用于土霉素檢測的電化學適體電極及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測用傳感器技術領域，特別涉及一種用于土霉素檢測的電化學適體電 極，還涉及所述電化學適體電極的制備方法。
【背景技術】
[0002] 四環(huán)素類抗生素是廣譜抗生素，已被廣泛應用在農業(yè)的運作和人類醫(yī)學中用于治療傳 染性疾病。它們在低濃度中操作非常有效，并且僅僅在一個較短的時間后就可以完全從體 內代謝出來。然而，過度使用四環(huán)素可能導致嚴重的過敏，在人類安全中的細菌抗性和食 品中的安全問題。土霉素（OTC)是四環(huán)素中最經常被使用的成員之一。世貿組織（WTO)也 對藥物和食物中土霉素的最大殘留量作了規(guī)定。最近報道的檢測土霉素（OTC)的方法主要 包括高效液相色譜法、熒光法，質譜法和其它方法等。但是這些方法通常比較費時間并且價 格相對昂貴。

【發(fā)明內容】

[0003] 為了解決以上現有技術中針對現有檢測方法中檢測成本高，儀器操作復雜，需要專業(yè) 操作人員的缺點，設計了基于核酸適配子的新型夾心構型的用于土霉素檢測的電化學適體 電極。
[0004] 本發(fā)明還提供了所述電化學適體電極的制備方法。
[0005] 本發(fā)明是通過以下步驟得到的： 本發(fā)明是通過以下步驟得到的： 一種用于土霉素檢測的電化學適體電極，包括玻碳電極，所述玻碳電極外表面從里到 外依次附有還原石墨烯-金納米復合材料層，土霉素抗體層和牛血清白蛋白封閉層。
[0006] 所述的電化學適體電極，優(yōu)選還原石墨稀-金納米復合物的厚度為100±5 nm，土 霉素抗體的厚度為1 μ m，BSA的厚度為500±5 nm。
[0007]
[0008] 所述的電化學適體電極的制備方法，優(yōu)選包括以下步驟： (1) 對玻碳電極進行處理洗滌，將氧化石墨烯滴加到電極表面，室溫下干燥，用二次水 沖洗； (2) 浸入氯金酸的硫酸溶液，利用循環(huán)伏安一步電還原氧化石墨烯和氯金酸，得到電極 表面的還原石墨烯-金納米復合物，用二次水沖洗，干燥； (3) 在表面滴加土霉素抗體的PBS緩沖液，37°C下孵育90 min ; (4) 用0. 5%的牛血清白蛋白封閉電極2 h，即得。
[0008] 所述的制備方法，優(yōu)選石墨烯-金納米復合物是通過以下步驟得到的： (1) 石墨粉經過氧化得到氧化石墨稀的制備， (2) 氧化石墨稀同氯金酸按照一步電還原制備石墨稀-金納米復合物。
[0009] 所述的制備方法，優(yōu)選金標記核酸適配體和辣根過氧化物酶納米復合物中，金納 米與核酸適配體以及辣根過氧化物酶的摩爾比為1:2000:50。
[0010] 所述的制備方法，優(yōu)選步驟（3)中在表面滴加10 μ L溶解有100 μ g mL 1 土霉 素抗體（Ab)的PBS緩沖液，37°C下孵育90 min。
[0011] 所述的制備方法，優(yōu)選還原石墨烯-金納米納米復合物是通過以下步驟得到的： 玻碳電極首先在〇. 3和0. 05 μπι的氧化鋁漿中進行拋光處理，直到呈鏡面，用二次水沖 洗；20yL 1.0 mg mL1氧化石墨烯滴加在已處理好的鏡面裸電極上，干燥；之后電極浸入 10 mL含有2.8 mM HAuClJPO. I i^^H2S04溶液，通過循環(huán)伏安一步電化學共還原，得到 rG〇-Au復合物。其中循環(huán)伏安參數：電位設置為0. 0到-1. 5 V，掃描速率0. 05 V/S。
[0012] 所述的制備方法，金標記核酸適配體和辣根過氧化物酶納米復合物是通過以下步 驟得到的： (1) 金納米復合物的制備： 使用機械攪拌裝置，在冷凝回流條件下，還原HAuCl4。具體方案如下：200 mL 0.01% 氯金酸溶液加熱至沸，劇烈攪拌的條件下，快速地加入3 mL 1%的檸檬酸三鈉溶液，幾分鐘 內，溶液顏色由淺黃色變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)加熱15 min后，撤去熱源，慢慢地冷卻至室溫，置于 4°C保存。取60 ??L金納米顆粒溶液于微量比色皿，使用紫外可見分光光度計(對其進行光 吸收波譜掃描，根據光吸收波長在530 nm處的摩爾消光系數3. OXlO9 M1 cm1，計算出金納 米顆粒溶液的濃度約為〇. 3 nmolL 1。（涉及到的所有玻璃儀器在使用之前，都用王水（Vags: V硝》=3:1)浸泡一夜，超純水清洗干凈。） (2) 金標記核酸適配體和辣根過氧化物酶納米復合物的制備： 同時離心2 mL上述制備的金納米溶液，除上清液，加入300 μ L二次滅菌水，即濃縮為 I nmolL 1D然后一起移到玻璃瓶中，用0.1 molL1 NaOH溶液調節(jié)pH為8。取出300 yL轉移 到小玻璃瓶中加入磁子，邊攪拌邊標記：先加入3 yL 5 PmolL1HRP酶溶液，攪拌10 min 后，放入4度冰箱，2 h后取出，再加入60 yL 10 ymolL1 土霉素的核酸適配體（5' -CGA CGC ACA GTC GCT GGT GCG TAC CTG GTT GCC GTT GTG T-3'），邊攪拌邊加，攪拌 10 min 后，放入4度冰箱，過夜。過夜后，第二天取出來，邊攪拌邊加入40. 33 μ L 100 mmolL1磷 酸緩沖液（PB)，10 min后，邊攪拌邊加入13. 90 μ L磷酸鹽緩沖液（PBS)，加完后繼續(xù)攪拌 30 min，放入4度冰箱。過夜，第三天，觀察顏色仍為紫紅色。平均分成兩部分，分別補充滅 菌水至I mL，在兩個離心管中離心，除去上清液，各補充150 μ L滅菌水，一起轉移到玻璃瓶 中。即得300 yL I nmolL1的金標記核酸適配體和辣根過氧化物酶納米復合物。其中，金 納米與核酸適配體以及辣根過氧化物酶的摩爾比為1:2000:50。（小玻璃瓶和磁子都用王水 浸泡，超純水清洗干凈。） 本發(fā)明的工作原理： 在玻碳電極上首先修飾增效物質還原石墨稀-金納米復合物，不但能促進電極表面電 子轉移，而且增效物質之間的特殊基團的連接能保證它們的層層組裝。金納米粒子與土霉 素抗體（Ab)的氨基，通過Au-NH 2的作用，把抗體修飾到電極上。然后，抗體（Ab)與土霉素 有專一的識別能力，土霉素就能成功修飾到電極上。在土霉素的另一端，依靠金納米標記有 辣根過氧化物酶（HRP)的核酸適體（HRP-Apt)通過核酸適體與目標物的特異性識別能力， 也被成功修飾。即，HRP被連接到電極上。在檢測過程中，通過電極上的HRP催化檢測底液 中的對苯二酚（HQ)和雙氧水（H 2O2)的氧化還原產生電信號，連接電化學工作站，以Ag/AgCl 為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設置為-0. 2到0. 6 V，脈沖寬度0. 05 V，脈沖寬度掃 描為0. 06 S，米用差分脈沖伏安技術讀取電信號的變化，根據電極表面產生的電流的大小 起到對目標物檢測的作用。
[0013] 本發(fā)明采用金納米同時標記核酸適配體和HRP，在金納米微球的表面能同時固定 多個HRP。因此，通過標記，更多的HRP被修飾到電極上。電極上固定的HRP的量與修飾的 被檢測物土霉素的量有直接關系，被檢測物越多，固定的HRP的量也越多，催化產生的電信 號也越強。
[0014] 本發(fā)明采用的石墨烯-金納米納米復合物導電性強，成為構建傳感器的優(yōu)良材 料；使用辣根過氧化物酶（HRP)，通過與H2O2和HQ的反應，放大信號；采用了夾心型的檢測 模型，分別在檢測物OTC的兩端引入抗體和適配體，檢測更為靈敏；制備的傳感器靈敏度 高，檢測速度快；檢測OTC的方法，操作簡單、快速、靈敏，便于現場檢測。
[0015] 本發(fā)明的有益效果： 1、由于使用玻碳電極，其電極簡便、小型化、易攜帶、可多次使用。
[0016] 2、修飾層采用電化學一步還原，反應快速，操作簡單。
[0017] 3、反應層是使用表面修飾技術固定在工作電極上，優(yōu)化使用材料的用量與濃度， 制得的夾心型電極對環(huán)境溫度的要求不明顯，室溫下使用即可。
[0018] 4、信號層，采用金納米同時標記核酸適配體和HRP，在金納米微球的表面能同時固 定多個HRP。
[0019] 5、制備方法簡單，性能穩(wěn)定，電極的重復性好，適用于食品安全中土霉素的檢測和 生物傳感器產業(yè)化的實際應用。
[0020] 6、制作電極的工藝成本低，適用于產業(yè)化中價廉的要求。
[0021] 7、以玻碳電極為固定載體固定基于核酸適配體的夾心型電化學傳感系統，可實現 對食品中土霉素的快速在線檢測，根據線性方程，得出檢出限為4. 2X 10 7 μ g mL、
【附圖說明】
[0022] 圖1為電化學適體電極的制備工藝流程圖。
[0023] 圖2為電極的結構示意圖。
[0024] 其中，1為玻碳電極、2為還原石墨烯-金納米復合材料層；3為土霉素抗體層，4為 牛血清白蛋白封閉層。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步說明，下述說明僅是實例性的，不限定 本發(fā)明的保護范圍。
[0026] 首先制備石墨烯-金納米（rG〇-Au)納米復合物和核酸適體和辣根過氧化物酶標 記物（Apt-Au-HRP)的合成 1、石墨稀-金納米（rGO-Au)納米復合物的制備： (1)氧化石墨烯（GO)的制備： 氧化石墨烯（GO)的制備是根據經典的方法。簡而言之，1.0 g石墨粉加入到含有0.5 g硝酸鈉（NaNO3)和3. 0 g高錳酸鉀（KMnO4)的質量分數98%的50 mL濃硫酸（H2SO4)中。 溫度低于20 °C下，反應I h，升溫到35°C，繼續(xù)攪拌30 min。然后緩慢加入約100 mL的離