用于細(xì)菌監(jiān)測(cè)的方法和設(shè)備的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及特別是通過(guò)使用光學(xué)監(jiān)測(cè)，檢測(cè)和測(cè)量樣品中細(xì)菌污染的領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物傳感是工業(yè)中的重要領(lǐng)域，特別是在食品工業(yè)中，其中，檢測(cè)和監(jiān)測(cè)生物污染 物水平（如食品中的細(xì)菌水平）對(duì)于維持現(xiàn)代健康標(biāo)準(zhǔn)極為重要。在食品工業(yè)中，不斷監(jiān) 測(cè)從生產(chǎn)線掉落的產(chǎn)品的需要是特別重要和有問(wèn)題的，因?yàn)槿魏卧斐僧a(chǎn)品的生物污染的生 產(chǎn)故障必須在產(chǎn)品被裝運(yùn)用于銷(xiāo)售之前檢測(cè)出來(lái)。目前，通常通過(guò)測(cè)試來(lái)自各條生產(chǎn)線和 批次的樣品所生長(zhǎng)的培養(yǎng)物來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。但是，由于生長(zhǎng)和測(cè)試這種培養(yǎng)物所需要的時(shí)間， 即使使用現(xiàn)代加速培養(yǎng)生長(zhǎng)和測(cè)量技術(shù)，在檢測(cè)到污染之前，可能已經(jīng)有大量的產(chǎn)品被生 產(chǎn)和包裝好以備裝運(yùn)了，從而導(dǎo)致相當(dāng)大的損失。現(xiàn)有技術(shù)例如表面等離子體共振（SPR) 可以恒定地監(jiān)測(cè)產(chǎn)品內(nèi)生物污染物的水平，但這樣的技術(shù)是昂貴的，通常的安裝花費(fèi)數(shù)萬(wàn) 美元。由于不同的生產(chǎn)線生產(chǎn)大量不同的產(chǎn)品，這種生物傳感技術(shù)通常對(duì)于食品工業(yè)的普 遍使用而言過(guò)于昂貴，并且似乎不存在可以高成本效益廣泛在線監(jiān)測(cè)食品的低成本生物傳 感設(shè)備。
[0003] 近年來(lái)，多孔硅（以下稱(chēng)為PSi)已成為有前景的用于生物傳感應(yīng)用以及用于以納 米級(jí)尺寸傳感其他祀的納米材料。常見(jiàn)基于PSi的光學(xué)傳感器和生物傳感器由納米孔隙 (通常尺寸小于20nm)或介孔（通常在20-100nm范圍內(nèi)）的薄膜組成，因此其橫截面尺寸 比所使用的光波長(zhǎng)小得多。通常，這些孔隙在薄膜裝置的生產(chǎn)過(guò)程中隨機(jī)地產(chǎn)生。這些傳 感器的操作基于用靶分析物替換孔隙內(nèi)的介質(zhì)和/或用靶分析物滲透，并且觀察光學(xué)反射 率所產(chǎn)生的變化。PSi膜的有效折射率的變化表現(xiàn)為反射譜的波長(zhǎng)偏移。只有滲入這些納 米結(jié)構(gòu)的靶分子可以被檢測(cè)到。事實(shí)上，已成功地證明諸如熒光分子、有機(jī)磷酸鹽、揮發(fā)性 有機(jī)化合物、DNA和蛋白質(zhì)的多種化學(xué)和生物分析物的傳感和生物傳感。許多這些研究采 用反射干涉傅立葉變換光譜法（RIFTS)來(lái)監(jiān)測(cè)介孔硅薄膜內(nèi)的生物相互作用。
[0004] 這種填充的或部分填充的、且隨機(jī)定位的孔隙可以被視為簡(jiǎn)單地具有與未填充的 孔隙不同的有效折射率，因?yàn)榭紫侗裙獠ㄩL(zhǎng)小得多。因此，孔隙的隨機(jī)性質(zhì)不會(huì)導(dǎo)致光散 射，而是將來(lái)自娃基底與填充的和未填充的孔隙的組合的總反射光平均（averaging out)。 然而，這種檢測(cè)方案不適用于靶向大生物或其他物質(zhì)（species)，例如其尺寸為約數(shù)百納米 至數(shù)微米及以上的那些，包括細(xì)胞、細(xì)菌和病毒。如果產(chǎn)生具有這種較大孔隙的多孔硅，基 底成為被稱(chēng)為"黑硅"的材料，其看上去如此，是因?yàn)樗鼜?qiáng)烈地散射來(lái)自大尺寸孔隙的隨機(jī) 分布的光。基本上所有的入射光都被孔隙隨機(jī)地散射，并被吸收在介質(zhì)中，使其不能被用于 傳感。因此，現(xiàn)有技術(shù)的多孔硅技術(shù)不能被用于傳感或生物傳感較大尺寸的靶，所述尺寸是 用于傳感的光波長(zhǎng)的重要部分。
[0005] 存在替代方法，其不是在其孔隙內(nèi)，而是在生物傳感器表面的頂部直接捕獲較大 的細(xì)胞靶之后即監(jiān)測(cè)反射光譜強(qiáng)度的變化。然而，這些類(lèi)型的傳感器是有局限的，因?yàn)榉瓷?光譜的強(qiáng)度變化可能有不可預(yù)測(cè)的來(lái)源，例如環(huán)境效應(yīng)和非特異性結(jié)合事件。此外，因?yàn)檫@ 樣的表面結(jié)合傳感器沒(méi)有利用大的多孔體積，靈敏度可能較低。
[0006] 近年來(lái)，已經(jīng)嘗試開(kāi)發(fā)新的用于快速檢測(cè)一般細(xì)菌、尤其是致病菌的生物測(cè)定 (bioassay)和生物傳感器。然而，盡管在該領(lǐng)域內(nèi)取得了顯著進(jìn)步，但目前的技術(shù)缺乏"實(shí) 時(shí)"或在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境之外檢測(cè)微生物的能力。
[0007] 因此，對(duì)下述檢測(cè)方法和設(shè)備存在迫切需求，所述檢測(cè)方法和設(shè)備至少克服一些 現(xiàn)有技術(shù)的系統(tǒng)和方法的缺點(diǎn)，并且特別地，能夠執(zhí)行大生物污染物質(zhì)水平的連續(xù)監(jiān)測(cè)，所 述大生物污染物質(zhì)例如活細(xì)胞、致病細(xì)菌、孢子和病毒，或者類(lèi)似尺寸的其他物質(zhì)，即通常 等于或大于可見(jiàn)光的波長(zhǎng)的尺寸。
[0008] 在本說(shuō)明書(shū)的這一部分和其他部分中提到的每種出版物的公開(kāi)內(nèi)容在此通過(guò)引 用以其整體并入本文。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本公開(kāi)描述示例性的新方法和系統(tǒng)，其用于大靶的檢測(cè)和濃度測(cè)量，所述大靶例 如細(xì)胞、細(xì)菌或病毒等形式的微生物，或其他大型特定生物或其他靶。
[0010] 本公開(kāi)的方法和系統(tǒng)基于孔隙或微室內(nèi)的靶成分的捕獲，并且可以通過(guò)注意它們 的下列特性而簡(jiǎn)要地總結(jié)：
[0011] (a)這些靶被捕獲在尺寸被選擇以容納預(yù)期靶的孔隙或微室內(nèi)，并因此應(yīng)該至少 與靶一樣大。此外，微室或孔隙的表面可以被修飾或調(diào)整，以提高細(xì)胞對(duì)孔隙的捕獲和附 著。例如，孔隙的表面化學(xué)、孔隙表面的粗糙度以及其濕潤(rùn)性（疏水性的或親水性的）可以 根據(jù)待檢測(cè)的靶細(xì)胞和細(xì)菌的特定類(lèi)型進(jìn)行調(diào)整。
[0012] (b)排列孔隙/室的順序，使得入射到其上的光被散射或反射，但不是隨機(jī)的，而 是形成一組衍射級(jí)（a set of diffraction orders)，例如光柵典型的衍射圖案。在這種 情況下，背散射光所測(cè)量的零級(jí)衍射圖案允許直接傳感所述孔隙/微室的有效光學(xué)厚度 (EOT)。因此，預(yù)期衍射光的零級(jí)顯示出干涉圖案，其由孔隙的EOT確定。可以調(diào)整孔隙的 深度，以允許EOT的靈敏檢測(cè)。
[0013] (c)通過(guò)使用孔隙中的介質(zhì)的折射率的變化來(lái)指示孔隙內(nèi)的靶細(xì)胞的存在，從而 實(shí)現(xiàn)傳感。所述介質(zhì)通常是用于維持靶細(xì)胞的液體或緩沖液，并且其折射率的變化改變進(jìn) 入孔隙并從孔隙反射的光的EOT。
[0014] (d) -種特定的但并非唯一的方法，尤其是在EOT大于光的光波長(zhǎng)（Ε0Τ> λ )的時(shí) 候特別可用的檢測(cè)EOT的方法，是使用快速傅立葉變換分析，由此，反射光的光譜進(jìn)行傅立 葉變換，以獲得單一的強(qiáng)度峰，其位置表征所述EOT。
[0015] (e)用于實(shí)現(xiàn)上述設(shè)備和方法的特別方便的設(shè)置（arrangement)采用二維周期性 大孔硅陣列結(jié)構(gòu)（MPSiAS)。多種制備技術(shù)可以被用于制備這樣的MPSiAS基質(zhì)，例如電化學(xué) 方法或采用反應(yīng)離子蝕刻（RIE)的干法蝕刻法。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，這些方法和結(jié)構(gòu)可以 被其他材料和平臺(tái)應(yīng)用，例如其他半導(dǎo)體、有機(jī)聚合物、凝膠、玻璃，甚至金屬表面。
[0016] 現(xiàn)在，考慮上述特征的更多細(xì)節(jié)。由于靶的尺寸等于或大于常用光源（包括紫外、 可見(jiàn)光和近紅外光譜范圍）的波長(zhǎng)，不能使用孔徑大到足以容納這些靶的現(xiàn)有技術(shù)的PSi 基底，因?yàn)?，如前所述，由于大尺寸分布和孔隙的隨機(jī)位置，含有這種大孔隙的無(wú)序裝配的 基底上的入射光照射將導(dǎo)致隨機(jī)散射光。在本公開(kāi)的設(shè)備和方法中，使用孔隙或微結(jié)構(gòu)的 二維（2D)有序陣列，在垂直于孔隙平面的方向照射。該結(jié)構(gòu)克服了在尺寸大于用于測(cè)量的 光的波長(zhǎng)的孔隙上光學(xué)測(cè)量中的現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題。這種結(jié)構(gòu)是有效的層狀相光柵，并且能 夠以2D周期性大孔硅陣列結(jié)構(gòu)（MPSiAS)的形式來(lái)方便地實(shí)現(xiàn)，其孔徑被配置來(lái)適應(yīng)靶的 尺寸。例如，如果待捕獲的細(xì)菌細(xì)胞的典型尺寸是在0. 5-2 μm范圍內(nèi)，這些孔隙或微室的 尺寸可以被制備成在I-IOym的范圍內(nèi)，以容納那些細(xì)胞。然后，這些結(jié)構(gòu)被用作檢測(cè)諸如 細(xì)菌細(xì)胞的革El的光學(xué)傳感平臺(tái)（optical sensing platform)?？梢酝ㄟ^(guò)以下方法來(lái)制備 PSi光子晶體的這種周期性結(jié)構(gòu)，其孔徑尺寸與細(xì)菌細(xì)胞的尺寸相當(dāng)：通過(guò)光刻法以及其 后的電化學(xué)陽(yáng)極氧化過(guò)程（使用氫氟酸基溶液）或者諸如反應(yīng)離子蝕刻（RIE)的干法蝕刻 技術(shù)，來(lái)將孔隙的圖案蝕刻入標(biāo)準(zhǔn)的市售的硅晶片（silicon wafer)。這兩種方法在半導(dǎo)體 工業(yè)中均是公知的，并且與標(biāo)準(zhǔn)的硅處理技術(shù)兼容。所得的PSi結(jié)構(gòu)作為層狀光柵或相光 柵，根據(jù)由物理光學(xué)確定的光柵周期與光波長(zhǎng)之間的嚴(yán)格關(guān)系，其將反射光以不同的角度 散射為一組衍射級(jí)（a set of diffraction orders)。如果與孔隙表面垂直采集所述反射 光，只對(duì)零級(jí)衍射進(jìn)行測(cè)定。這通常通過(guò)使用具有適當(dāng)?shù)膄數(shù)的光學(xué)透鏡以及用于傳送入 射光并采集背散射的零級(jí)反射光的光纖來(lái)實(shí)現(xiàn)。在這種情況下，只有與孔隙深度相關(guān)聯(lián)的 相位延遲有助于由背散射光所產(chǎn)生的干涉圖案。這種干涉圖案被用于所述孔隙的有效光學(xué) 厚度（EOT)的測(cè)量。
[0017] 在孔隙內(nèi)的靶細(xì)胞的存在改變孔隙內(nèi)的介質(zhì)的折射率，從而改變層狀光柵內(nèi)的孔 隙的有效光學(xué)厚度（EOT)。填充有靶細(xì)胞的介孔的百分比越大，EOT的變化就越大。因此， EOT的測(cè)量使得能夠發(fā)現(xiàn)宿主溶液內(nèi)的靶細(xì)胞的濃度。通過(guò)用寬帶光源照射MPSiAS層，可 以實(shí)時(shí)進(jìn)行層狀光柵的EOT的測(cè)量。待測(cè)波長(zhǎng)范圍內(nèi)的反射光光譜是來(lái)自MPSiAS的頂面 的反射以及來(lái)自穿過(guò)孔隙并且從它們的底部表面