基于量子點(diǎn)CdSe檢測(cè)人血清中VEGF濃度的試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用生物特有的結(jié)合方法的測(cè)定試劑盒及其使用方法，特別是涉 及一種用于檢測(cè)人血清中VEGF濃度的利用生物特有的結(jié)合方法的測(cè)定試劑盒及其使用方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是威脅全球包括我國人民健康生活的一大主要疾病。衛(wèi)生部資料顯示， 2〇〇8年癌癥首次成為我國城鎮(zhèn)和鄉(xiāng)村死亡原因的首位。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是我國腫瘤 的防治方針，為更好的貫徹該方針，科學(xué)界一直在努力尋找新的腫瘤標(biāo)志物，包括廣譜腫瘤 標(biāo)志物和組織器官特異性腫瘤標(biāo)志物。其中，VEGF就是近年來腫瘤學(xué)界較為公認(rèn)的最具應(yīng) 用前景的腫瘤篩查、輔助診斷、預(yù)后和療效評(píng)價(jià)的標(biāo)志物。
[0003] 腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新血管的生成，而腫瘤新血管的生成是在腫瘤血管生成 刺激因子和抑制因子的共同調(diào)控下進(jìn)行的。血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF)是腫瘤血管新生中最重要的刺激因子。1971年由Folkman首次提 出，快速生長的腫瘤組織如果沒有新血管生成（Angiogenesis)以供應(yīng)營養(yǎng)和養(yǎng)分，其直徑 不會(huì)超過1-3_3。后來由其本人總結(jié)了 Folkman理論，它揭示了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴與 血管生成（Angiogenesis)的原理：一方面，腫瘤在原位生長時(shí)必須依賴血管生成；另一方 面，腫瘤的轉(zhuǎn)移同樣需要血管生成來提供足夠的氧氣和營養(yǎng)成分（Folkman J. Natl Cancer Inst. 1990 ;82:4-6)。1994年，Kondo等人首次報(bào)道了癌癥病人血清VEGF水平高于正常對(duì) 照組，并提出VEGF可能是腫瘤的一種廣譜血液學(xué)標(biāo)志物（Kondo S et al. Biochim Biophys Acta，1994, 1221(2) :211-214),目前已得到科學(xué)界的認(rèn)同。
[0004] 血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF)是一個(gè)分子 量為45kDa的高度糖基化的堿性蛋白，是由兩條相同的肽鏈組成的同型二聚體，等電點(diǎn)為 8. 5,具有很強(qiáng)的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞（Vascular endothelial cells)分裂繁殖以及增強(qiáng)毛 細(xì)血管通透性的能力，可由腎臟細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等正常組織細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，也可由多種腫 瘤細(xì)胞產(chǎn)生。它最早是在牛垂體濾泡星狀細(xì)胞體外培養(yǎng)液中純化出來的，由于能夠有效地 刺激內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和極強(qiáng)地誘導(dǎo)血管生成而得名（Ferrara N. European Journal of Cancer, 1996, 32(14):2413-2422) 〇
[0005] 人類VEGF基因定位于人類基因組6p21. 3位，全長14Kb，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含 子構(gòu)成，通過基因轉(zhuǎn)錄的mRNA不同剪接方式（Alternative splicing),編碼4種主要異構(gòu) 體，它們?yōu)?VEGF121、VEGF165、VEGF189 和 VEGF206。VEGF121、VEGF145 和 VEGF165 為分泌 型血管內(nèi)皮生長因子，而VEGF183、VEGF189和VEGF206為基質(zhì)結(jié)合型蛋白。血液中檢測(cè)到的 主要是VEGF165和VEGF121，而VEGF206、VEGF189的含量很低。VEGF165是最主要的異構(gòu)體， 也是生理活性最強(qiáng)的VEGF異構(gòu)體（Houck KA et al. Mol Endocrinol. 1991 ;5:1806-1814)。
[0006] VEGF 受體主要有 VEGFR-1 (Fit - 1)，VEGFR-2 (Flk/KDR)和 VEGFR-3 (Fit - 3)三 種。目前已知，VEGFR - 2是VEGF發(fā)揮生物學(xué)功能的主要受體，亦即VEGF家族的大部分 成員均與VEGFR - 2結(jié)合發(fā)揮其血管生成的生物學(xué)功能。這三種受體主要分布于血管內(nèi)皮 細(xì)胞表面，由含7個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外區(qū)、膜區(qū)及酪氨酸吉美區(qū)組成，均是跨膜受 體，屬于RTK(receptor tyrosine kinase) III型，其共同特點(diǎn)是催化域內(nèi)有酪氨酸激酶插 入?yún)^(qū)，該酪氨酸激酶的活性通過受體和配體結(jié)合而激活，由受體磷酸化而引起細(xì)胞內(nèi)相關(guān) 反應(yīng)，在細(xì)胞的生長和分化中其重要作用。研究表明，VEGF受體在體外與VEGF有高度的親 和力（Kendall et al.PNAS USA, 1993, 90:10705-9)。
[0007] 量子點(diǎn)由于粒徑很小，電子和空穴被量子點(diǎn)限域，連續(xù)能帶變?yōu)榫哂蟹肿咏Y(jié)構(gòu)的 分立能級(jí)結(jié)構(gòu)。因此光學(xué)行為與一些大分子很相似，可以發(fā)射熒光。與傳統(tǒng)的熒光染料相 比，量子點(diǎn)有很多優(yōu)點(diǎn)：1)光穩(wěn)定性好，無機(jī)微晶能夠承受多次的激發(fā)和光發(fā)射，而有機(jī)分 子卻會(huì)分解，持久的穩(wěn)定性可以讓研究人員有更長的觀察時(shí)間。2)激發(fā)光譜范圍寬、發(fā)射光 譜范圍窄而對(duì)稱，從紫外線到紅光，量子點(diǎn)具有廣泛的激發(fā)光譜范圍，可以同時(shí)使用不同光 譜特性的量子點(diǎn)，而發(fā)射光譜不出現(xiàn)重疊。3)量子點(diǎn)具有豐富的顏色。4)st〇keS位移大， 背景噪聲小。因此，納米量子點(diǎn)作為一種新型的熒光標(biāo)記材料，在生物領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越 受到了廣泛的關(guān)注，特別是在臨床診斷方法取得了長足的進(jìn)展。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)中VEGF的檢測(cè)方法均為采用單克隆抗體包被與抗體標(biāo)記做夾心法實(shí) 驗(yàn)，檢測(cè)范圍較窄，檢測(cè)VEGF濃度較低，均為pg級(jí)，僅適用于人體血清學(xué)檢驗(yàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)的基于量子 點(diǎn)CdSe檢測(cè)人血清中VEGF濃度的試劑盒及其使用方法，本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)濃度高，可達(dá) ng級(jí)，適用于腹水收集、細(xì)胞培養(yǎng)中高濃度VEGF檢測(cè)。
[0010] 本發(fā)明基于量子點(diǎn)CdSe檢測(cè)人血清中VEGF濃度的試劑盒，其特征在于：包括 VEGF受體和量子點(diǎn)CdSe標(biāo)記的多抗；
[0011] 其中，所述VEGF受體是VEGFR-1 mRNA的部分序列利用宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備得 到；
[0012] 所述量子點(diǎn)CdSe標(biāo)記的多抗是利用抗體上的氧化醛基與帶有酰肼基團(tuán)的量子點(diǎn) CdSe直接位點(diǎn)定向性結(jié)合制備得到；
[0013] 所述多抗為利用純化濃縮的VEGF作為免疫原，免疫家兔得到的。
[0014] 進(jìn)一步，本發(fā)明基于量子點(diǎn)CdSe檢測(cè)人血清中VEGF濃度的試劑盒，所述VEGFR-1 mRNA的部分序列為從VEGFR-1 mRNA序列全長中選取的VEGFR-1 siRNA靶序列，如SEQ ID NO. 1所示；
[0015] 所述VEGF受體的制備中，引物1如SEQ ID NO. 2所示，引物2如SEQ ID NO. 2所 示；
[0016] 所述宿主細(xì)胞為fF9昆蟲細(xì)胞。
[0017] 進(jìn)一步，本發(fā)明基于量子點(diǎn)CdSe檢測(cè)人血清中VEGF濃度的試劑盒，所述多抗按以 下步驟制備：先用卡介苗注射刺激動(dòng)物后，用VEGF進(jìn)行兩次免疫；然后采集家兔全血，離心 取血清；利用正辛酸-硫酸銨沉淀法和DEAE離子交換樹脂純化，即制得多抗。
[0018] 進(jìn)一步，本發(fā)明基于量子點(diǎn)CdSe檢測(cè)人血清中VEGF濃度的試劑盒，所述量子點(diǎn) CdSe標(biāo)記的多抗的制備步驟如下：
[0019] -、向lmL活化緩沖液中，加入12. 5uL的納米量子點(diǎn)CdSe溶液、4uL 5mM的1-乙 基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC)和5. luL已二酸二酰肼（ADH)溶液， 充分混合后，室溫反應(yīng)4h ;
[0020] 二、將步驟一中的混合液體裝入透析袋中，在PBS中透析，除去過剩的ADH和EDC， 即制得帶有酰肼基團(tuán)的量子點(diǎn)CdSe ;
[0021] 三、將抗體溶解于0. 01M的磷酸鈉溶液中，調(diào)節(jié)NaCl濃度為0. 15M，pH值為7. 2， 抗體終濃度為l〇mg/ml ;
[0022] 四、制備0. 1M的高碘酸鈉水溶液，避光保存；
[0023] 五、將步驟三制得的抗體溶液稀釋至1. 5mg/mL，取lmL稀釋后的抗體溶液迅速加 入100uL步驟四制得的高碘酸鈉溶液，混勻，并避光室溫反應(yīng)30分鐘；
[0024] 六、將步驟五中的混合液裝入透析袋中，在PBS中透析，無機(jī)鹽等小分子物質(zhì)通過 半透膜擴(kuò)散到緩沖液中，以獲得較為純化的氧化抗體，即制得高碘酸氧