生物活性多肽的分析測試和鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白領(lǐng)域，具體涉及一種鑒別發(fā)酵乳中生物活性多肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 迄今為止鑒定生物活性肽常用的方法中，通常以某種生物活性為導(dǎo)向，在每次分 離后，鑒定活性并取活性較強部分，再次分離純化，最終鑒定活性強的部分產(chǎn)物中的多肽。 Cristian De Gobba等人鑒定來源于羊奶的抗氧化生物活性肽：首先，將水解物通過排阻色 譜法分級，用選定的生物活性測定方法測定每部分的活性（如：體外的抗氧化活性）；然后 將活性強的部分隨后用半制備反相高效液相色譜法進一步分離，進行活性測定；最后，將分 離得到的活性最強的部分用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定序列。
[0003] 然而，以生物活性為主導(dǎo)進行分級分離的策略會在每次分離的過程中造成損失， 因而忽略了一些低濃度的活性物質(zhì)。特別是，酸奶在發(fā)酵過程中產(chǎn)生一系列復(fù)雜多樣的多 肽混合物，來源于含量不一的牛奶蛋白前體，包括a si-酪蛋白、a s2_酪蛋白、β-酪蛋白、 K-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和牛血清白蛋白，它們之間的相對含量之比大約為 30:30:10:12:10:4:1，因此采用傳統(tǒng)方法來源于低濃度蛋白前體的多肽很難被鑒定得到。
[0004] 因此，為了得到盡可能多的生物活性物質(zhì)，本文通過簡單的前處理，包括超濾、固 相萃取，用模擬人體胃腸道消化實驗對處理發(fā)酵乳，以保證驗證得到的肽在一定程度上具 有抵制水解的能力后，不經(jīng)多次分級分離，直接用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜 儀分析，以期得到更豐富、濃度相對較低的多肽物質(zhì)。此外，本文還建立了一種鑒定發(fā)酵乳 及其消化產(chǎn)物中多肽的方法，為低濃度生物活性肽的鑒定奠定了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種鑒別發(fā)酵乳中生物活性多肽 的方法，具體包括如下步驟：
[0006] 1)多肽的粗提：取發(fā)酵乳進行低溫離心分離，取上清液；
[0007] 2)多肽的純化：
[0008] c.對步驟1)的上清液進行超濾處理，收集濾液；
[0009] d.固相萃取柱分離：收集的濾液采用Waters Sep-pak C18固相萃取柱萃取，收集 生物活性多肽混合物；
[0010] 3)多肽的消化及穩(wěn)定性：采用兩步酶解法酶解步驟2)的生物活性多肽混合物，第 一步酶解所采用的酶為胃蛋白酶，第二步酶解所采用的酶為胰酶；
[0011] 4)將步驟3)得到的產(chǎn)物進行超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜UPLC-MS聯(lián) 用分析，得到生物活性多肽的相對分子量；
[0012] 5)建立牛奶來源蛋白氨基酸序列數(shù)據(jù)庫；
[0013] 6)將步驟4)中UPLC-MS分析得到的相對分子質(zhì)量，在牛奶來源蛋白氨基酸序列數(shù) 據(jù)庫中進行搜索，得到預(yù)測多肽序列；
[0014] 7)驗證生物活性多肽的序列：將步驟6)中所得預(yù)測多肽序列的理論二級質(zhì)譜圖 與UPLC-MS得到的實際二級質(zhì)譜圖對比分析，通過二級質(zhì)譜圖中的離子碎片峰的匹配情 況，確認預(yù)測多肽序列是否正確。
[0015] 較優(yōu)的，步驟1)所述發(fā)酵乳為瑞士乳桿菌發(fā)酵乳。
[0016] 更優(yōu)的，所述瑞士乳桿菌發(fā)酵乳為將瑞士乳桿菌添加到脫脂乳中進行厭氧發(fā)酵 而獲得；所述厭氧發(fā)酵的條件為：發(fā)酵溫度36~38°C，發(fā)酵培養(yǎng)6~8h ;更優(yōu)選發(fā)酵溫度 37°C，發(fā)酵培養(yǎng)7h。
[0017] 優(yōu)選的，所述瑞士乳桿菌為瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus，CICC6024)。
[0018] 本發(fā)明所述脫脂乳為經(jīng)過脫脂處理的牛乳，通常脫脂乳中脂肪含量小于0. 1%。
[0019] 較優(yōu)的，步驟1)中，所述低溫離心的條件為：4°C，8000~lOOOOrpm，離心15~ 30min〇
[0020] 較優(yōu)的，步驟2) a中，所述超濾處理所采用的是截留分子量分別為3kDa的超濾管。
[0021] 更優(yōu)的，步驟2) a中，所述超濾處理過程中，轉(zhuǎn)速為4800r/min，時間為30min，離心 溫度為4°C。
[0022] 較優(yōu)的，步驟2)b中，固相萃取柱分離，具體方法為：活化和平衡Waters Sep-pak C18固相萃取柱；將步驟3) a中收集的濾液進行稀釋后上樣，采用洗脫液洗脫，收集所得到 的洗脫液，即包含生物活性多肽混合物。
[0023] 較優(yōu)的，步驟2)b中，固相萃取柱分離法中，所采用的洗脫液為甲醇和CldH2O的混 合液，所述甲醇和CldH 2O的混合液中甲醇與CldH2O的體積比為80:20,所述甲醇和CldH2O的混 合液中含有0.1% (v/v)的甲酸。
[0024] 較優(yōu)的，步驟2)b中，固相萃取柱分離法中，采用甲醇活化Waters Sep-pak C18固 相萃取柱；優(yōu)選2ml甲醇。
[0025] 較優(yōu)的，步驟2)b中，固相萃取柱分離法中，采用ddH20平衡Waters Sep-pak C18 固相萃取柱；優(yōu)選2mlddH20。
[0026] 較優(yōu)的，步驟2)b中，固相萃取柱分離法中，將步驟3)a中收集的濾液進行稀釋50 倍后上樣，采用400ul洗脫液洗脫。
[0027] 較優(yōu)的，步驟2)b固相萃取柱分離法中，先采用2mL甲醇活化Waters Sep-pak C18 固相萃取柱，采用2mLddH20平衡Waters Sep-pak C18固相萃取柱；上樣樣品為2mL;將步 驟3) a中收集的濾液稀釋50倍，采用400 μ L洗脫液洗脫。
[0028] 較優(yōu)的，步驟3)所述兩步酶解法具體步驟為將步驟2)得到的含有多肽的混合 物溶于滅菌去離子水中，并加入胃蛋白酶，獲得反應(yīng)液，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值為1. 9~2. 1，在 36. 5~38. 5°C的恒溫水浴中保溫反應(yīng)60~120min，獲得第一步酶解液；將第一步酶解液 的pH值調(diào)整為7. 4~7. 6,并加入胰酶，于36. 5~38. 5°C的恒溫水浴中保溫反應(yīng)120~ 180min，獲得第二步酶解液；將第二步酶解液采用95~KKTC水浴法加熱使酶失活，獲得酶 解產(chǎn)物；酶解產(chǎn)物冷凍干燥獲得產(chǎn)品。
[0029] 優(yōu)選的，第二步酶解液采用95~100°C加熱的時間為5min。
[0030] 較優(yōu)的，步驟3)所述胃蛋白酶的添加量為胃蛋白酶10~30mg/g底物；所述胰酶 的添加量為胰酶30~50mg/g底物。
[0031] 更優(yōu)的，步驟3)所述胃蛋白酶的添加量為胃蛋白酶20mg/g底物；所述胰酶的添加 量為胰酶40mg/g底物。
[0032] 較優(yōu)的，步驟6)具體實現(xiàn)的方法為：將UPLC-MS得到的相對分子質(zhì)量，與已建立的 牛奶來源蛋白氨基酸序列數(shù)據(jù)庫中氨基酸序列對應(yīng)的相對分子量匹對，得到相對分子質(zhì)量 誤差在±0.0 lDa內(nèi)的生物活性多肽的序列、該序列的相對分子質(zhì)量以及該序列的具體蛋 白來源，以此作為預(yù)測多肽序列。
[0033] 優(yōu)選的，步驟7)中所得預(yù)測多肽序列的理論二級質(zhì)譜圖是指步驟6)中，所得預(yù)測 多肽序列的理論二級質(zhì)譜圖。
[0034] 進一步的，以a -SI-酪蛋白為例，來說明本發(fā)明所使用的具體的程序代碼：
[0035] a)程序和數(shù)據(jù)庫的選擇
[0036] JAVA+MySQL
[0037] b)數(shù)據(jù)庫結(jié)構(gòu)
[0038]
[0039] 注意：數(shù)據(jù)庫中保存的quality是氨基酸片段質(zhì)量乘以10000之后的結(jié)果。c)插 入氨基酸片段的分析（以a - Sl -酪蛋白為例）
[0040] 1.代碼片段 [0041 ]






[0053] 本發(fā)明第二方面公開了前述方法在生物活性多肽鑒別中的應(yīng)用。
[0054] 本發(fā)明的有益效果為：
[0055] (1)采用本發(fā)明的方法，對發(fā)酵乳進行了有效的前處理后，共得到1374種低分子 量化合物，證實了經(jīng)本實驗室的瑞士乳桿菌發(fā)酵得到的酸奶中物質(zhì)的復(fù)雜性以及質(zhì)譜檢測 器優(yōu)越的靈敏度和分離性。
[0056] (2)本發(fā)明在UPLC-MS分析前，對發(fā)酵乳進行胃腸道消化模擬實驗，因此最終得到 的多肽序列對消化酶有良好的耐受性，在一定程度上能抵抗其水解作用。
[0057] (3)本發(fā)明對發(fā)酵乳進行了有效的前處理后，進行胃腸道消化模擬實驗，保證盡可 能多的得到消化產(chǎn)物中的多肽，特別是濃度低的多肽，并且得到的多肽序列一定程度上具 有抵抗水解的作用，更利于人體吸收并發(fā)揮其生物活性。同時，還建立了一種通過分子量匹 配得到預(yù)測序列，再通過計算驗證預(yù)測多肽序列的方法。通過這種方法鑒定得到牛奶蛋白 來源多肽共119條，除已經(jīng)被報道過的生物活性肽外，還得到了大量未被前人報道過的多 肽。該方法能普遍用于復(fù)雜基質(zhì)中生物活性肽的分析鑒定，比如發(fā)酵乳。
【附圖說明】
[0058] 圖1 :發(fā)酵乳消化產(chǎn)物質(zhì)量色譜圖
[0059] 圖2 :質(zhì)荷比為615. 37Da的質(zhì)量色譜圖及一級質(zhì)譜圖
[0060] 圖3 :質(zhì)荷比為615. 37Da的片段的二級質(zhì)譜匹對圖
[0061] 圖4 :質(zhì)荷比為615. 37Da的預(yù)測多肽az，by斷裂情況
[0062] 圖5 :質(zhì)荷比為544. 38Da的質(zhì)量色譜圖及一級質(zhì)譜圖
[0063] 圖6 :質(zhì)荷比為615. 37Da的片段的二級質(zhì)譜匹對圖
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