菊為菊科植物羊耳菊Inula cappa(Buch.-Ham.ex D.Don)DC.的干燥全草， 具有疏風(fēng)散熱，解毒消腫功效，是貴州苗族常用藥材，苗語藥名為"Bex nioux dant"(近似 漢譯音為"白牛膽"），在《苗族醫(yī)藥學(xué)》、《中華本草·苗藥卷》、2003版《貴州省中藥、民族藥質(zhì) 量標(biāo)準(zhǔn)》中均有收載，貴州省W羊耳菊為原料研制的"屯神喉搏通顆粒"、"鼻康片"、"羊甘滴 丸"等各種苗藥制劑相繼上市銷售，療效顯著，創(chuàng)造了良好的社會經(jīng)濟(jì)效益。在俸族，羊耳菊 又名"納罕"，為俸醫(yī)名方"雅叫哈頓散"（收載于2010年版中國藥典一部)的主藥?！吨袊褡?藥志》記載:除苗族、俸族外，羊耳菊在我國壯、個(gè)、景頗、拉枯、傑傑、苗、彝、化等少數(shù)民族地 區(qū)均有豐富的藥用經(jīng)驗(yàn)，常用于感冒發(fā)熱，咽喉腫痛，風(fēng)濕疼痛，癡瘡療毒，乳癡等癥，有獨(dú) 特療效。但羊耳菊基礎(chǔ)研究薄弱一直是亟待解決的技術(shù)問題，特別是羊耳菊的質(zhì)量控制水 平低，很難保證羊耳菊及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量和療效。
[0003] 近年來對羊耳菊的化學(xué)成分研究報(bào)道較多，其主要成分有酪類、倍半祗類、有機(jī)酸 類、黃酬類和揮發(fā)油類等，但目前關(guān)于羊耳菊的質(zhì)量研究卻較少?！顿F州省中藥、民族藥質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)》中尚未收載羊耳菊的含量測定項(xiàng)目，經(jīng)文獻(xiàn)查閱，也僅有羊耳菊單一成分及總黃酬測 定，不能全面反映其內(nèi)在質(zhì)量?，F(xiàn)有技術(shù)表明，羊耳菊中東賞窘巧、1,3-0-二咖啡酷基奎寧 酸、木犀草巧，3，4-0-二咖啡酷基奎寧酸、3，5-0-二咖啡酷基奎寧酸和4，5-0-二咖啡酷基奎 寧酸等六種成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化及抗病毒等藥理作用，因此，建立羊耳菊中上述6 個(gè)成分的含量測定方法能夠?yàn)橛行Э刂蒲蚨盏膬?nèi)在質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了更加全面的鑒別和控制羊耳菊藥材的質(zhì)量，提供一種采用 UPLC-MS/MS法測定羊耳菊藥材中六種成分的方法，W測定出羊耳菊中羊耳菊中東賞窘巧、 1，3-0-二咖啡酷基奎寧酸、木犀草巧，3，4-0-二咖啡酷基奎寧酸、3，5-0-二咖啡酷基奎寧酸 和4,5-0-二咖啡酷基奎寧酸等六種成分含量。
[0005] 基于上述目的，本發(fā)明是運(yùn)樣一種羊耳菊藥材的多成分含量測定方法，該方法包 括采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)同時(shí)測定羊耳菊藥材中東賞窘巧、1,3-0-二 咖啡酷基奎寧酸、木犀草巧、3，4-0-二咖啡酷基奎寧酸、3，5-0-二咖啡酷基奎寧酸、4，5-0- 二咖啡酷基奎寧酸6個(gè)成分的含量的步驟，在超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析中包括W葛根 素為內(nèi)標(biāo)。
[0006] 在超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析中采用Waters邸Η C18(2.1 mmXlOO mm，1.7 μ m)色譜柱。
[0007] 在超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析中采用0.1%甲酸乙臘(A)-O.l%甲酸水(B)為流動(dòng) 相進(jìn)行梯度洗脫。該梯度洗脫的程序如下：ο~1.0 min,5%~15%(A); 1.0~3.8 min, 15%~18% (A);3.8~4.0min，18%~90%(A);4.0~5.0min，90%~5%(A)。
[000引在超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析中包括還包括電噴霧電離源(ESI)，W多反應(yīng)離 子監(jiān)測(MRM)檢測的步驟。它的質(zhì)譜條件是：采用電噴霧電離源化SI)，毛細(xì)管電離電壓3 kV，離子源溫度120 °C ;去溶劑氣化，流速650 L/h，去溶劑氣溫度350 °C，離子源溫度120 °C ;碰撞氣Ar，流速0.16 mL/min;掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)。
[0009] 該方法中，內(nèi)標(biāo)溶液的制備方法如下:精密稱取葛根素，用甲醇定容，獲得葛根素 的儲備液;取內(nèi)標(biāo)儲備液適量至容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20 pg/mL的內(nèi)標(biāo)溶 液，冷凍保存?zhèn)溆谩?br>[0010] 供試品溶液制備方法如下：取羊耳菊細(xì)粉約l.OOOOg，精密稱定，置圓底燒瓶中， 加入25%乙醇25血，稱定重量(精確至0.0 lg)，加熱回流提取2 h，放冷，再稱定重量，用提取 液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，精密吸取續(xù)濾液5 mL于蒸發(fā)皿，揮干溶劑;殘余物轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45皿)濾過，取續(xù)濾液，即得； 對照品溶液制備方法如下：：分別精密稱取東賞窘巧等6種對照品，各置10 mL容量瓶 中，加甲醇定容至刻度處，搖勻；得東賞窘巧（0.504 mg/mL)、l ,3-0-二咖啡酷基奎寧酸 (1.037 mg/mL)、木犀草巧(0.856 mg/mL)、3,4-0-二咖啡酷基奎寧酸（1.007 mg/mL)、3,5- 0-二咖啡酷基奎寧酸(0.502 mg/mL)、4，5-0-二咖啡酷基奎寧酸（1.073 mg/mL)的儲備液。
[0011] UPLC-MS/MS專屬性強(qiáng)，靈敏度高，快速準(zhǔn)確，越來越多地應(yīng)用于中藥材質(zhì)量控制等 各方面的研究中，因此本發(fā)明應(yīng)用UPLC-MS/MS，W葛根素為內(nèi)標(biāo)，建立羊耳菊中6個(gè)成分的 含量測定方法，國內(nèi)外未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，為有效控制羊耳菊的內(nèi)在質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。
[0012] 本發(fā)明中，WLC使用1.7皿顆粒度的色譜柱填料，能顯著提高分離的效率，WLC- MS/MS法在不影響分離效果的情況下大大提高了樣品中各成分的分析速度。本發(fā)明首次建 立了羊耳菊藥材的多指標(biāo)成分含量測定方法，且采用UPLC-MS/MS法，在6 min內(nèi)即可同時(shí) 準(zhǔn)確測定羊耳菊中6個(gè)成分的含量，為羊耳菊的質(zhì)量控制提供了一種快速靈敏、穩(wěn)定可靠的 新方法。
[0013 ] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中考察了 W甲醇、無水乙醇、25%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和水 為提取溶劑，分別用索氏提取、回流提取和超聲處理，W及不同時(shí)間對羊耳菊進(jìn)行提取，對 測定結(jié)果綜合分析后，最后采用25%乙醇加熱回流提取2 h，6種成分的提取效率較好。
【附圖說明】
[0014] 圖1是混合對照品溶液(A)和供試品溶液(B)的UPLC-MS/MS圖譜；其中：1.東賞窘 巧，2.葛根素，3. 1,3-0-二咖啡酷基奎寧酸，4.木犀草巧，5. 3,4-0-二咖啡酷基奎寧酸， 6. 3,4-0-二咖啡酷基奎寧酸，7. 4,5-0-二咖啡酷基奎寧酸。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 為了更加清楚的對本發(fā)明進(jìn)行說明，W下通過具體實(shí)施實(shí)例對本發(fā)明的具體實(shí)施 方式進(jìn)行更為詳細(xì)的說明。但是應(yīng)該理解，W下所述具體實(shí)施實(shí)例僅用于本發(fā)明進(jìn)行示例 性說明，而非用于本發(fā)明進(jìn)行任何性質(zhì)限定，其中所用材料、試劑、儀器及操作條件僅為代 表性的，其并不限于所列舉的情況。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通過閱讀W下說明可W對本 發(fā)明做出不脫離本發(fā)明權(quán)利要求所限定的保護(hù)范圍的改動(dòng)和改進(jìn)，運(yùn)些改動(dòng)和改進(jìn)也處于 本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍內(nèi)。
[0016] 1儀器與試藥 1.1儀器 ACQUITY系統(tǒng)超高效液相色譜-Ξ重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，包括二元梯度累、自動(dòng)進(jìn)樣器、 柱溫箱、Ξ重四級桿質(zhì)量分析器和Masslynx4.1質(zhì)譜工作站(美國waters公司）。
[0017] 1.2 試藥 東賞窘巧對照品（批號13061442，純度含98%)由上海同田生物技術(shù)有限公司提供；1， 3-0-二咖啡酷基奎寧酸、3,4-0-二咖啡酷基奎寧酸、3,5-0-二咖啡酷基奎寧酸、4,5-二-0- 咖啡酷基奎寧酸對照品（均由中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中屯、提供，批號分別為 1384-101215、1384-101215、5：34-110121、1384-101215、純度>98〇/〇);葛根素和木犀草巧對 照品（均由中國食品藥品檢定研究院提供，批號分別為111-090623、111720-200602純度> 98%);甲醇（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）、乙臘(德國Merck公司）、甲酸（美國TEDIA有限 公司）為色譜純;其他試劑均為分析純，水為超純水。羊耳菊藥材:共6批樣品，來源于貴州高 坡、龍里及羅甸等地，由貴陽醫(yī)學(xué)院龍慶德副教授鑒定為菊科植物羊耳菊Inula cappa (Buch.-Ham. ex D. Don) DC.的干燥全草。
[001引 2方法與結(jié)果 2.1溶液配制 對照品溶液:分別精密稱取東賞窘巧等6種對照品，各置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至 刻度處，搖勻。得東賞窘巧(0.504 mg/mL)、1，3-0-二咖啡酷基奎寧酸（1.037 mg/mL)、木犀 草巧(0.856 mg/血）、3,4-0-二咖啡酷基奎寧酸（1.007 mg/血）、3,5-0-二咖啡酷基奎寧酸 (0.502 mg/mL)、4,5-0-二咖啡酷基奎寧酸（1.073 mg/mL)的儲備液。
[0019] 內(nèi)標(biāo)溶液:精密稱取葛根素（1.148 mg)，用甲醇定容至10血。獲得葛根素(0.1148 mg/mL)的儲備液。取內(nèi)標(biāo)儲備液適量至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20 pg/ mL的內(nèi)標(biāo)溶液，置冰箱(-20 °C)保存，備用。
[0020] 供試品溶液:取羊耳菊細(xì)粉約l.OOOOg，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入25%乙醇25 mL，稱定重量(精確至0.0 lg)，加熱回流提取2 h，放冷，再稱定重量，用提取液補(bǔ)足減失的重 量，搖勻，過濾，精密吸取續(xù)濾液