產(chǎn)前篩選的制作方法
【專利說明】產(chǎn)前篩選 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種篩選母體尿液樣品的質(zhì)譜指紋特征變化的方法，發(fā)現(xiàn)所述質(zhì)譜指 紋特征變化是胎兒非整倍性(例如唐氏綜合征）的特征，并應(yīng)用于篩選妊娠的其它胎兒異常 和妊娠素亂(包括妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾?。?。
[0002] 具體而言，本發(fā)明設(shè)及一種檢測胎兒非整倍性的方法，所述胎兒非整倍性例如唐 氏綜合征、帕陶綜合征、特納綜合征、克蘭費(fèi)爾特綜合征、愛德華綜合征和Ξ重X。
【背景技術(shù)】
[0003] 21Ξ體綜合征，通常稱為唐氏綜合征，其特征是染色體21的額外拷貝，并且是最常 見的嚴(yán)重先天異常之一，其成為學(xué)齡兒童顯著學(xué)習(xí)障礙的最常見單一因素。受唐氏綜合征 影響的人具有嚴(yán)重的智力缺陷，縮短的預(yù)期壽命，W及異常免疫應(yīng)答，運(yùn)使其易受嚴(yán)重感 染。唐氏綜合征患者中有40%具有先天性屯、臟病和較高的罹患白血病的風(fēng)險(xiǎn)?；加刑剖暇C 合征的人在40歲之后易于發(fā)展阿茲海默癥疾病的神經(jīng)病理學(xué)變化特點(diǎn)。
[0004] 在孕早期（即約15~16周），唐氏綜合征的確定性測試是羊膜穿刺術(shù)后的染色體組 型分析。運(yùn)種分析所需的羊水取樣具有誘導(dǎo)自發(fā)流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，100例中有約1例發(fā)生該狀況。
[0005] 最初，母親年齡是鑒定女性是否具有唐氏綜合征嬰兒高風(fēng)險(xiǎn)的唯一因素。40歲時， 產(chǎn)有唐氏綜合征嬰兒的幾率是百分之一。運(yùn)已導(dǎo)致多家醫(yī)院為超過某一年齡(通常為35或 37歲）的女性提供羊膜穿刺術(shù)。然而，運(yùn)僅能鑒定出全部唐氏綜合征病例中的15-30%，因?yàn)?大多數(shù)病例仍會在更年輕的女性中出現(xiàn)。
[0006] 在過去的25年中，已發(fā)展出多種標(biāo)志物血液測試W篩選唐氏綜合征。血清α-胎蛋 白（AFP)加人絨膜促性腺激素化CG)是最常用的標(biāo)志物。然而，更近期時已將非偶聯(lián)雌Ξ醇 (證3)和抑制素 A添加至需要篩選的標(biāo)志物。
[0007] 篩選性能根據(jù)對于所用的標(biāo)志物的選擇和是否采用超聲來估計(jì)孕齡并檢測15-22 周時的頸部皺權(quán)厚度而變化。當(dāng)篩選血清標(biāo)志物且將超聲與母親年齡聯(lián)用時，5%假陽性率 的檢出率估計(jì)為:雙重測試(AFP+hCG)為59%，S重測試(AFP，hCG，證3)為69%，且四重測試 (包含抑制素 A)為76%。
[000引現(xiàn)有的篩選技術(shù)是昂貴的，并且要求W最小侵入性操作對血液取樣，并且對針對 胎齡的水平變化進(jìn)行校正的檢測值進(jìn)行數(shù)學(xué)建模。
[0009] 人絨膜促性腺激素化CG)是一種糖膚激素，其由胎兒胎盤的合胞滋養(yǎng)層產(chǎn)生，并且 分子量為約38千道爾頓。其可通過在受精后數(shù)天內(nèi)基于母體尿液中的免疫測定來檢測。完 整的hCG分子是異質(zhì)二聚體，其包含特定的的5亞基，該亞基非共價結(jié)合至α亞基，運(yùn)對于其 它糖蛋白是常見的。
[0010] 在唐氏綜合征中，平均上，完整hCG和游離β-亞基的母體血清水平升高，但升高的 程度大于30游離β-hCG。在妊娠女性的血清和尿液中均能檢測到HCG，其形式為hCG的游離α 和β亞基，W及hCG的降解產(chǎn)物和游離β-亞基hCG的降解產(chǎn)物。
[0011] hCG的β-亞基的最終降解產(chǎn)物是尿促性腺激素膚化GP)，也稱作β-核屯、-hCG、f3-核 屯、片段、e-核屯、或尿促性腺激素片段(uG巧。
[0012] UGP被分泌進(jìn)入尿液。W097/03363描述了唐氏綜合征的產(chǎn)前尿液篩選方法，其包括 在妊娠頭Ξ個月中檢測母體尿液樣品，W測定樣品中的UGP水平是否高于來自正常的10例 妊娠的尿液樣品中所見的UGP水平。描述于W097/03363的方法采用UGP特異性的免疫測定。 [00 1引已通過HPLC質(zhì)譜法和晶體分析成熟表征了hCG。利用膜蛋白酶消化，已采用基質(zhì)輔 助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-ToF MS)進(jìn)行hCG及其亞基的膚質(zhì)量圖譜分析。 化coby，E. S等在C1 inical Chemistry，46(11)，1796-1803(2000)中描述了從妊娠尿液純化 hCGf3-核屯、片段化CG化f)，其因二硫蘇糖醇(DTT)減少而減少，并且由MALDI-ToF MS進(jìn)行分 析。他們總結(jié)稱，產(chǎn)生了 DTT-減少的hCGPcf質(zhì)譜，但并沒有準(zhǔn)確確定hCGikf糖基化可能會導(dǎo) 致獨(dú)特的"指紋"。來自妊娠女性的未經(jīng)提取的尿液樣品的MLDI-ToF MS分析僅顯示對應(yīng)于 蛋白質(zhì)化hCG化f的寬峰。
[0014] W003/065043描述了對MALDI-T0F MS祀標(biāo)上的免疫球蛋白的固定，其隨后用于蛋 白質(zhì)（例如hCG化f)的鑒定和相對定量。
[0015] 人絨膜促性腺激素化CG)是異質(zhì)二聚化的糖蛋白激素，其具有8個糖基化位點(diǎn)，包 含四個N-連接的寡糖和四個0-連接的寡糖。所述N-連接的寡糖通過天冬酷胺殘基上的β-Ν-糖巧鍵連接至多至膚鏈;兩個在α亞基上且兩個在β亞基上。他們共有相同的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： Ν-乙酷基葡萄糖胺(GLcNAc)連接至天冬酷胺殘基上，然后連接至另一個化cNAc、甘露糖和 甘露糖的分支。運(yùn)是單觸角(monantennary)戊糖核屯、，其剩余組分保持可變。所述0-連接的 寡糖由α-Ο-糖巧鍵連接至β-亞基簇基末端膚的絲氨酸殘基上。
[0016] 已廣泛報(bào)道在正常和異常妊娠中，碳水化合物異質(zhì)性的hCG的游離β-亞基化CGi3) 具有可變的單-、二-和Ξ觸角碳水化合物結(jié)構(gòu)化lliott MM，Kardana A，Lustbader JW， Cole LA.Endocrine.1997年8月；7(1):15-32,Carbohydrate and peptide structure of the 曰Iph曰-曰nd bet曰-subunits of hum曰n chorionic gon曰dotropin from norm曰1 曰nd aberrant pre即an巧and choriocarcinoma(來自正常和異常妊娠和絨膜癌的人絨膜促性 腺激素的α-和β-亞基的碳水化合物和膚結(jié)構(gòu)））。
[0017] 被稱為β-核屯、片段化CGikf)的hCG的β-亞基的降解產(chǎn)物由經(jīng)四個二硫橋連接的來 自hCG的β-亞基的膚，即，膚β6-40和化5-92組成。其在代謝之前保留了原始hC地分子的多個 抗原決定簇，所述代謝主要在腎中發(fā)生。該說-40膚鏈包含兩個hCGPN-連接的碳水化合物部 分，盡管寡糖因代謝而被截短。
[0018] 采用MALDI-ToF MS研究hC地cf糖基化時，導(dǎo)致似乎具有獨(dú)特"指紋"的色譜，所用 方法設(shè)及采用二硫蘇糖醇對樣品預(yù)處理，W減少膚的質(zhì)量，由此使其進(jìn)入質(zhì)譜儀的相對最 適的分辨范圍。根據(jù)化coby等（2000)的MALDI-ToF MS分析，導(dǎo)致對應(yīng)于質(zhì)子化hCG化f的寬 峰。
[0019] MALDI-ToF MS的缺點(diǎn)在于，其并不是定量技術(shù)。因此，所得的原始質(zhì)譜結(jié)果并不能 用于直接產(chǎn)生適用于診斷測試算法的對比數(shù)據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] hCG糖基化極具可變性，并且hCG的高度糖基化發(fā)生于妊娠素亂和胎兒非整倍性 (例如唐氏綜合征）中。現(xiàn)今已發(fā)現(xiàn)，通過對獲自多至第二個Ξ月期(優(yōu)選在懷孕第7周~第 13周）的妊娠女性的未經(jīng)提取的、未處理的尿液樣品進(jìn)行MADLI-ToF MS分析，能夠獲得獨(dú)特 的質(zhì)譜，其可顯示糖基化變體的特征變化。運(yùn)些特征變化能夠指示過度糖基化的hCG的代謝 產(chǎn)物，其具有妊娠素亂和胎兒非整倍性中滋養(yǎng)層的細(xì)胞中糖基化過程的特點(diǎn)，因此能夠指 示運(yùn)些病癥。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種檢測多至第二個Ξ月期的妊娠素亂或胎兒非整 倍性的方法，所述方法包括，對來自妊娠女性的母體尿液樣品進(jìn)行直接質(zhì)譜分析，和