一種改進(jìn)的冰凍切片方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組織樣本制備及病理研究領(lǐng)域，具體涉及一種制備組織樣品的改進(jìn)的冰凍切片方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人類以及其它物種基因組測序的逐步完成，現(xiàn)代生物學(xué)的研究已經(jīng)進(jìn)入了后基因組時(shí)代一功能基因組時(shí)代。隨著功能基因組發(fā)展的需要，針對不同生物大分子研究的高通量技術(shù)陸續(xù)發(fā)展，包括基因組技術(shù)，轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，蛋白質(zhì)組技術(shù)等。近年來，針對少量甚至單細(xì)胞樣品的各種組學(xué)方法也開始發(fā)展并得到應(yīng)用。隨著海量數(shù)據(jù)處理和分析的需要，生物信息學(xué)也發(fā)展迅速。同時(shí)，在組織樣品的分選方面，隨著激光顯微切割技術(shù)的應(yīng)用，使得對于特定的組織類型和細(xì)胞類型的分選成為可能。這兩方面技術(shù)發(fā)展的結(jié)合，使得在組織層面上進(jìn)行系統(tǒng)生物學(xué)研究成為可能，對于現(xiàn)代分子病理學(xué)而言，也是一場革命性的變化。研究者將有可能根據(jù)研究的需要，分選出特定的組織結(jié)構(gòu)或者細(xì)胞類型，進(jìn)行全基因組尺度的定量測量和分析，從而對機(jī)體的正常發(fā)育和異常病變的分子機(jī)制有全面的深入理解，對疾病的預(yù)防和治療提供重要的理論基礎(chǔ)。
[0003]基于組織形貌或者細(xì)胞類型的組學(xué)研究，主要的流程是:對要研究的臨床組織樣品或者模式動物組織樣品進(jìn)行切片和染色，找到目標(biāo)組織結(jié)構(gòu)或者細(xì)胞類型，利用激光分選技術(shù)分選出目標(biāo)組織或者細(xì)胞類型，根據(jù)研究目的提取DNA、RNA或者蛋白，對少量樣品放大之后，利用高通量技術(shù)(例如基因芯片、二代測序技術(shù)或者蛋白質(zhì)組學(xué)等方法)對樣品內(nèi)的生物分子進(jìn)行全基因組尺度的定量分析。在樣品的制備方面，進(jìn)行這類研究的必要條件是在找到特定組織或者細(xì)胞結(jié)構(gòu)的同時(shí)，保持高質(zhì)量的生物分子結(jié)構(gòu)。
[0004]目前組織樣品的制樣方法主要有三類，一類是石蠟切片，一類是冰凍切片，一類是固定冰凍切片。這三種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。石蠟切片的基本流程是新鮮樣品固定，脫水，樹脂滲透和聚合，然后進(jìn)行切片。切片好之后進(jìn)行脫蠟，染色，進(jìn)行下游的分子生物學(xué)操作。石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)是切片比較薄，固定之后的樣品能保持比較好的組織學(xué)形貌。缺點(diǎn)是生物大分子的質(zhì)量，特別是RNA和蛋白的質(zhì)量和抽提效率比較差，一般難以進(jìn)行全基因組的分析。冰凍切片樣品的基本流程是將新鮮樣品直接用液氮速凍，進(jìn)行冰凍切片，染色，然后進(jìn)行下游的分子生物學(xué)研究。該方法的優(yōu)點(diǎn)是能保持好的RNA質(zhì)量，缺點(diǎn)是組織結(jié)構(gòu)的形貌保持較差，形態(tài)辨認(rèn)困難。固定冰凍切片的基本流程是將新鮮樣品固定，直接進(jìn)行冰凍切片，染色，然后進(jìn)行下游的分子生物學(xué)研究。該方法的優(yōu)點(diǎn)是能保持較好的形貌，抗原的空間結(jié)構(gòu)保持較好，缺點(diǎn)是，雖然生物大分子的質(zhì)量較石蠟切片有所改善，但是還是不足以滿足大規(guī)模分析的樣品質(zhì)量要求。這兩類冰凍切片方法對于含水量大，體積也較大的組織，由于細(xì)胞內(nèi)容易形成冰晶的問題，樣品結(jié)構(gòu)保持非常差，不能滿足結(jié)構(gòu)或者細(xì)胞形態(tài)分辨的要求。
[0005]因此，目前系統(tǒng)生物學(xué)和分子病理學(xué)發(fā)展需要，急需一種既能完整保持組織結(jié)構(gòu)，又能保持高質(zhì)量的生物大分子的組織樣品制備方法。
[0006]在優(yōu)化組織樣品制備方法上，研究人員對于樣品的固定劑選擇和樣品的包埋方式等做了一系列的嘗試。在組織樣品的制備中，固定劑的選擇和使用對后期樣品形貌和生物大分子質(zhì)量影響最大。研究人員嘗試了不同固定劑的使用，例如Melissa L.Cox等人考察了不同的固定劑 70%neutral_buffered formal in, modified Davidson’s II, 70%ethanol,UMFIX, modified CarnoyJ s, modified methacarn,Bouin’ s,phosphate-buffered saline和30%sucrose對于組織樣品形貌和RNA質(zhì)量的影響。在這些固定劑中，雖然modifiedmethacarn 能一定程度提高RNA 的質(zhì)量。Mark A.Perlmutter, John ff.Gillespie 等人用 70%的乙醇溫和固定組織樣品，然后進(jìn)行石蠟包埋，這種方法能保持組織的精細(xì)結(jié)構(gòu)，并適當(dāng)提高RNA的質(zhì)量。VaskerBhattacherjee等人利用預(yù)冷的4%多聚甲醒(paraformaldehyde)對組織進(jìn)行短時(shí)間固定，然后進(jìn)行冰凍切片。經(jīng)過這些嘗試，雖然樣品一定程度地提到了 RNA的質(zhì)量，但是總體上來說，RNA的質(zhì)量還是不能滿足對于高通量測序的要求。另外，用液氮預(yù)冷的異戊烷也被用于組織樣品的直接速凍，但是對于含水量大的大樣品，該方法還是不能保持精細(xì)的組織結(jié)構(gòu)。
[0007]生物試劑公司也開發(fā)了相應(yīng)的商業(yè)試劑盒，試圖提高臨床生物樣品的生物大分子質(zhì)量。例如，Qiagen公司開發(fā)了 Allprotect Tissue Reagent試劑盒,該試劑盒可在室溫下立即穩(wěn)定組織樣本中的DNA、RNA和蛋白質(zhì)。這樣可以穩(wěn)定DNA、RNA和蛋白質(zhì)，以保證可靠的下游分析。穩(wěn)定后的組織可在15-25°C運(yùn)輸7天，2-8°C儲存長達(dá)12個月，在-20°C或_80°C可儲存更長時(shí)間。但是商業(yè)試劑盒還不能完整保持組織的精細(xì)結(jié)構(gòu)。
[0008]從上面的分析來看，目前樣品制備技術(shù)已經(jīng)成為系統(tǒng)生物學(xué)發(fā)展的一個關(guān)鍵技術(shù)瓶頸，另外分子病理學(xué)的科學(xué)和臨床研究，以及生物樣本庫的建設(shè)，都急需一種通用、簡易的組織樣品處理方法，這種方法要既能保持很好的組織精細(xì)結(jié)構(gòu)，同時(shí)又能保持高質(zhì)量的生物大分子質(zhì)量，以滿足科研和臨床的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種能同時(shí)保持組織精細(xì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)生物大分子(DNA,RNA和蛋白)完整性的通用型組織制備方法，具體的，為一種改進(jìn)的冰凍切片技術(shù)。
[0010]本發(fā)明首先公開了一種改進(jìn)的冰凍切片方法，包括組織預(yù)處理步驟、組織包埋步驟，組織冰凍以及切片步驟，切片步驟后獲得冰凍組織切片；本發(fā)明所述組織預(yù)處理步驟為采用冰凍保護(hù)劑對組織樣品進(jìn)行浸泡處理。
[0011]進(jìn)一步的，本發(fā)明所述改進(jìn)的冰凍切片方法不包括切片固定步驟。
[0012]具體的，所述改進(jìn)的冰凍切片方法，包括以下步驟:
[0013]I)預(yù)處理:將組織樣品放入冰凍保護(hù)劑中進(jìn)行浸泡，使冰凍保護(hù)劑浸入組織樣品;
[0014]2)樣品包埋:將預(yù)處理后的組織樣品放入冰凍切片包埋劑中浸泡，然后采用冰凍切片包埋劑包埋；
[0015]3)冰凍及切片:將包埋后的樣品凍存后切片，獲得冰凍組織切片。
[0016]優(yōu)選的，在預(yù)處理前采用事先在冰上預(yù)冷的0.0lM PBS溶液對新鮮取下來的組織樣品進(jìn)行清洗，然后用無塵吸水紙吸干表面水分。
[0017]較優(yōu)的，所述冰凍保護(hù)劑為二甲基亞砜(DMSO)溶液。
[0018]優(yōu)選的，所述冰凍保護(hù)劑為5?40wt%的二甲基亞砜溶液。
[0019]更優(yōu)的，所述冰凍保護(hù)劑為10?30wt%的二甲基亞砜溶液。
[0020]最優(yōu)的，所述冰凍保護(hù)劑為20wt%的二甲基亞砜溶液。
[0021]優(yōu)選的，所述二甲基亞砜(DMSO)溶液的溶劑選自水，5?75v/v%乙醇水溶液，或者與組織等滲的緩沖溶液。
[0022]更優(yōu)選的，所述乙醇水溶液為20v/v%乙醇水溶液。更優(yōu)選的，所述與組織等滲的緩沖溶液的pH值為6.8?7.5。最優(yōu)選的，所述與組織等滲的緩沖溶液為PBS緩沖溶液或HBSS緩沖溶液。
[0023]優(yōu)選的，步驟I)所述冰凍保護(hù)劑浸泡的溫度條件為O?28°C。更優(yōu)選的，所述冰凍保護(hù)劑浸泡的溫度條件為4?25°C。最優(yōu)的，所述冰凍保護(hù)劑的浸泡溫度條件為4±2°C。
[0024]在冷凍保護(hù)劑中的浸泡時(shí)間具體根據(jù)樣品大小決定，以完全滲透樣品組織為佳。優(yōu)選的，冰凍保護(hù)劑的浸泡時(shí)間為1min以上。更優(yōu)選的，冰凍保護(hù)劑的浸泡時(shí)間為0.5?3h。
[0025]較優(yōu)的，步驟2)中所述冰凍切片包埋劑的處理溫度條件為O?28°C。更優(yōu)的，所述冰凍切片包埋劑的處理溫度條件為4?25°C。最優(yōu)的，所述冰凍切片包埋劑的處理溫度條件為4±2°C。
[0026]在包埋劑中浸泡時(shí)間的選擇屬于本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段，具體根據(jù)樣品大小決定處理時(shí)間。優(yōu)選的，所述冰凍切片包埋劑的浸泡時(shí)間為0.5h以上。更優(yōu)選的，所述冰凍切片包埋劑的浸泡時(shí)間為I?6h。
[0027]較優(yōu)的，所述冰凍切片包埋劑為OCT包埋劑。
[0028]優(yōu)選的，步驟3)切片的厚度為6?18 μ m。
[0029]步驟3)所述凍存為現(xiàn)有技術(shù)，例如液氮速凍或者_(dá)80°C冷凍過夜；或者，步驟3)的冰凍及切片步驟可采用現(xiàn)有的冰凍切片機(jī)實(shí)現(xiàn)。
[0030]并且，本發(fā)明改進(jìn)的冰凍切片技術(shù)適用于任何組織；特別適用于含水量較大的人體和動物組織，例如人和動物胚胎組織，人和動物的腎組織等；也適用于脂質(zhì)含量較高的組織，如人和動物的腦組織等。
[0031]較優(yōu)的，前述改進(jìn)的冰凍切片方法中，所述組織為含水量超過40wt%的組織，和/或脂質(zhì)含量超過10wt%的組織。
[0032]更優(yōu)的，前述改進(jìn)的冰凍切片方法中，所述組織為含水量超過60wt%的組織，和/或脂質(zhì)含量超過35wt%的組織。
[0033]現(xiàn)有技術(shù)可知，含水量超過60wt%的組織可以選自例如胚胎、腎組織等；脂質(zhì)含量超過35wt%的組織包括腦組織等。最優(yōu)的，前述改進(jìn)的冰凍切片方法中，所述組織選自胚胎、腦組織或腎組織。
[0034]采用本發(fā)明方法制備的組織樣品冰凍切片可以不經(jīng)過固定步驟，直接用于組織染色、顯微觀察，以及其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)