釹離子敏化上轉(zhuǎn)換納米晶新用途及高分辨多光子顯微系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于光學顯微技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種釹離子敏化上轉(zhuǎn)換納米晶新用途及高分辨多光子顯微系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]在現(xiàn)代光學成像技術(shù)中，借助探針標記的熒光顯微鏡，尤其是基于熒光單光子過程的激光掃描共聚焦顯微鏡，憑借高分辨率(約200納米)已經(jīng)在醫(yī)學、生命科學和材料科學領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。然而，共聚焦顯微鏡也有不少缺陷，如系統(tǒng)相對復雜，紫外、藍光激發(fā)易損傷生物樣品，成像深度十分有限(幾十微米)，難以避免生物樣品自發(fā)熒光的干擾，樣品易光漂白等。基于一些生物樣品及材料非線性激發(fā)下的天然“光學切片”能力，人們提出了雙光子掃描顯微鏡，這種顯微系統(tǒng)相對容易搭建，近紅外激發(fā)光也能減小生物光損傷并能提高成像深度(幾百微米，甚至毫米)，在一定程度上解決了共聚焦顯微系統(tǒng)存在的問題。然而，近紅外(大于800納米)激發(fā)的雙光子熒光顯微鏡分辨率相對不高的分辨率(微米量級)嚴重限制了其在生物顯微成像中的應(yīng)用。這一低分辨率是由其理論計算公式d= 1.22λ/2ΝΑ(Ν)ν2所制約的，其中λ是激發(fā)光波長，NA是顯微物鏡的數(shù)值孔徑，N是多光子成像的非線性階數(shù)(雙光子成像中N= 2)。理論上，通過減小激發(fā)光波長，增大顯微物鏡數(shù)值孔徑和多光子非線性階數(shù)都可以提高分辨率，而機械上的顯微物鏡數(shù)值孔徑已經(jīng)很難繼續(xù)提高，因此，用更短激發(fā)波長進行更高階多光子成像成為提高多光子顯微鏡分辨率的必然選擇。
[0003]然而，多數(shù)熒光物質(zhì)的非線性多光子(雙光子、三光子、四光子)激發(fā)截面非常小，使用超高峰值功率的飛秒脈沖激光器可以獲得更強的多光子熒光，但高昂的光源費用(?$200，000)限制了它的廣泛推廣，同時使用短波長激發(fā)下的三光子、四光子熒光波長又通常落在紫外波段，對檢測光路與探測器要求高，這都不利于進行短波長激發(fā)下的多光子高分辨率顯微成像。雖然已有提出穩(wěn)態(tài)激光栗浦的低成本雙光子顯微鏡，但是近紅外波長(大于800納米)激發(fā)的低階雙光子成像時分辨率仍不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的第一個目的就是克服現(xiàn)有的研究方向偏見，提供一種釹離子敏化的上轉(zhuǎn)換納米材料在多光子顯微成像中的用途，所述釹離子敏化的上轉(zhuǎn)換納米材料由中心波長< 800nm的穩(wěn)態(tài)連續(xù)激光激發(fā)，在得到的多光子熒光光譜中，多光子發(fā)射峰均在可見光范圍內(nèi)。
[0005]相較于傳統(tǒng)的鐿離子敏化的上轉(zhuǎn)換納米晶，釹離子敏化的上轉(zhuǎn)換納米材料有很好的光穩(wěn)定性，從光譜中可知，無論是激發(fā)光譜還是多光子(三光子、四光子)發(fā)射光譜，都可以選取在可見光范圍內(nèi)的短波長進行成像和探測。更重要的是這種材料相比傳統(tǒng)上轉(zhuǎn)換材料具有更大的多光子吸收截面，具有明顯更大的多光子激發(fā)飽和功率，能夠產(chǎn)生更強的多光子熒光，因此可以使用廉價的穩(wěn)態(tài)激光器，普通的光電探測器來進行多光子顯微成像，不僅可以提高現(xiàn)有的多光子顯微成像分辨率，同時大幅降低系統(tǒng)成本，解決共聚焦顯微鏡、雙光子焚光顯微鏡存在的一些問題，為生命科學、醫(yī)學和材料科學研究提供一種新的方法。
[0006]根據(jù)上述用途搭建一多光子顯微成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括中心波長< SOOnm的穩(wěn)態(tài)連續(xù)二極管激光器、顯微鏡光學系統(tǒng)和載物臺，所述顯微鏡光學系統(tǒng)包括擴束透鏡組、掃描振鏡、短通二向色鏡、熒光濾光片、光電探測器和物鏡，樣品放置在載物臺上，穩(wěn)態(tài)連續(xù)二極管激光器產(chǎn)生的短波長連續(xù)激光耦合進入所述顯微鏡光學系統(tǒng)中，沿該激光束前進方向上依次放置擴束透鏡組、掃描振鏡和短通二向色鏡，其中短通二向色鏡與該激光束成45°角放置；在垂直于該激光束且穿過該短通二向色鏡的光軸方向上，在該短通二向色鏡上方同軸地依次放置有熒光濾光片和光電探測器，在該短通二向色鏡下方放置有物鏡，釹離子敏化的上轉(zhuǎn)換納米材料樣品放置在載物臺上物鏡的焦點處；短通二向色鏡使激發(fā)光反射、釹離子敏化的上轉(zhuǎn)換納米材料產(chǎn)生的多光子熒光透射。
[0007]優(yōu)選的，所述穩(wěn)態(tài)連續(xù)二極管激光器發(fā)射的激發(fā)光波長為720?740nm，所述短通二向色鏡用于反射波長大于670nm的激發(fā)光，透射波長小于670nm的多光子熒光。
[0008]優(yōu)選的，所述穩(wěn)態(tài)連續(xù)二極管激光器發(fā)射的激發(fā)光波長為730nm時，釹離子敏化的上轉(zhuǎn)換納米材料產(chǎn)生的多光子熒光光譜中，465-480nm波段為該樣品的三光子發(fā)光峰，450-460nm波段為該樣品的四光子發(fā)光峰，645_680nm波段為該樣品的雙光子發(fā)光峰。
[0009]更進一步的，所述多光子顯微成像系統(tǒng)用于進行單顆粒的雙光子成像時，穩(wěn)態(tài)連續(xù)二極管激光器發(fā)射的激發(fā)光波長為730nm，焦面處功率為lmW，選取645_680nm波段熒光進行探測。
[0010]更進一步的，所述多光子顯微成像系統(tǒng)用于進行單顆粒的三光子成像時，穩(wěn)態(tài)連續(xù)二極管激光器發(fā)射的激發(fā)光波長為730nm，焦面處功率為100uW，選取465_480nm波段熒光進彳T探測。
[0011]更進一步的，所述多光子顯微成像系統(tǒng)用于進行單顆粒的四光子成像時，穩(wěn)態(tài)連續(xù)二極管激光器發(fā)射的激發(fā)光波長為730nm，焦面處功率為100uW，選取450_460nm波段熒光進行探測。
[0012]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果:
[0013]1、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了由中心波長< SOOnm的穩(wěn)態(tài)連續(xù)激光激發(fā)的釹離子敏化的上轉(zhuǎn)換納米材料在多光子顯微成像中的用途，通過分析其光頻譜可知，無論是激發(fā)光譜還是多光子(三光子、四光子)發(fā)射光譜，都可以選取在可見光范圍內(nèi)的短波長進行成像和探測。同時，該材料具有更大的多光子吸收截面和多光子飽和激發(fā)功率，更易于進行高階多光子成像，并且不僅限于雙光子成像，考慮到生物成像時激發(fā)功率不宜過大，這種高效率的高階多光子激發(fā)降低了高分辨活體生物實驗對于探測器的要求，因此本發(fā)明的高分辨顯微系統(tǒng)更易實現(xiàn)。
[0014]2、本發(fā)明可以米用二極管激光器作為多光子激發(fā)光源，相比于傳統(tǒng)的多光子焚光顯微鏡采用的超快脈沖激光器，價格十分低廉，易于推廣。
[0015]3、本發(fā)明是使用短波長搭建的多光子顯微成像系統(tǒng)，因此相比于傳統(tǒng)的SOOnm以上波段也要廉價，易于實驗室采購，成本低。
[0016]4、本發(fā)明搭建的多光子顯微成像系統(tǒng)提高了現(xiàn)有的多光子顯微成像分辨率，同時大幅降低系統(tǒng)成本，解決了共聚焦顯微鏡、雙光子熒光顯微鏡存在的一些問題，為生命科學、醫(yī)學和材料科學研究提供一種新的方法。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明的基本結(jié)構(gòu)示意圖。
[0018]圖2為本發(fā)明的一個實例的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0019]圖3為本實施例探測到的釹離子敏化上轉(zhuǎn)換納米材料的激發(fā)光光譜。
[0020]圖4為本實施例探測到的釹離子敏化上轉(zhuǎn)換納米材料的多光子發(fā)光光譜。
[0021]圖5為本實施例中獲得的釹離子敏化上轉(zhuǎn)換納米材料的多光子激發(fā)飽和功率。
[0022]圖6(a)為本實施例獲得的釹離子敏化上轉(zhuǎn)換納米材料的χ-y平面上的高分辨率雙光子成像。
[0023]圖6(b)為圖6(a)的強度點擴散函數(shù)高斯分布曲線圖。
[0024]圖7(a)為本實施例獲得的釹離子敏化上轉(zhuǎn)換納米材料的χ-y平面上的高分辨率三光子成像。
[0025]圖7(b)為圖7(a)的強度點擴散函數(shù)高斯分布曲線圖。
[0026]圖8(a)為本實施例獲得的釹離子敏化上轉(zhuǎn)換納米材料的x-y平面上的高分辨率四光子成像。
[0027]圖8(b)為圖8(a)的強度點擴散函數(shù)高斯分布曲線圖。
【具體實施方式】
[0028]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0029]實施例1
[0030]本發(fā)明多光子顯微成像系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中I為二極管激光器，2為擴束透鏡組，3為掃描振鏡，4為短通二向色鏡，5為焚光濾光片，6為光電探測器，7為物鏡，8為樣品，9為載物臺。穩(wěn)態(tài)連續(xù)激光器中心波長< 800nm，顯微鏡光學系統(tǒng)包括擴束透鏡組
2、掃描振鏡3、短通二向色鏡4、焚光濾光片5、光電探測器6和物鏡7，樣品8放置在載物臺9上。工作時二極管激光器I產(chǎn)生的短波長連續(xù)激光經(jīng)光纖轉(zhuǎn)換為空間光后進入所述顯微鏡光學系統(tǒng)中，沿該激光束前進方向上依次放置擴束透鏡組2、掃描振鏡3和短通二向色鏡4，其中短通二向色鏡4與該激光束成45°角放置；在垂直于該激光束且穿過該短通二向色鏡4的光軸方向上，在該短通二向色鏡4上方同軸地依次放置有熒光濾光片5和光電探測器6，在該短