或⑶41/61的FITC偶聯(lián)的抗體（安福萊特分析公司（Emfret Analytics)，德國艾貝爾斯塔特）探測樣品并在FACSCalibur流式細胞儀（BD公司）上運 行。當PLT通過檢測器時通過其特有的正向和側(cè)向散射來進行門選，并在扣除FITC偶聯(lián)的 IgG抗體特異性對照（安福萊特分析公司）后計算其總熒光強度。通過將流出物收集期間 的凈GP IX+PLT生產(chǎn)除以凈GP IX+MK消耗來測定PLT產(chǎn)率，并對至少三個獨立樣品進行。 結(jié)果與GP IIbIIIa+細胞相同。
[0102] 圖像分析
[0103] 使用 ImageJ 和 Adobe Photoshop CS3 (Adobe 系統(tǒng)公司（Adobe Systems)，加利福 尼亞州圣何塞）分析Metamorph中獲取的數(shù)字圖像。分界線明確地區(qū)分單獨的不同圖像， 或相同圖像的單獨區(qū)域。沒有對圖像內(nèi)的特定特征進行增強、遮蔽、移動、移除或?qū)?，且?亮度、對比度和色平衡的調(diào)節(jié)線性地應用于整個圖像。
[0104] 人BM的微流體裝置模型生理特性
[0105] 為重現(xiàn)生理條件，分別使用纖維蛋白原和纖連蛋白選擇性包被各通道以再生血管 微環(huán)境和BM的ECM組成（如圖2A所示）。通過跨微流體裝置流動，沿第一通道輸注的原 代MK在各柱之間被依次捕獲并將proPLT延伸至第二通道（如圖2B所示），再現(xiàn)了生理 proPLT延伸。為對3D ECM組織和生理BM剛性（250Pa)進行建模，在微流體裝置中聚合的 1 %藻酸鹽溶液中輸注MK，將MK選擇性包埋在第一通道內(nèi)的藻酸鹽凝膠中并保留第二通道 中的血管流。藻酸鹽不抑制proPLT生產(chǎn)，并可控制MK與第二通道的距離。
[0106] 沿第二通道選擇性接種人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC)，并生長至融合以生產(chǎn)功能性 血管（如圖2C所示）。此外，通過10χ-150χ放大、高分辨率活細胞顯微鏡監(jiān)測MK行為，并從 流出物中收集釋放的PLT。圖2D顯示完整的系統(tǒng)，顯示運行。表征層狀流體剪切速率（如 圖2E所示），并使用兩個微流體栗嚴格控制（一個用于第一通道且一個用于第二通道）。裝 置內(nèi)的剪切速率與輸注速率呈線性正比例并經(jīng)調(diào)節(jié)以跨生理范圍（500-2500S 1K雖然空微 通道連接部處的剪切速率隨著與第一通道的距離而增加（如圖2F所示），但在MK捕獲后， 流體被重定向至下一個可用的間隙從而使MK在這些位點處持續(xù)經(jīng)歷生理（760至780s 4 剪切速率（如圖2G所示）。
[0107] 血管剪切觸發(fā)proPLT生產(chǎn)、生理延伸和釋放
[0108] 體內(nèi)BM MK以血液流動的方向延伸proPLT并將PLT、proPLT、大的細胞質(zhì)片段 (prePLT)和甚至整個MK釋放至竇狀腺血管中，其可在肺微血管床中捕獲，或在循環(huán)中成 熟。為測定生理剪切對PLT生產(chǎn)的影響，在培養(yǎng)第4天分離小鼠胎肝培養(yǎng)物來源（mFLC)的 MK并在輸注入微流體裝置前通過尺寸和多倍性表征（如圖3A所示）。
[0109] 體外生產(chǎn)可輸注PLT的主要挑戰(zhàn)之一是鑒定觸發(fā)proPLT生產(chǎn)的因子。在靜態(tài)條 件下，MK在分離后約6小時開始生產(chǎn)proPLT，并在18小時時達到最大proPLT生產(chǎn)（如圖 3B所示）。相比之下，生理剪切下（如圖3C所示，約500s 1)的MK在捕獲的數(shù)秒內(nèi)開始生 產(chǎn)proPLT，在培養(yǎng)的最初2個小時內(nèi)達到最大proPLT生產(chǎn)和生物芯片飽和。生理剪切下 的MK生成較少、較長的proPLT，其相對于靜態(tài)培養(yǎng)物的高度支化程度較低。剪切培養(yǎng)中的 proPLT均勻地延伸至下通道內(nèi)并以相對血管通道壁流動的方向排列，再現(xiàn)了生理proPLT 生產(chǎn)。生理剪切下生產(chǎn)proPLT的MK百分比是靜態(tài)培養(yǎng)物的兩倍，其比例為約90% (如圖 3D所示）。
[0110] 生成用于輸注的臨床數(shù)目的PLT的另一個主要挑戰(zhàn)是體外培養(yǎng)以顯著低于體內(nèi) 的速率延伸proPLT。在我們的微流體裝置中應用生理剪切將proPLT延伸提高至高于靜態(tài) 培養(yǎng)物對照一個數(shù)量級（至大約30 μ m/分鐘，如圖3E所示），其符合活小鼠中活體顯微研 究的proPLT延伸速率生理預測并支持增加的體外proPLT生產(chǎn)。
[0111] 在人和小鼠中的早期組織學研究預測可擠壓全MK以及MK片段通過BM血管內(nèi)血 管內(nèi)皮中的間隙或穿孔以在肺循環(huán)床（pulmonary circulatory bed)中捕獲。最近在血 液中發(fā)現(xiàn)了稱為PrePLT的大PLT中間體，并且將mBM和FLC來源的MK和prePLT靜脈輸 注至小鼠中在體內(nèi)生成了 PLT。在目前的研究中，常規(guī)地觀察到100 μ m+直徑MK擠壓通過 3μπι(如圖4A所示）和1·5μπι間隙，或延伸大MK片段（如圖4B所示），支持血管PLT生 產(chǎn)的模型。此外，切斷事件（abscission event)通常由高分辨率活細胞顯微鏡捕獲并發(fā)生 在沿proPLT軸的可變位置處，釋放prePLT大小的中間體（3-10 μ m直徑）和PLT (1. 5-3 μ m 直徑）（如圖4C和圖4D所示）。每次切斷后，所得proPLT末端在尖端形成新的PLT大小的 膨脹，其隨后被延伸和釋放，重復該循環(huán)（如圖4E所示）。
[0112] 當剪切速率保持恒定時，proPLT延伸速率在沿軸的不同位置處變化，預測存在一 種受調(diào)控的細胞骨架驅(qū)動的proPLT延長機制（如圖4C所示）。在生理范圍內(nèi)提高微流 體剪切速率不影響培養(yǎng)物中proPLT延伸速率中值或proPLT延伸速率的分布（如圖4F所 示），且經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染以表達GFP-β 1的MK中的proPLT凸出由外周微管（MT)組成， 該外周微管在PLT尺寸的末端處形成螺旋（如圖4G所示）。proPLT達到超過5mm的長度 并在體外耐受最高1000s 1的剪切力；其從活體顯微觀察中重現(xiàn)了 proPLT生產(chǎn)的生理示例， 并顯示剪切未導致切斷事件。為確認剪切誘導的proPLT延伸是細胞骨架驅(qū)動的，在微流 體裝置中進行輸注之前，將MK與5μΜ Jasplankinolide(Jas，肌動蛋白穩(wěn)定劑）或ImM赤 式-9-(3-[2-羥基壬基](EHNA，胞質(zhì)動力蛋白抑制劑）孵育。在靜態(tài)和生理剪切條件下， Jas和EHNA都抑制剪切誘導的proPLT生產(chǎn)（如圖4H和圖41所示）和PLT釋放。
[0113] 衍生的PLT表現(xiàn)血液PLT的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)
[0114] PLT是直徑為約1-3 μ m的無核盤狀細胞，其在表面上表達生物標記物GP IX和 Ilbllla，并且以環(huán)繞基于肌動蛋白的細胞骨架網(wǎng)絡的6-8個MT的皮質(zhì)MT螺旋為特征。為 確定PLT產(chǎn)率，培養(yǎng)第四天在我們的微流體裝置中進行輸注之前緊接通過流式細胞術(shù)測量 糖蛋白（GP) IX+mFLC-MK的相對濃度和正向/側(cè)向散射和生物標記物表達（如圖5A所示）。 在輸注后2小時收集流出物并與mFLC-MK輸入物比較（如圖5B所示）。輸入的MK和流出 的PLT都在其表面上表達GP IX和Ilbllla，并顯示特征性正向/側(cè)向散射。在相對于培 養(yǎng)第五天分離的靜態(tài)培養(yǎng)物上清液，剪切的應用使得流出物的細胞組成朝向更多PLT尺寸 的GPIX+細胞變化（如圖5C所示）。85±1%的MK在2小時內(nèi)轉(zhuǎn)化為PLT，其符合我們的 proPLT生產(chǎn)百分比的定量（圖3D)并與靜態(tài)培養(yǎng)物相比顯著改進（圖OT)。在我們的微流 體裝置中在2小時內(nèi)持續(xù)輸注約500s 1剪切生成了約21個PLT/MK并形成超過現(xiàn)有培養(yǎng)方 法的PLT生產(chǎn)速率，現(xiàn)有培養(yǎng)方法在長得多的時間（6-8天）內(nèi)生成類似的PLT數(shù)目。
[0115] 為定量我們的產(chǎn)品的形態(tài)組成（morphological composition)，對來自我們的微 流體裝置的流出物探測β?微管蛋白（PLT特異性微管蛋白同種型）和Hoescht (細胞核染 料），并通過免疫熒光顯微鏡進行分析。根據(jù)其形態(tài)和尺寸揀選細胞，并將其與靜態(tài)MK培 養(yǎng)物上清液比較。剪切的應用使得流出物的細胞組成朝向更多PLT尺寸的β 1微管蛋白 +Hoescht細胞變化（如圖5Ε所示），其符合流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)（圖5C)并形成在組成上更類 似于全血中PLT中間體的分布的產(chǎn)物。流出物中游離細胞核的定量確認了相對于靜態(tài)培養(yǎng) 物增加的微流體裝置介導的PLT生產(chǎn)并確定PLT產(chǎn)率為約20 ± 12個PLT/MK，其符合流式細 胞術(shù)數(shù)據(jù)。
[0116] 靜止的PLT含有特征性的表面膜內(nèi)陷（其形成開放的小管系統(tǒng)），閉合的殘留內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)的通道網(wǎng)絡（其形成致密的微管系統(tǒng)），細胞器，特化的分泌顆粒，并且在與玻璃接觸 激活后會變平/鋪展。微流體裝置生成的PLT無法通過薄片透射電子顯微鏡在超微結(jié)構(gòu)上 與小鼠血液PLT區(qū)分開；并且含有皮層MT螺旋、開放的小管系統(tǒng)、致密的微管系統(tǒng)、線粒體、 α和致密顆粒（如圖5F所示）。微流體裝置生成的PLT和PLT中間體通過免疫熒光顯微 鏡顯示與小鼠血液PLT相比可比的MT和肌動蛋白組成（如圖5G所示），并在與玻璃接觸激 活后正常鋪展，形成絲狀偽足和板狀偽足。
[0117] 將微流體裝置應用于人PLT生產(chǎn)
[0118] 為生成人PLT，使用hiPSC衍生的MK代替我們的微流體裝置中的mFLC-MK，其 提供了實際上用于輸注的無限制MK來源。hiPSC-MK在培養(yǎng)第15天分離，前提是其達到 20-60 μ m的最大直徑（如圖6A所示），并且在超微結(jié)構(gòu)上類似于原代人MK (如圖6B所示）。 在靜態(tài)培養(yǎng)物下，hiPSC-MK在分離后約6小時開始生產(chǎn)proPLT，并在18小時時達到最大 proPLT生產(chǎn)（如圖6C所示）。相比之下，生理剪切下（約500s》的hiPSC-MK在捕獲后 立即開始生產(chǎn)ProPLT，并在培養(yǎng)的最初2個小時內(nèi)延伸/釋放proPLT (如圖6D所示）。剪 切下的生產(chǎn)ProPLT的hiPSC-MK的百分比增加至約90%，顯著超過靜態(tài)培養(yǎng)物（約10% ) (如圖6E所示）。
[0119] proPLT延伸速率略低于mFLC-MK對照（約19 μ m/分鐘對比30 μ m/分鐘）（如圖 6F所示）且更接近生理對照。微流體裝置生成的PLT顯示正向和側(cè)向散射，和人血液PLT 的表面生物標記物表達特征，其無法通過薄片透射電子顯微鏡在超微結(jié)構(gòu)上與人血液PLT 區(qū)分開（如圖6G所示），通過免疫熒光顯微鏡顯示與人血液PLT相比可比的MT和肌動蛋白 表達（如圖6H所示），在與玻璃接觸激活后正常鋪展，并形成絲狀偽足和板狀偽足（如圖 61所示）?？傊?，這些結(jié)果顯示可將hiPSC-MK應用于我們的仿生微流體裝置以生成潛在無 限數(shù)目的功能性人PLT。
[0120] 將微流體裝置應用于藥物開發(fā)
[0121] 血小板減少癥會突然并通常無意間發(fā)生，潛在地導致大量出血和死亡。已證明抗 體和細胞介導的免疫應答導致血小板減少癥。此外，血小板減少癥可由多種藥物觸發(fā)，包括 癌癥藥物，例如達沙替尼。動物模型通常是人中藥物安全性和功效的較差預測物，而臨床研 究是耗時、昂貴且潛在有害的。設計為模擬人BM的微流體裝置代表了具有重大臨床重要性 的創(chuàng)新領域，提供有效和實際的平臺來研究多種藥物對于BM和MK生物學的影響。
[0122] 通常通過使用流式細胞術(shù)的輸注研究來測量PLT存活率和清除率。然而，proPLT 生產(chǎn)的速率和程度的定量不適用于該方法，且需要直接觀察以確定血小板生成在哪個階段 受到影響。相反地，微流體裝置的應用提供了以研究藥物對PLT生產(chǎn)的影響的重要平臺，這 會促進鑒定PLT生產(chǎn)的新調(diào)控因子并闡明臨床上重要的藥物誘導的血小板減少癥的機制。
[0123] 作為概念驗證，使用了高含量活細胞顯微鏡來鑒定曲妥珠單抗安木坦興 (trastuzumab emtansine，T_DMl)表達GFP^Pl微管蛋白（活細胞顯微）影響PLT生產(chǎn)的機 制，該T-DMl是一種目前用于乳腺癌的臨床研發(fā)中的抗體藥物偶聯(lián)物。這些研究表明T-DMl 通過誘導異常的微管蛋白組織來抑制MK分化并破壞proPLT形成（如圖7所示）。確定治 療劑（如T-DM1)影響MK成熟和proPLT生產(chǎn)的通路可產(chǎn)生體內(nèi)調(diào)控PLT生產(chǎn)和控制藥物 誘導的血小板減少癥的策略。
[0124] 本發(fā)明的方法利用一種全新的微流體設計來離體再現(xiàn)人BM和血管生理學，并生 成用于輸注的功能性人PLT的替代性來源。雖然臨床上想要滿足日益增長的輸注需要并 規(guī)避目前與血小板獲取和儲存相關(guān)的風險，但用于治療應用的供體非依賴性PLT的研發(fā)過 程中一直存在兩個主要的數(shù)量障礙