用于確定介質(zhì)中的熒光物質(zhì)濃度的方法和設(shè)備的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于確定介質(zhì)中的熒光物質(zhì)的濃度的方法，其中，將具有激發(fā)波長的激發(fā)輻射輻射通過具有熒光物質(zhì)的介質(zhì)，從而使熒光物質(zhì)以這樣的方式被激發(fā)，使得熒光物質(zhì)發(fā)射具有熒光波長的熒光輻射，其中對熒光輻射的強度進行測量，而介質(zhì)中的熒光物質(zhì)的濃度根據(jù)測量的熒光輻射的強度而確定。
[0002]另外，本發(fā)明還涉及用于確定介質(zhì)中的熒光物質(zhì)的濃度的設(shè)備，該設(shè)備至少包括:第一輻射源，其用于發(fā)射具有激發(fā)波長的激發(fā)輻射；第一傳感器，其用于測量由激發(fā)輻射激發(fā)并具有熒光波長的熒光輻射的強度；以及計算單元，其用于依據(jù)熒光輻射的強度來確定熒光物質(zhì)的濃度。
【背景技術(shù)】
[0003]在現(xiàn)有技術(shù)中已知用于確定介質(zhì)中的焚光物質(zhì)的存在的方法，其中，對焚光物質(zhì)進行特定激發(fā)，以通過激發(fā)輻射來發(fā)射熒光輻射。對熒光輻射的強度進行測量，以便依據(jù)測量結(jié)果來推導(dǎo)出熒光物質(zhì)的存在。但是，因為僅在很少的情況下才可以由熒光輻射的強度推導(dǎo)出熒光物質(zhì)的濃度，所以一般不認為這樣的熒光測量是可靠的定量測量方法。例如在免疫學(xué)中，抗體設(shè)置有熒光化學(xué)基團，因此可以借助于熒光來識別抗體結(jié)合的位點。以這種方式還能夠進行對抗原的濃度的部分定量確定。
[0004]無論如何，實踐觀察顯示，通常無法在通過對熒光進行測量而進行濃度的確定中獲得所需的精度。例如，已經(jīng)觀察到，測量室的幾何形狀對測量精度有影響。在變化的時間條件下，也無法通過已知方法獲得令人滿意的結(jié)果。目前，該問題尚未得到解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]因此，本發(fā)明的目標為，創(chuàng)建之前所提及類型的能夠?qū)晒馕镔|(zhì)的濃度進行高度精確確定的方法和設(shè)備。具體而言，需要降低和/或消除測量室的幾何形狀對于測量精度的影響。另外，即使在變化的時間條件下，也應(yīng)當(dāng)能夠精確地進行濃度的確定。
[0006]為實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的目標，對激發(fā)輻射的透射部分的強度也進行測量，而熒光物質(zhì)的濃度根據(jù)激發(fā)輻射的透射部分的強度以及熒光輻射的強度來確定。
[0007]有益地，不僅如同之前的情況測量熒光，而且還考慮到，在具有熒光物質(zhì)的樣本中的激發(fā)光的吸收也對測量到的熒光輻射的強度有影響。吸收對于濃度的確定的影響力度會特別地取決于光在樣本中傳播的距離。因此，吸收的影響主要取決于測量室的幾何形狀。因為在之前所使用的測量熒光的方法中并沒有考慮到這些影響，所以這樣不能根據(jù)測量到的熒光強度來推導(dǎo)樣本中熒光物質(zhì)的濃度。相反，根據(jù)本發(fā)明的方法可以用作確定熒光物質(zhì)的濃度的高度精確的定量方法。已經(jīng)觀察到，在用于確定熒光物質(zhì)的濃度的方法中，吸收與熒光成比例地增加。這意味著，對熒光進行測量所需的激發(fā)光越多地穿透樣本介質(zhì)，其減弱越大，因此得到的熒光信號衰減。另外，在未知樣本中事實上經(jīng)常出現(xiàn)與熒光或引起熒光的物質(zhì)的濃度沒有因果聯(lián)系的在樣本中激發(fā)光的吸收。結(jié)果，單獨對熒光進行測量包含了系統(tǒng)中固有的誤差，而該誤差不能通過來自熒光的測量的信息而校正。根據(jù)本發(fā)明，該誤差通過對激發(fā)輻射的透射部分進行測量而消除，所述激發(fā)輻射的透射部分給出了關(guān)于激發(fā)輻射在穿過測量體積時的吸收的信息。于是，熒光物質(zhì)的濃度基于熒光以及激發(fā)輻射的透射而得到確定。如果樣本的渾濁和/或其他原因引起的(例如，添加反應(yīng)化學(xué)成分引起的)激發(fā)輻射的吸收增加，導(dǎo)致穿透介質(zhì)的激發(fā)輻射減弱并隨后導(dǎo)致熒光信號衰減，則該方法會尤其有益。當(dāng)單獨測量熒光時，不能從較低的熒光中區(qū)分出信號的變化，因此在確定濃度時獲得了不精確和/或不正確的結(jié)果。與此不同的是，同時對吸收和熒光進行測量的益處在于，激發(fā)輻射的透射部分可以用于修正由激發(fā)輻射在樣本中的吸收引起的非線性和不正確的測量。這在例如需要考慮容納樣本的測量室的不同的幾何形狀時是有益的。另外，在添加反應(yīng)化學(xué)成分(尤其是基質(zhì))之后，可以根據(jù)吸收與熒光之間的關(guān)系而表明關(guān)于所添加的反應(yīng)化學(xué)成分的定性狀態(tài)。本發(fā)明的另一益處在于，在較長的測量過程中，可以高精度地區(qū)分濃度的變化和樣本的透光率的變化。在此尤其優(yōu)選的是，在具有熒光物質(zhì)的介質(zhì)的相同的體積單元同時對熒光的強度和激發(fā)輻射的透射的強度進行測量。如果樣本是非均勻的或其狀態(tài)隨時間快速改變，則這會是尤其有益的。然而，對于穩(wěn)定且均勻的樣本(這樣的樣本同樣大量存在)，可以在同一的設(shè)備或者在分開的測量設(shè)備中(還是在同一時間)中一個接著另一個地對熒光與激發(fā)輻射的透射進行交替測量。
[0008]根據(jù)特別地優(yōu)選的實施方案，將具有熒光波長的熒光吸收輻射輻射通過具有熒光物質(zhì)的介質(zhì)，對熒光吸收輻射的透射部分的強度進行測量，并根據(jù)激發(fā)輻射的透射部分的強度、熒光輻射的強度以及熒光吸收輻射的透射部分的強度來確定熒光物質(zhì)的濃度。在該實施方案中，在熒光波長穿過樣本時樣本的透射和/或吸收因而用作了用于確定熒光物質(zhì)的濃度的進一步的輸入?yún)?shù)。在此，對熒光吸收輻射的透射部分的測量在激發(fā)輻射關(guān)閉的情況下進行，所以在熒光波長穿過樣本時樣本的透射可以根據(jù)由激發(fā)輻射激發(fā)的熒光而獨立確定。因此，在該實施方案中，熒光物質(zhì)的濃度根據(jù)由熒光輻射和激發(fā)輻射的透射以及熒光吸收輻射構(gòu)成的三元組的測量值確定。在此，激發(fā)輻射和/或熒光吸收輻射穿過具有熒光物質(zhì)的介質(zhì)時的透射作為校正值而增加至熒光信號。
[0009]為了獲得更精確的測量結(jié)果，優(yōu)選為對具有激發(fā)波長的散射光的強度也進行測量，并且焚光物質(zhì)的濃度根據(jù)激發(fā)福射的透射部分的強度、焚光福射的強度、散射光的強度，以及(如果可用的話，即如果測量了的話)熒光吸收輻射的透射部分的強度來確定。對散射輻射的測量特別地通過第三輻射傳感器進行，第三傳感器優(yōu)選為對激發(fā)波長敏感，并且/或在第三傳感器的上游設(shè)置了具有中心波長λ^的合適的帶通濾波器。
[0010]為了濃度的高度精確測量，熒光物質(zhì)的濃度優(yōu)選為根據(jù)一組特征曲線而確定:該特征曲線的組指示根據(jù)激發(fā)輻射的透射部分的強度、熒光輻射的強度以及(如果可用的話的，即，如果測量了的話的)熒光吸收輻射的透射部分的強度和/或散射光的強度的熒光物質(zhì)的濃度。該特征曲線的組可以經(jīng)驗性地獲得?；蛘?，可以使用將用于確定熒光物質(zhì)的濃度的輸入?yún)?shù)彼此關(guān)聯(lián)的計算模型。
[0011]另外，對于某些應(yīng)用場合有利的是，特征曲線的組還指示根據(jù)介質(zhì)的pH和/或溫度的熒光物質(zhì)的濃度，因而獲得相應(yīng)地更高維度的一組特征曲線。
[0012]在此尤其有利的是，特征曲線的組是通過在確定熒光物質(zhì)的濃度之前進行的測量方法而確定的，在該測量方法中，對于若干給定的熒光物質(zhì)的校準濃度中的每一個，而對測量熒光輻射的強度、激發(fā)輻射的透射部分的強度以及(如果可用的話)熒光吸收輻射的透射部分的強度和/或散射光的強度進行測量。有益地，這能夠確定熒光物質(zhì)的濃度與的輸入?yún)?shù)之間的明確的關(guān)系，所述關(guān)系對于測量設(shè)置是特定的，所述測量設(shè)置用于確定未知的熒光物質(zhì)濃度。為提高分辨率，有利的是，以本身已知的方式，通過近似曲線來對特征曲線的組的測量點進行插值。如果考慮到散射光，則對于相同的吸收和變化的散射的進行數(shù)次測量流程。作為對這樣的測量和/或校準方法的替選，也可以通過數(shù)學(xué)關(guān)系而獲得濃度與單個測量參數(shù)之間的關(guān)系。
[0013]為了提高測量精度，有利的是，在測量激發(fā)輻射的透射部分的強度之前，在穿過具有熒光物質(zhì)的介質(zhì)之后對激發(fā)輻射的透射部分重定向。這樣，可以以有益的方式避免當(dāng)在輻射穿過具有熒光物質(zhì)的介質(zhì)的方向上對激發(fā)輻射的透射進行測量時可能出現(xiàn)的干擾。
[0014]之前提及類型的設(shè)備的特征在于，設(shè)置了用于測量激發(fā)輻射的透射部分的強度的第二傳感器，并且具有設(shè)定用于根據(jù)激發(fā)輻