高效液相色譜法測定金霉素預(yù)混劑含量及相關(guān)物質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分析測試領(lǐng)域，涉及一種預(yù)混劑含量及相關(guān)物質(zhì)的檢測方法，特別涉 及一種高效液相色譜法測定金霉素預(yù)混劑含量及相關(guān)物質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 金霉素預(yù)混劑是金霉素生產(chǎn)菌的全發(fā)酵液與適量碳酸鈣制成的金霉素鈣鹽，其中 的藥物成分主要是金霉素，但是，也含有一些相關(guān)的發(fā)酵副產(chǎn)物，如四環(huán)素，差向金霉素等。 其金霉素含量測定一般采用微生物檢測法（獸藥國家標(biāo)準收載）。實踐表明，采用微生物法 測定含量有幾個弊端：1)方法繁瑣，耗時較長，造成工作效率低；2)方法的影響因素多，對 測試的準確度有較大的影響，測試的重復(fù)性與再現(xiàn)性也相對較差；3)測試成本較高；4)不 能同時測定其中的相關(guān)物質(zhì)。
[0003] 《中國藥典》（2005版）收載了鹽酸金霉素，其含量及相關(guān)物質(zhì)檢測采用HPLC法， 可以用于金霉素預(yù)混劑的測定，但是，其色譜條件比較復(fù)雜、苛刻，流動相使用草酸銨、磷酸 氫二銨及二甲基甲酰胺的混合溶液（用氨試液調(diào)PH8. 3)。該方法雖然比微生物檢測法方 便、快捷，但是具有如下缺點：1)流動相PH8.3為堿性條件，金霉素在堿性條件下極不穩(wěn)定， 易氧化降解；2)使用含鹽流動相，鹽類很容易結(jié)晶吸出，造成儀器系統(tǒng)配件磨損，縮短儀器 的壽命，對色譜系統(tǒng)的維護保養(yǎng)不利，不適宜長期使用；3) -般色譜柱允許流動相的pH為 2. 0-7. 5,而該方法流動相的pH為8. 3,需要配備耐堿性的專用色譜柱，造價較一般色譜柱 要高。
[0004] 《中國藥典》（2010版）收載的鹽酸金霉素，含量及相關(guān)雜質(zhì)檢測仍采用HPLC法， 也可以用于金霉素預(yù)混劑的檢測，該方法雖然克服了 2005版的缺點，調(diào)整了色譜條件，將 流動相改為酸性條件；但是，其流動相仍然比較苛刻，使用高氯酸、水和二甲亞砜混合溶液。 高氯酸為強氧化性酸，長期使用會使儀器系統(tǒng)造成腐蝕，縮短色譜柱及儀器的壽命，仍然對 儀器的維護保養(yǎng)不利，不適宜長期使用；另外一個缺點就是，二甲亞砜的價格較貴約為二甲 基甲酰胺價格的二倍，長期使用，成本也較高。
[0005] 針對上述情況，需要發(fā)明一種既可以進行準確可靠的測試，又能在長期使用中有 利于儀器的維護保養(yǎng)，還能夠節(jié)約成本的經(jīng)濟實惠的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測效率高、準確可靠的運用高效液相色 譜法檢測金霉素預(yù)混劑含量及相關(guān)物質(zhì)的方法，本檢測方法對儀器磨損、腐蝕較小，實驗成 本低，適宜于長期使用。
[0007] 為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0008] 高效液相色譜法測定金霉素預(yù)混劑含量及相關(guān)物質(zhì)的方法，采用如下色譜條件：
[0009] 色譜柱：（C18, 5um)色譜柱；
[0010] 流動相：以體積比為63~77:1. 8~2. 2:25~30的水、磷酸、N，N-二甲基甲酰胺 的混合溶液為流動相，所述磷酸濃度為2mol/L;
[0011] 流速：0? 8 ~1. 2ml/min;
[0012] 檢測波長：270 ~400nm;
[0013] 柱溫：30 ~4(TC;
[0014] 優(yōu)選的，所述流動相中水、磷酸、N，N-二甲基甲酰胺的體積比為70 :2 :28。
[0015] 優(yōu)選的，檢測條件中流速為lmL/min，檢測波長為365nm，柱溫為35°C。
[0016] 金霉素預(yù)混劑中相關(guān)物質(zhì)包括四環(huán)素和差向金霉素。
[0017] 檢測方法通過以下步驟實現(xiàn)：
[0018] (1)標(biāo)品溶液配制：取金霉素標(biāo)準品、四環(huán)素標(biāo)準品、差向金霉素標(biāo)準品用 0.Olmol/L鹽酸稀釋分別配制成標(biāo)品溶液，過0. 22iim濾膜，備供試標(biāo)品溶液用；
[0019] (2)金霉素預(yù)混劑試樣品溶液配制：取金霉素預(yù)混劑樣品用0.Olmol/L鹽酸稀釋 配制成試樣品溶液，過〇. 22ym濾膜，備供試樣品溶液用；
[0020] (3)取相同體積的供試標(biāo)品和樣品溶液，注入高效液相色譜儀，按照所述的條件進 行高效液相色譜分析。
[0021] 用峰面積外標(biāo)法計算相關(guān)物質(zhì)含量：
[0022] 金霉素預(yù)混剤試樣溶液中對應(yīng)組分濃度=標(biāo)標(biāo)準品純度 .A標(biāo)
[0023] A樣:樣品中相應(yīng)組分的峰面積；
[0024] A標(biāo):相應(yīng)標(biāo)品的峰面積；
[0025] C標(biāo):相應(yīng)標(biāo)品溶液的濃度。
[0026] 優(yōu)選的，所述金霉素標(biāo)品溶液濃度為200yg/mL，所述四環(huán)素標(biāo)品溶液濃度為 16yg/mL，所述差向金霉素標(biāo)品溶液濃度為12yg/mL，所述金霉素預(yù)混劑試樣品溶液溶度 為 1 ~2mg/mL〇
[0027] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0028] (1)色譜條件相對溫和（流動相不含易結(jié)晶的鹽類，也不使用強酸），有利于儀器 的維護保養(yǎng)，降低了儀器的長期、連續(xù)使用而導(dǎo)致磨損與腐蝕，可以延長儀器的壽命，提高 儀器的利用率；
[0029] ⑵測試準確度高，金霉素含量測定回收率可達到99%~101%，其他物質(zhì)測定回 收率可達98%~102% ;
[0030] (3)精度高，各組分測試的重復(fù)性RSD小于0. 5% ;含量測定的再現(xiàn)性RSD小于 1 %，相關(guān)物質(zhì)測定的再現(xiàn)性RSD小于3%;
[0031] (4)有較寬的線性測試范圍，完全滿足各種規(guī)格的金霉素預(yù)混劑的測定。金霉素在 5yg/ml~500yg/ml的濃度范圍內(nèi)，具有很好的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2可達0. 99998,定 量限可達1. 1yg/ml，檢測限可達0. 30yg/ml;相關(guān)物四環(huán)素在4yg/ml~40yg/ml的濃 度范圍內(nèi)，具有很好的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2可達0. 99992,定量限可達0. 45yg/ml，檢 測限可達〇. 13yg/ml;相關(guān)物差向金霉素在3yg/ml~30yg/ml的濃度范圍內(nèi)，具有很好 的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2可達0. 99945定量限可達1. 4yg/ml，檢測限可達0. 39yg/ml;
[0032](5)專屬性強，HPLC分離測試過程主成分金霉素和各相關(guān)雜質(zhì)互不干擾，分離度 均大于1. 6,對各組分峰進行純度測定，純度指數(shù)均為正值；
[0033] (6)耐用性好，色譜條件的微小變化，不影響測試的準確性，可以使用不同品牌的 C1S色譜柱，同時調(diào)整二甲基甲酰胺的比例以達到組分的最佳分離。
【附圖說明】
[0034] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進行 說明：
[0035] 圖1為測定濃度為200ug/mL的金霉素標(biāo)準液的譜圖；
[0036] 圖2為測定濃度為16. 00ug/mL的四環(huán)素和濃度為12. 00ug/mL的差向金霉素混合 標(biāo)準液的譜圖；
[0037] 圖3為測定金霉素預(yù)混劑樣品溶液的譜圖。
【具體實施方式】
[0038] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。
[0039] 檢測儀器及條件：
[0040] 島津LC-20系列高效液相色譜儀，SH)-M20A檢測器；
[0041] 色譜柱：C18,5y，4.6X150mm;
[0042] 柱溫控制：35°C;
[0043] 檢測波長：紫外365nm;
[0044] 流動相：水：2mol/L磷酸溶液：N，N-二甲基甲酰胺=70 :2 :28 (體積比）；
[0045] 栗流量：1.OOml/min;
[0046] 定量體積：20yL;
[0047] 純化水（HPLC級）、鹽酸（優(yōu)級純）、磷酸（優(yōu)級純）、N，N-二甲基甲酰胺（色譜 純）
[0048] 流動相溶液的配備：取純化水700ml，加入2mol/L磷酸溶液20ml混合均勻，然后 加入N，N-二甲基甲酰胺280ml，用真空抽濾器經(jīng)0. 45ym膜過濾，備用。
[0049] 1、檢測標(biāo)準品儲備液配制
[0050] 自冰箱中取出金霉素，四環(huán)素，差向金霉素標(biāo)準品，置于干燥器中，放置到室溫后 稱量使用。
[0051] a、金霉素標(biāo)準品儲備液：精密稱取金霉素標(biāo)準品50.Omg至50ml容量瓶，用 0.Olmol/LHCl溶解，并稀釋至刻度制備成濃度為lmg/mL的金霉素標(biāo)準品儲備液，冰箱中 2~8°C下保存最多7天；