一種基于害蟲特定氣味受體篩選高效驅(qū)避劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及害蟲防治領(lǐng)域中篩選害蟲驅(qū)避劑的方法，特別是涉及一種基于蚜蟲特 定氣味受體篩選高效驅(qū)避劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蚜蟲為刺吸式口器害蟲，通過直接吸食植物汁液和傳播植物病毒對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)生嚴(yán) 重的危害。長期以來，蚜蟲的防治一直以化學(xué)防治為主，蚜蟲對(duì)有機(jī)氯、有機(jī)磷、氨基甲酸 酯、擬除蟲菊酯、新煙堿類等多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗性。另外，蚜蟲具有保守的報(bào)警機(jī)制，當(dāng)其 遭受到天敵捕食或寄生等危險(xiǎn)時(shí)，會(huì)從腹部后側(cè)的腹管釋放對(duì)周圍其它個(gè)體有報(bào)警作用的 小液滴，這種甘油三酯小液滴中含有蚜蟲報(bào)警信息素的主要成分。蚜蟲的報(bào)警信息素易揮 發(fā)，附近的其它個(gè)體感知后會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的趨避行為，如:逃離這株植物或直接從植物上掉 落。
[0003] 使用氣相色譜質(zhì)譜儀分析23種蚜蟲被碾碎后釋放的報(bào)警信息素主要成分，結(jié)果顯 示，16種蚜蟲被碾碎后釋放的報(bào)警信息素的唯一或主要成分為(反)-β_法尼烯，5種蚜蟲被 碾碎后釋放的報(bào)警信息素中含有少量(反)-β_法尼烯，2種蚜蟲被碾碎后釋放的報(bào)警信息素 中無(反)-β_法尼烯。（反)-β_法尼烯作為豌豆蚜和棉蚜報(bào)警信息素的唯一成分，在其它各 種蚜蟲保守的報(bào)警機(jī)制中也起到了重要的作用。
[0004] 利用蚜蟲保守的報(bào)警機(jī)制來防治蚜蟲可減緩化學(xué)防治對(duì)環(huán)境的污染和蚜蟲抗藥 性的產(chǎn)生，但由于蚜蟲自身釋放的(反)-β_法尼烯氣味分子在空氣容易被氧化，將其直接應(yīng) 用發(fā)展為控制蚜蟲的驅(qū)避劑有一定的難度，因此篩選得到其它高效且穩(wěn)定的驅(qū)避劑補(bǔ)充 (反)-β_法尼烯因氧化而損失的趨避效果或者直接替代(反)-β_法尼烯應(yīng)用于蚜蟲防治使 其產(chǎn)生趨避的行為反應(yīng)，在利用驅(qū)避劑進(jìn)行害蟲防治的過程中是必要的。因此，尋找簡便可 行的篩選高效驅(qū)避劑的方法也具有重要意義。
[0005] 參與昆蟲感知外界氣味分子的蛋白種類有很多，其中氣味受體是其中重要的一 類。特定的氣味分子會(huì)激活特定的氣味受體，進(jìn)而昆蟲會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的行為。昆蟲能夠通過特 定的氣味受體感知對(duì)其有趨避作用的氣味分子，從而做出相應(yīng)的趨避行為反應(yīng)。因此，利用 已知能對(duì)姐蟲產(chǎn)生趨避行為的（反)-β_法尼稀篩選得到能夠感知此氣味的特定氣味受體， 然后再利用該特定氣味受體，篩選能夠激活該特定氣味受體的其它氣味，作為對(duì)昆蟲可能 存在趨避效應(yīng)的候選驅(qū)避劑，因此尋找這樣一種可行的篩選昆蟲驅(qū)避劑的方法，將可以實(shí) 現(xiàn)環(huán)境友好，經(jīng)濟(jì)有效的綠色防止途徑來控制害蟲的危害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種基于蚜蟲特定氣味受體篩選高效驅(qū)避劑的方法，利用生物信息學(xué) 軟件進(jìn)一步分析已預(yù)測得到的豌豆蚜和棉蚜的氣味受體，利用氨基酸一致性比對(duì)篩選可感 知報(bào)警信息素(反)-β_法尼烯的候選特定氣味受體，通過爪蟾卵母細(xì)胞異源表達(dá)系統(tǒng)，應(yīng)用 雙電極電壓鉗技術(shù)篩選能夠被(反)-β_法尼烯激活的特定氣味受體;然后利用RNA干擾技術(shù) 將篩選得到的氣味受體在豌豆蚜體內(nèi)進(jìn)行基因沉默，結(jié)合豌豆蚜行為學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所得到的 該氣味受體為感知(反)-β-法尼稀的特定氣味受體。
[0007] 一種基于害蟲特定氣味受體篩選高效驅(qū)避劑的方法，包括如下步驟，
[0008] ①利用在所述害蟲的同物種基因組中預(yù)測得到的氣味受體序列，利用氨基酸一致 性比對(duì)結(jié)果進(jìn)行排序，選取高同源性的氣味受體為候選特定氣味受體，克隆得到候選特定 氣味受體的全長序列，
[0009] ②在爪蟾卵母細(xì)胞異源表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，
[0010] ③使用雙電極電壓鉗技術(shù)篩選對(duì)所述害蟲的報(bào)警信息素或趨避性氣味氣體成分 有反應(yīng)的特定氣味受體，
[0011] ④使用雙電極電壓鉗技術(shù)篩選可激活害蟲特定氣味受體的氣味物質(zhì)。
[0012] 所述害蟲為蚜蟲。
[0013] 所述害蟲的同物種為豌豆蚜和棉蚜，所述報(bào)警信息素成分為(反)-β-法尼烯。
[0014] 所述步驟③中篩選得到的豌豆蚜氣味受體Apis0R5和棉蚜氣味受體Agos0R5。
[0015] 所述方法還包括步驟⑤，所述步驟⑤為通過Y型管行為學(xué)實(shí)驗(yàn)并計(jì)算趨避強(qiáng)度來 檢測驅(qū)避劑的趨避強(qiáng)度，同時(shí)篩選到最佳的可激活害蟲特定氣味受體的氣味物質(zhì)。
[0016] 所述害蟲為蚜蟲，所述氣味物質(zhì)為乙酸香葉酯。
[0017] 所述方法還包括步驟③后對(duì)篩選到的特定氣味受體的驗(yàn)證步驟。
[0018] 所述驗(yàn)證步驟包括通過RNA干擾技術(shù)對(duì)該受體基因進(jìn)行害蟲體內(nèi)沉默和/或利用Y 型管行為學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該篩選到的特定氣味受體為所述害蟲的報(bào)警信息素成分的特定氣味 受體。
[0019] 本發(fā)明以選定的特定氣味受體，Apis0R5和Agos0R5為例，利用爪蟾卵母細(xì)胞異源 表達(dá)系統(tǒng)結(jié)合雙電極電壓鉗技術(shù)篩選能夠激活該受體的氣味，然后通過豌豆蚜和棉蚜Y型 管行為學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證上述篩選得到的氣味對(duì)蚜蟲的趨避效應(yīng)。該方法為篩選新的昆蟲驅(qū)避劑 提供了新的技術(shù)手段和平臺(tái)，為有效防治蚜蟲，乃至其它害蟲提供了新的技術(shù)資源和環(huán)境 友好的新的方法。
[0020] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)是：
[0021] 1.本發(fā)明中篩選得到特定氣味受體可作為標(biāo)準(zhǔn)，利用同源性，可找到其它種類蚜 蟲中的(反)-β_法尼烯的特定氣味受體。
[0022] 2.本發(fā)明具有普適性，可應(yīng)用于大規(guī)模篩選蚜蟲的驅(qū)避劑。
[0023] 3.本發(fā)明可定量比較蚜蟲驅(qū)避劑的趨避強(qiáng)度。
[0024] 本發(fā)明方法雖然是基于蚜蟲驅(qū)避劑的篩選，但可適用于任意害蟲驅(qū)避劑的篩選。
【附圖說明】
[0025] 圖1為豌豆蚜和棉蚜候選特定氣味受體同源樹，
[0026] 圖2為Apis0R5/0rco和Apis0R5/0rco共表達(dá)的爪蟾卵母細(xì)胞對(duì)(反)-β-法尼烯刺 激的反應(yīng)圖;Α為Apis0R5/0rco和Apis0R5/0rco共表達(dá)的爪蟾卵母細(xì)胞對(duì)(反)-β-法尼稀刺 激的反應(yīng)軌跡圖；Β為Apis0R5/0rco和Apis0R5/0rco共表達(dá)的爪蟾卵母細(xì)胞對(duì)(反)-β-法尼 烯刺激的反應(yīng)電流值圖，
[0027] 圖3為Apis0R5/0rco和Apis0R5/0rco共表達(dá)的爪蟾卵母細(xì)胞對(duì)梯度濃度(反)-β- 法尼烯刺激的反應(yīng)軌跡圖，
[0028] 圖4為Apis0R5/0rco和Apis0R5/0rco共表達(dá)的爪蟾卵母細(xì)胞對(duì)梯度濃度（反)-β- 法尼烯刺激的劑量反應(yīng)曲線圖，
[0029]圖5為RNA干擾Apis0R5基因后Υ型管行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，
[0030] 圖6為Apis0R5/0rco共表達(dá)的爪蟾卵母細(xì)胞的氣味反應(yīng)譜圖，
[0031]圖7為豌豆蚜對(duì)(反)-β_法尼烯和乙酸香葉酯行為學(xué)反應(yīng)圖，
[0032]圖8為棉蚜對(duì)(反)-β_法尼烯和乙酸香葉酯行為學(xué)反應(yīng)圖，
[0033]圖9為(反)-β_法尼烯和乙酸香葉酯對(duì)豌豆蚜和棉蚜趨避強(qiáng)度圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但并不用 來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條 件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0035] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí) 驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為市售常規(guī)生化試劑。
[0036] 實(shí)例1蚜蟲氣味受體基因的分析與克隆
[0037] 1.蚜蟲氣味受體基因的分析
[0038] 使用DNAMAN8.0軟件比對(duì)已預(yù)測得到的豌豆蚜和棉蚜氣味受體(豌豆蚜氣味受體 預(yù)測：Smadja，C.，Shi，P.，Butlin，R.K.&Robertson，Η·Μ·Large gene family expansions and adaptive evolution for odorant and gustatory receptors in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum.Mol Biol Evol 26,2073-2086,doi:10.1093/molbev/mspl16 (2009)棉蚜氣味受體預(yù)測：Cao，D.，Liu，Y.，Walker，W.B.，Li，J.&Wang，G .Molecular characterization of the Aphis gossypii olfactory receptor gene families.PLoS One 9，elOl 187，doi : 10 · 1371/journal .pone ·0101187(2014) ·)的氨基酸一致性，按照同源 性從高到低排序后，選擇氨基酸一致性高于65%的氣味受體，作為候選的特定氣味受體，并 構(gòu)建同源樹，如圖1所示。
[0039] 2.蚜蟲的飼養(yǎng)與組織收集
[0040]豌豆蚜是在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所使用土培蠶豆飼養(yǎng)的，飼養(yǎng)溫度為20 ±2°C，光周期為16:8,相對(duì)濕度為70±5%。取3,4齡若蟲及成蟲蚜觸角置于-70°C冰箱待 用。
[0041] 棉蚜是在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所使用土培棉花飼養(yǎng)的，飼養(yǎng)溫度為25± 1°C，光周期為14:10,相對(duì)濕度為60 ±5%。取3，4齡若蟲及成蟲蚜觸角置于-70°c冰箱待用。
[0042] 3.RNA 的提取
[0043] RNA提取的全部過程均在無 RNA酶條件下進(jìn)行。整個(gè)提取步驟如下所示：
[0044] 1)從-70°C冰箱取出保存的組織，倒入勻漿器中并加入lmL Trizol試劑，充分研磨 組織，將研磨好的組織溶液轉(zhuǎn)移到置于冰上的無 RNA酶的1.5mL離心管中。
[0045] 2)4°C，12000rpm 離心 10min。
[0046] 3)將上清轉(zhuǎn)移到新的無 RNA酶的1.5mL離心管中。為了充分裂解核蛋白復(fù)合體，室 溫放置5min。
[0047] 4)向離心管中加入0.2mL氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜置2-3min。
[0048