一種用于溶解氧檢測的產(chǎn)品及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及溶解氧測定領(lǐng)域，特別涉及一種采用生物氧化酶測定溶解氧的試紙、 試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水中的溶解氧是水生動植物生存的最基本條件，也是其它行業(yè)必須監(jiān)控的重 要參數(shù)。溶解氧的測定在水產(chǎn)養(yǎng)殖、臨床醫(yī)學、環(huán)境保護、食品衛(wèi)生等各個行業(yè)都具有 重要意義。以水產(chǎn)養(yǎng)殖為例，魚類生活在水中，用鰓進行氣體交換，故水中溶氧的多少 直接影響著魚類的新陳代謝。當水中的溶氧量充足時，魚攝食旺盛，消化率高，生長 快。當水中的溶氧量過少時，魚的正常活動就會受到影響，嚴重缺氧時可引起魚的死 亡。對于大部分魚類來說，要求水中溶氧量不應(yīng)低于4mg/L，低于2mg/L，就會產(chǎn)生輕 度浮頭；當降至〇. 6-0. 8mg/L時，就會產(chǎn)生嚴重浮頭；當降至0. 3mg/L以下時，魚就會 開始死亡。目前測定溶解氧所用的方法包括碘量法（碘量法測定水中的溶解氧，國標 BG7489-87. ,Lide,DavidR. ,CRCHandbookofChemistryandPhysics87th,Boca Raton，F(xiàn)l:CRCPress, 2006,ISBN0-8493-0487-3)、電極法（ClarkJr，LC;Wolf，R; Granger,D；Taylor,Z(1953).Journalofappliedphysiology,6 (3): 189 - 93., Severinghaus,Jff；Astrup,PB(1986).Journalofclinicalmonitoring, 2(2):125 - 39)、 分光光度法（Zollinger,H. ,ColorChemistry:Syntheses,propertiesandapplications oforganicdyeandpigments,ffiley-VCH, 2004. ,Goodfellow,G.I.Webber,H. M. ,Analyst, 1979, 104, 1105-1118)和焚光光學傳感器（Hamlin,P.A. ,Lambert,J.L. ,Anal. Chem. , 1971, 63, 618-620. ,Wang,X.D. ,ffolfbeis, 0.S.Chem.Soc.Rev. 2014, 43, 3666-3761) 等。碘量法需要繁雜的滴定操作，非專業(yè)人員很難完成。其它三種方法要求與昂貴和復雜 的儀器相配套，不適合野外和非專業(yè)人員使用。本發(fā)明涉及一種水中的溶解氧的簡便和快 速檢測方法及產(chǎn)品，借助一種氧化酶及其相應(yīng)的底物，通過氧化反應(yīng)消耗水中的溶解氧，產(chǎn) 生等當量的過氧化氫，所產(chǎn)生的過氧化氫再把成色分子或基團氧化成有色產(chǎn)物，通過觀察 產(chǎn)物的顏色變化或熒光變化，得出樣品中的溶解氧含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的一個目的是提供一種便攜、效率高、靈敏度好的用于溶解氧檢測的簡便 快速的產(chǎn)品。
[0004] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種簡便、快速、準確率高的溶解氧檢測方法及其在 水環(huán)境中溶解氧檢測中的應(yīng)用。
[0005] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] -種用于溶解氧測定的試紙，其特征在于：包括與氧氣反應(yīng)生成過氧化氫的氧化 酶及相應(yīng)酶底物，以及與過氧化氫反應(yīng)生成有顏色或帶熒光的化合物的顯色劑；其中，所述 氧化酶及相應(yīng)酶底物，顯色劑負載在載體上，制備成試紙。
[0007] 優(yōu)選的，所述氧化酶及相應(yīng)酶底物選自以下組中的一種或多種：葡萄糖氧化酶及 葡萄糖、乳酸氧化酶及乳酸、L-氨基酸氧化酶及L-氨基酸、D-氨基酸氧化酶及D-氨基酸、 L-a-羥基酸氧化酶及L-a-羥基酸、尿酸氧化酶及尿酸、醇類氧化酶及醇、醛類氧化酶及 醛等。更優(yōu)選的，所述醇類氧化酶及醇包括但不限于：膽固醇氧化酶及膽固醇、乙醇氧化酶 及乙醇等；所述醛類氧化酶及醛包括但不限于：乙二醛氧化酶及乙二醛、視黃醛氧化酶及 視黃醛、牛醛氧化酶及牛醛等。
[0008] 優(yōu)選的，所述顯色劑為
車中&、R2、R3、R4、R5、R6、 R7、Rs獨立的選自H、C「(：3的烷基、NH2，更優(yōu)選的RpR2、R3、R4、R5、R6、R7、Rs獨立的選自H、CH3、NH2，最優(yōu)選的，顯色劑為4, 4' -二氨基聯(lián)苯，3, 5, 3'，5' -四甲基-4, 4' -二氨基聯(lián)苯， 3, 4, 3'，4' -四氨基聯(lián)苯，3'，3' -二甲基-4, 4' -二氨基聯(lián)苯等；
[0009] 或者所述的顯色劑為由4-氨基安替比林與
組成試劑對，其中 馬選自詘或順2，1?1。、1?11、1? 12、1?13、1?14獨立的選自11、鹵素、羧基、磺酸基、羥基和甲氧基。優(yōu) 選的，所述M
為苯酚、苯胺、羧基苯酚、羧基苯胺。
[0010] 優(yōu)選的，所述載體為纖維素及其衍生物紙張，例如實驗室常規(guī)濾紙。
[0011] 優(yōu)選的，所述載體上還負載催化劑和/或緩沖液；所述催化劑包括辣根過氧化物 酶、鐵基化合物等能夠催化過氧化氫與顯色劑反應(yīng)的物質(zhì)；所述緩沖液選自磷酸鹽緩沖液、 醋酸-醋酸鹽緩沖液、PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液等。
[0012] 優(yōu)選的，所述載體上氧化酶的負載量為0. 5-50U，更優(yōu)選的，為3-20U。本領(lǐng)域技術(shù) 人員知曉，載體上氧化酶的負載量不限于上述具體數(shù)值，可以根據(jù)具體測量中測試瓶的體 積進行適當調(diào)整。
[0013] 優(yōu)選的，所述試紙的制備方法如下：將氧化酶加入水中至全部溶解，得到溶液一； 將酶底物、顯色劑加入水中至全部溶解，得到溶液二；向濾紙上滴加溶液一，室溫晾干，得到 試紙一；另取濾紙，滴加溶液二，30°c~45°C下至濾紙烘干，得到試紙二。更優(yōu)選的，烘干時 間小于12小時。
[0014] 本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，在制備試紙時，溶液一和/或溶液二中還可包括催化劑和/ 或緩沖液。
[0015] 本發(fā)明還提供一種用于溶解氧測定的比色卡，所述比色卡通過如下步驟制備：
[0016] (1)向盛有水的容器中分別通入不同氧氣濃度的氣體，持續(xù)通入氣體直至水中溶 解氧濃度測量值穩(wěn)定；
[0017] (2)取步驟（1)水樣分別加入相同體積溶解氧測試瓶中，水樣加滿測試瓶，測試瓶 中無氣泡，蓋緊瓶蓋，搖晃后靜置2-5min，觀察顏色變化；所述測試瓶內(nèi)置有試紙；
[0018] (3)記錄不同溶解氧濃度的水樣顏色制作成溶解氧比色卡。
[0019] 具體的，可通過如下步驟制備：取8個200mL燒杯，加入自來水，向水中分別通入不 同氧氣濃度的氣體：純氮氣，2. 5 %氧氣+97. 5 %氮氣混合氣體，5 %氧氣+95 %氮氣混合氣 體，10%氧氣+90%氮氣混合氣體，15%氧氣+85%氮氣混合氣體，壓縮空氣（20. 8%氧氣）， 35%氧氣+65%氮氣混合氣體和氧氣，持續(xù)通入氣體10-30min;用儀器測試水中的溶解氧 濃度，直至測量值穩(wěn)定；每個燒杯中取水樣分別加入相同體積溶解氧測試瓶中，水樣加滿測 試瓶，測試瓶中無氣泡，蓋緊瓶蓋，將瓶子上下翻轉(zhuǎn)，搖晃，靜置5分鐘，觀察顏色變化；所述 測試瓶內(nèi)放置有負載氧化酶、相應(yīng)酶底物及顯色劑的試紙，所述氧化酶能夠催化酶底物與 氧氣反應(yīng)生成過氧化氫；所述顯色劑能與過氧化氫反應(yīng)生成有顏色或帶熒光的化合物；拍 攝5min時不同溶解氧濃度的水樣，將照片制作成溶解氧比色卡。
[0020] 本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，上述容器的體積及個數(shù)、氧氣濃度、靜置及拍攝時間等的具 體參數(shù)僅用于示例性說明本發(fā)明溶解氧比色卡的制作方法，并不用于限定本發(fā)明。本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以依據(jù)實際需求作適應(yīng)性調(diào)整和改動。
[0021] 此外，本發(fā)明還提供一種用于溶解氧測定的試劑盒，包括氧化酶及相應(yīng)酶底物，顯 色劑；其中所述氧化酶能夠催化酶底物與氧氣反應(yīng)生成過氧化氫；所述顯色劑能與過氧化 氫反應(yīng)生成有顏色或帶熒光的化合物。
[0022] 優(yōu)選的，所述氧化酶及相應(yīng)酶底物選自以下組中的一種或多種：葡萄糖氧化酶及 葡萄糖、乳酸氧化酶及乳酸、L-氨基酸氧化酶及L-氨基酸、D-氨基酸氧化酶及D-氨基酸、 L-a-羥基酸氧化酶及L-a-羥基酸、尿酸氧化酶及尿酸、醇類氧化酶及醇、醛類氧化酶及 醛等。更優(yōu)選的，所述醇類氧化酶及醇包括但不限于：膽固醇氧化酶及膽固醇、乙醇氧化酶 及乙醇等；所述醛類氧化酶及醛包括但不限于：乙二醛氧化酶及乙二醛、視黃醛氧化酶及 視黃醛、牛醛氧化酶及牛醛等。
[0023]優(yōu)選的，所述顯色劑，
其中&、R2、R3、R4、R5、R6、 R7、Rs獨立的選自H、C「(：3的烷基、NH2，更優(yōu)選的RpR2、R3、R4、R5、R6、R7、Rs獨立的選自H、CH3、NH2，最優(yōu)選的，顯色劑為4, 4' -二氨基聯(lián)苯，3, 5, 3'，5' -四甲基-4, 4' -二氨基聯(lián)苯， 3, 4, 3'，4' -四氨基聯(lián)苯，3'，3' -二甲基-4, 4' -二氨基聯(lián)苯等；
[0024] 或者所述的顯色劑為由4-氨基安替比林與
&成試劑對，其中 馬選自詘或順2，1?1。