靶物質(zhì)的體外磁共振檢測的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本文中公開的主題物質(zhì)涉及使用磁共振檢測在生物樣本中的靶物質(zhì)例如細(xì)胞或病原體的體外方法。
[0002]發(fā)明背景
檢測在生物樣本中的臨床相關(guān)物質(zhì)，例如細(xì)胞和病原體，在診斷領(lǐng)域中是重要的。許多傳統(tǒng)檢測策略基于光學(xué)技術(shù)。然而，所述技術(shù)常常受有害作用例如光散射、吸收和自發(fā)熒光影響。將所述作用最小化可需要在記錄測量之前的大量的樣品純化。
[0003]運(yùn)用磁納米顆粒的檢測策略提供超過傳統(tǒng)檢測方法的獨(dú)特的優(yōu)勢。例如，生物樣本顯示可忽略不計(jì)的磁性背景，并因此磁納米顆粒的使用提供了在不讓樣本經(jīng)歷大量預(yù)處理步驟的情況下在樣本中獲得非常靈敏的測量的機(jī)會(huì)。
[0004]磁納米顆?？砂o機(jī)的磁性核和在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定該顆粒的生物相容性表面涂層。通過應(yīng)用合適的表面化學(xué)，功能性配體可被摻合在所述納米顆粒上以賦予分子特異性。
[0005]當(dāng)將磁納米顆粒放置在外場中，每個(gè)顆粒產(chǎn)生局部磁場，其增加了場的不均一性。當(dāng)水分子散布在所述納米顆粒的附近時(shí)，這具有擾亂水質(zhì)子自旋的相干旋進(jìn)(coherentprecess1n)的作用。結(jié)果，凈效果是在磁共振信號(hào)中的變化，其被測量作為縱向(Tl，自旋-晶格)和橫向(T2，自旋-自旋)弛豫時(shí)間的縮短。
[0006]術(shù)語“T2”是指表征信號(hào)衰減的自旋-自旋弛豫時(shí)間常數(shù)，并可通過以下等式表示:
Mxy (t) = Mxy(0)e_t/T2
其中Mxy是由射頻(RF)脈沖傾斜的磁化矢量的橫向分量。
[0007]以前磁納米顆粒已經(jīng)用于測量生物靶例如細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。使用靶-特異性磁納米顆粒，其加上了細(xì)胞表面生物標(biāo)志物標(biāo)簽，由此給予磁矩。在弛豫速率R2 = 1/%中的增加直接地與靶結(jié)合的納米顆粒的數(shù)量成比例(并也指示標(biāo)志物表面標(biāo)志物的量)。因此R2的變化和由此T 2的變化可用于檢測在樣本溶液中細(xì)胞的存在(Shao等人，BeilsteinJ.Nanonotechnol; (2010) ; I; 142-154頁)。然而，在現(xiàn)有技術(shù)中描述的方法需要除去未結(jié)合的磁納米顆粒以確保測定的靈敏性，所述除去一般通過過濾來完成。在檢測通過運(yùn)用微-MR裝置完成的情況下，該裝置在反應(yīng)流動(dòng)通路的終點(diǎn)需要過濾膜用于濾出的未結(jié)合的磁納米顆粒(Lee 等人，Angew Chem Int Ed Engl; (2009) ; 48; 5657-5660 頁)。
[0008]從結(jié)合的磁納米顆粒中除去未結(jié)合的磁納米顆粒的需求引起許多問題。例如運(yùn)用微流體性網(wǎng)絡(luò)和過濾膜增加MR檢測裝置的成本。額外的過濾步驟也可增加樣本制備的成本，該因素在其中可負(fù)擔(dān)得起的測試技術(shù)是首要的發(fā)展中國家中尤其重要。此外，對(duì)額外的分離步驟的需求將實(shí)施診斷測試的技術(shù)員暴露于潛在危險(xiǎn)的物質(zhì)。
[0009]發(fā)明簡述本發(fā)明涉及通過磁共振檢測在樣本中的靶物質(zhì)的存在的體外方法，所述方法包括:
(a)提供包含生物樣本的測試樣本； (b)提供多個(gè)磁納米顆粒，其中所述磁納米顆粒包括能夠結(jié)合革El物質(zhì)的結(jié)合劑；
(C)將測試樣本與多個(gè)磁納米顆粒接觸以提供含有磁納米顆粒和測試樣本的混合物；
和
(d)確定與樣本中的靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒對(duì)應(yīng)的！^弛豫時(shí)間(T 2^)；
其中Τ2?^不同于未與靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒對(duì)應(yīng)的！^弛豫時(shí)間(Τ 2as )，并且其中在沒有將與靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒同未與靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒物理上分離的情況下確定。
[0010]本發(fā)明還提供通過磁共振檢測在生物樣本中的靶物質(zhì)的存在的體外方法，所述方法包括:
(a)提供包含生物樣本和多個(gè)磁納米顆粒的混合物，其中磁納米顆粒包括當(dāng)靶物質(zhì)存在于生物樣本中時(shí)能夠結(jié)合靶物質(zhì)的結(jié)合劑；和
(b)確定與在樣本中的靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒對(duì)應(yīng)的！^弛豫時(shí)間(T2結(jié)合)；
其中Τ2?^不同于未與靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒對(duì)應(yīng)的！^弛豫時(shí)間(Τ 2as )，并且其中在沒有將與靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒同未與靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒物理上分離的情況下確定。
[0011]本發(fā)明還提供了檢測在生物樣本中的靶物質(zhì)的存在的方法，所述方法包括:
(a)提供來自包含生物樣本和多個(gè)磁納米顆粒的混合物的NMR數(shù)據(jù)，其中所述磁納米顆粒包括當(dāng)靶物質(zhì)存在于生物樣本中時(shí)能夠結(jié)合靶物質(zhì)的結(jié)合劑；和
(b)根據(jù)所述NMR數(shù)據(jù)確定與在樣本中的靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒對(duì)應(yīng)的!^弛豫時(shí)間
(T2結(jié)合)；
其中Τ2?^不同于未與靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒對(duì)應(yīng)的！^弛豫時(shí)間(Τ 2as )，并且其中通過NMR數(shù)據(jù)的處理將Τ2?^與T2ss區(qū)分以獲得Τ2?^和T2ss的分開的值。
[0012]本發(fā)明還提供了通過磁共振檢測在生物樣本中的靶物質(zhì)的存在的體外方法，所述方法包括:
Ca)提供包含生物樣本和多個(gè)磁納米顆粒的混合物，其中所述磁納米顆粒包括當(dāng)靶物質(zhì)存在于生物樣本中時(shí)能夠結(jié)合靶物質(zhì)的結(jié)合劑；和
(b)確定與在樣本中的靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒對(duì)應(yīng)的T2弛豫時(shí)間(T2gg)；
其中Τ2?^不同于未與靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒對(duì)應(yīng)的！^弛豫時(shí)間(Τ 2as )，和其中通過NMR數(shù)據(jù)的處理將Τ2?^與Τ_區(qū)分以獲得T2g^P Τ_的分開的值。
[0013]本發(fā)明還提供檢測生物樣本中的靶物質(zhì)的存在的方法，所述方法包括:
(a)提供來自包含生物樣本和多個(gè)磁納米顆粒的混合物的NMR數(shù)據(jù)，其中所述磁納米顆粒包括當(dāng)靶物質(zhì)存在于生物樣本中時(shí)能夠結(jié)合靶物質(zhì)的結(jié)合劑；和
(b)處理所述NMR數(shù)據(jù)以確定是否存在同Τ2?^和T2es對(duì)應(yīng)的不同！^值，其中Τ2?^是如果靶物質(zhì)存在的話，與靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒對(duì)應(yīng)的！^弛豫時(shí)間，并且T 2SS是未與靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒對(duì)應(yīng)的T2弛豫時(shí)間。
[0014]生物樣本優(yōu)選是自哺乳動(dòng)物受試者，優(yōu)選人獲得的樣本，所述哺乳動(dòng)物受試者例如被懷疑患有疾病或感染的個(gè)體。靶物質(zhì)(其可以是例如細(xì)胞或病原體)可表示指示疾病或感染的靶。
[0015]本發(fā)明由此涉及使用磁納米顆粒在生物樣本中檢測靶物質(zhì)例如細(xì)胞或病原體的方法，所述方法不需要將與靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒同沒有與靶物質(zhì)結(jié)合的納米顆粒物理分離/過濾。
[0016]本發(fā)明人已進(jìn)一步確定的是，Τ2?^的值取決于靶物質(zhì)(例如，細(xì)胞、病原體或細(xì)菌)的濃度并且因此T2M的確定可允許確定靶物質(zhì)的量(例如濃度的數(shù)量)。
[0017]因此，本發(fā)明具有勝過需要上述分離步驟的現(xiàn)有技術(shù)方法的明顯的優(yōu)點(diǎn)。例如，該步驟的去除減少樣本制備的時(shí)間和成本。該步驟的去除還可減少實(shí)施測試的技術(shù)員對(duì)另外潛在危險(xiǎn)樣本的暴露。此外，可消除對(duì)于高度訓(xùn)練的人力的需求。
[0018]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，靶物質(zhì)是細(xì)胞和/或病原體，例如細(xì)菌細(xì)胞。
[0019]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，通過NMR數(shù)據(jù)的信號(hào)處理將T2M與T2自s區(qū)分開以獲得T2結(jié)^.和T2ss的分開的值。信號(hào)處理優(yōu)選包括將雙指數(shù)擬合應(yīng)用于自混合物獲得的NMR數(shù)據(jù)以獲得T2g^P Τ_的分開的值。
[0020]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，使混合物經(jīng)歷自旋-回波脈沖序列，特別是多回波自旋回波脈沖序列。
[0021 ] 在更進(jìn)一步實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括定量在樣本或混合物中靶物質(zhì)的量。在此實(shí)施方案的一個(gè)方面中，τ2?^的值取決于混合物中靶物質(zhì)的量，并且靶物質(zhì)的量通過將τ2?^的值與在靶物質(zhì)的不同濃度下測量的τ2?^的值的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較而確定。另外或備選地，T2^的值取決于混合物中靶物質(zhì)的量，并且將T2M的值與自包含已知量的靶物質(zhì)的參考樣本獲得的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)值比較。
[0022]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法在微-MR裝置上實(shí)施。
[0023]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，磁納米顆粒包括與結(jié)合劑綴合的超順磁顆粒。每一個(gè)磁性顆?？砂谐槾叛趸F(SP1)的核，其中所述顆粒與結(jié)合劑綴合。
[0024]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，結(jié)合劑是含有對(duì)靶物質(zhì)有特異性的結(jié)合位點(diǎn)的抗體或抗體片段。
[0025]附圖簡述圖1是顯示Τ2弛豫時(shí)間對(duì)細(xì)菌靶向的磁性納米綴合物和細(xì)菌之間的反應(yīng)的時(shí)間的線圖。
[0026]圖2是對(duì)使用過濾步驟檢測靶物質(zhì)的過程的示意圖。
[0027]圖3是對(duì)使用本發(fā)明的方法檢測靶物質(zhì)的過程的示意圖，其中過濾步驟不是必需的。
[0028]圖4是可用于本發(fā)明的微-磁共振單元的透視分解圖的示意圖。
[0029]圖5是分析可用于本發(fā)明的樣本和納米顆粒的混合物的方法的流程圖。
[0030]圖6是可用于本發(fā)明的微-磁共振系統(tǒng)的示意圖。
[0031]圖7是用于管理微-核MR單元的分析數(shù)據(jù)的界面單元的示意圖。
[0032]圖8是管理在微-核MR單元中生成的分析數(shù)據(jù)的界面單元的例示性環(huán)境。
[0033]圖9說明了管理在微-磁共振單元中的分析數(shù)據(jù)的方法的流程圖。
[0034]圖10說明了在界面單元中處理分析數(shù)據(jù)的方法的流程圖。
[0035]圖11說明了遵循實(shí)施方案使用微-磁共振系統(tǒng)分析至少一種流體樣本和納米顆粒的混合物的方法的流程圖。
[0036]發(fā)明詳述本發(fā)明提供通過磁共振檢測在樣本中的靶物質(zhì)的存在的體外方法，所述方法包括:
(a)提供包含生物樣本的測試樣本；
(b)提供多個(gè)磁納米顆粒，其中所述磁納米顆粒包括能夠結(jié)合革El物質(zhì)的結(jié)合劑；
(C)將測試樣本與多個(gè)磁納米顆粒接觸以提供含有磁納米顆粒和測試樣本的混合物； (d)確定與在樣本中的靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒對(duì)應(yīng)的！^弛豫時(shí)間(T2gg)；
其中Τ2?^不同于未與靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒對(duì)應(yīng)的！^弛豫時(shí)間(Τ 2as )，并且其中在沒有將與靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒同沒有與靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒物理上分離的情況下確定。
[0037]本發(fā)明還提供通過磁共振檢測在生物樣本中的靶物質(zhì)的存在的體外方法，所述方法包括:
(a)提供包含生物樣本和多個(gè)磁納米顆粒的混合物，其中所述磁納米顆粒包括當(dāng)靶物質(zhì)存在于生物樣本中時(shí)能夠結(jié)合靶物質(zhì)的結(jié)合劑；和
(b)確定與在樣本中的靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒對(duì)應(yīng)的！^弛豫時(shí)間(T2gg)；
其中Τ2?^不同于未與靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒對(duì)應(yīng)的！^弛豫時(shí)間(Τ 2as )，并且其中在沒有將與靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒同沒有與靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒物理上分離的情況下確定。
[0038]本發(fā)明還提供了檢測在生物樣本中的靶物質(zhì)的存在的方法，所述方法包括:
(a)提供來自包含生物樣本和多個(gè)磁納米顆粒的混合物的NMR數(shù)據(jù)，其中所述磁納米顆粒包含當(dāng)所述靶物質(zhì)存在于生物樣本中時(shí)能夠結(jié)合靶物質(zhì)的結(jié)合劑，和
(b)根據(jù)所述NMR數(shù)據(jù)確定與在樣本中的靶物質(zhì)結(jié)合的磁納米顆粒對(duì)應(yīng)的!^弛豫時(shí)間
(T2結(jié)合)；