直接競爭trfia法檢測喹乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種嗟己醇的檢測方法，屬于生物技術(shù)中的時間分辨巧光免疫分析技 術(shù)領(lǐng)域，具體為一種用于飼料、水體及動物源性食品中嗟己醇藥物殘留直接競爭TRFIA的 檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 嗟己醇（Olaquindox，OLA)是一種抗菌促生長劑，曾廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，一度 被稱為"水產(chǎn)瘦肉精"。嗟己醇的毒副作用不容小勵，存在明顯的遺傳毒性和蓄積毒性，因 此國內(nèi)外相繼制定了嚴(yán)格的使用規(guī)范和殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。如美國和歐盟禁止使用嗟己醇，日 本規(guī)定嗟己醇在動物組織和內(nèi)臟中的最大殘留限量（MRL)為300 yg ? kg4,我國農(nóng)業(yè)部在 2001年發(fā)布的第168號公告《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》中規(guī)定飼料中的添加量不得高于 50mg ? kg4,同時規(guī)定禁止在魚、禽及體重超過35kg豬的養(yǎng)殖過程中使用。盡管如此，抗菌 促生長效果好且廉價(jià)的嗟己醇目前仍被違規(guī)添加使用。因此，加強(qiáng)嗟己醇的檢測監(jiān)督，特別 是加強(qiáng)嗟己醇檢測技術(shù)的研究極為必要。
[0003] 嗟己醇的殘留檢測方法，主要包括傳統(tǒng)的儀器分析和免疫分析兩大類。其中儀器 法主要包括光譜法、色譜法W及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等，儀器分析準(zhǔn)確度高、精密度強(qiáng)，但其樣品 前處理過程復(fù)雜繁瑣、耗時長、需要專業(yè)技術(shù)人員操作、儀器試劑等價(jià)格昂貴，無法在基層 得到極大推廣。免疫分析技術(shù)憑借著其高效、快速、高靈敏度W及高特異性等優(yōu)勢廣泛應(yīng)用 于小分子藥物殘留檢測中。目前，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)巧LISA)的應(yīng)用最廣泛、發(fā)展最成熟， 關(guān)于化ISA的各種檢測報(bào)道非常多，但國內(nèi)外尚未有關(guān)于嗟己醇的時間分辨巧光免疫分析 (TRFIA)檢測方面的任何報(bào)道，因此開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的嗟己醇時間分辨巧光免疫分 析（TRFIA)的檢測方法有重要意義。
[0004] 時間分辨巧光免疫分析技術(shù)（TRFIA)是近年來發(fā)展迅速的一種高靈敏度檢測手 段。TRFIA的原理是利用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的馨合劑，其一端與銅系元素結(jié)合，另一端則 與抗體（或抗原）上的自由氨基連接，制成銅系元素化標(biāo)記抗體（或抗原），它與待測樣 品中的抗原（或抗體）結(jié)合生成抗原抗體復(fù)合物。此時免疫復(fù)合物的巧光強(qiáng)度非常弱，需 加入一種增強(qiáng)液，使化從復(fù)合物中解離下來，在增強(qiáng)液中T0P0、Triton X-100等的協(xié)同 作用下可與另一種馨合劑TTA形成新的復(fù)合物，該復(fù)合物可發(fā)射出很強(qiáng)的巧光，使巧光效 果增強(qiáng)上百萬倍。最后用時間分辨儀測定其巧光強(qiáng)度cps，即可確定樣品中抗原的含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種嗟己醇直接競爭TRFIA的檢測方法，用于定性或定量地檢測飼 料、水體W動物源性食品中嗟己醇的殘留量，其檢測時間短、平均回收率高、變異系數(shù)較小， 具有簡便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 直接競爭TRFIA法檢測嗟己醇的方法，其特征在于，包括如下步驟：
[000引 A.在抗原預(yù)包被條的每個微孔內(nèi)分別加入50化系列濃度的嗟己醇標(biāo)準(zhǔn)液或是 處理好的樣品液W及50 y L館標(biāo)記單克隆抗體，混勻，37°C解育比，用洗漆液洗漆微孔3? 5次；
[0009] B.每個微孔加入200化增強(qiáng)液，37°C避光振蕩解育lOmin ;
[0010] C.用時間分辨儀測定其巧光強(qiáng)度值cps ;
[0011] D. W [l-(cpSy/cps。) ]*100%值為縱坐標(biāo)，其中cpSy表示不同濃度嗟己醇標(biāo)準(zhǔn)液 所對應(yīng)的巧光值，cps。表示零標(biāo)準(zhǔn)濃度時所對應(yīng)的巧光值；W嗟己醇濃度的對數(shù)值為橫坐 標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；再根據(jù)每個樣品的cpsycps。值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出對應(yīng)的嗟己醇濃度， 再乘W相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，計(jì)算出樣品中實(shí)際的嗟己醇濃度。
[0012] 本發(fā)明采用時間分辨巧光免疫分析法（TRFIA)來檢測嗟己醇（OLA)。TRFIA技術(shù)主 要有兩個方面；第一，特異性抗嗟己醇單克隆抗體的制備，經(jīng)小鼠免疫、細(xì)胞融合、陽性雜交 瘤細(xì)胞株篩選、克隆、腹水制備W及腹水純化，最終獲得目標(biāo)單克隆抗體（OLA-mAb);第二， 館標(biāo)記的抗嗟己醇單克隆抗體巧u 3+-〇LA-mAb)的制備。
[0013] 測定方法為；取出包被有0LA-0VA的抗原包被板條，將0LA標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品處理 液加入到各自的微孔中，再加入化 3+-〇LA-mAb，振蕩反應(yīng)，游離的0LA與抗原包被板條上的 0LA-0VA共同競爭化3+-〇LA-mAb，經(jīng)洗漆液洗漆，沒有連接的化 3+-〇LA-mAb被除去。加增強(qiáng)液 振蕩反應(yīng)后，在紫外光的激發(fā)下發(fā)射很強(qiáng)的巧光，用時間分辨巧光儀測定其巧光強(qiáng)度cps， 巧光強(qiáng)度與樣品中的濃度成反比，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定樣品中嗟己醇的含量。
[0014] 抗嗟己醇單克隆抗體的制備方法如下；先用班巧酸酢化巧將嗟己醇偶聯(lián)到載體 蛋白BSA上，合成免疫原（0LA-HS-BSA)免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓 瘤細(xì)胞融合，篩選出能穩(wěn)定分泌抗嗟己醇單克隆抗體的陽性細(xì)胞株并擴(kuò)大培養(yǎng)，注射細(xì)胞 進(jìn)入小鼠體內(nèi)誘生腹水，純化獲得抗嗟己醇的單克隆抗體。
[0015] 嗟己醇標(biāo)準(zhǔn)溶液從0LA純品稀釋得到，稀釋液為含5 %甲醇的0. 01M抑為7. 4的 磯酸鹽緩沖液，共 12 瓶，0LA 濃度依次為；Ong 3ng 6ng 2ng 'm。、 2. 4ng ? mL-i、4. 8ng ? mL_i、9. 6ng ? mL-i、19. 4ng ? mL-i、38. 8ng ? mL-i、？？. 5ng ? mL-i、 155. Ong ? mL-i、310ng ? mL-i。
[0016] 館標(biāo)記的嗟己醇單克隆抗體巧u3+-〇LA-mAb)的制備方法如下：
[0017] A.取0. 5血純化好的嗟己醇單克隆抗體（OLA-mAb)與0. 5血0. 01M抑為7. 4的 PBS溶液1:1混合；
[00化]B.準(zhǔn)確稱取3. Omg環(huán)化二己締S胺五醋酸酢，加入90 y L DMS0溶解；
[0019] C.將90 y L B緩慢滴加至U A中，用0. 125M NaOH調(diào)抑至9. 0,室溫避光放置2h ;
[0020] D.將步驟C最終得到的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋中，0. Olmol吃-1抑7. 4PBS透析過夜； [002U E.準(zhǔn)確稱取 0. 242g E11CI3 ? 6&0 于 20血水中配成 3. 3X 10-2m E11CI3溶液；
[0022] F.取100 y L步驟E所得溶液加入步驟D所得透析液中，室溫避光反應(yīng)化后 置于透析袋中透析2化?36h，分裝保存于-20°C，即得到館標(biāo)記嗟己醇單克隆抗體 巧u3+-〇LA-mAb)。
[002引增強(qiáng)液的制備方法如下：準(zhǔn)確稱取120. Omg a -唾吩甲酷S氣丙酬（TTA)和 386. 6mg S辛基氧化麟（T0P0)，加入1. 0血無水己醇將其溶解，再向其中加入2. 78g鄰苯二 甲酸氨鐘和少量去離子水，40°C待溶解后加入11.8血冰己酸和5mL Triton X-100,最后用 水定容至2000mU調(diào)pH至3. 0,用脫脂棉抽濾，將濾液靜置過夜，4°C冰箱避光保存，備用。
[0024] 本發(fā)明的有益效果；該檢測方法操作簡單便捷，靈敏度高，穩(wěn)定性好，其最低檢測 限可達(dá) 0. 83ng ? mL-1。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案、積極效果更加清楚明白，通過W下實(shí)施例對本發(fā) 明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。W下對于具體實(shí)施方案的描述僅用于解釋本發(fā)明，并不限定本發(fā) 明。
[0026] 實(shí)施例一；
[0027] 按下列步驟檢測飼料樣品：
[00測 （1)包被原（OLA-OVA)及免疫原（OLA-BSA)的制備；
[0029] A.首先向S 口圓底燒瓶中準(zhǔn)確加入2. 106g嗟己醇和1.6g班巧酸酢，加入 80mL化晚，115°C下回流反應(yīng)化后減壓蒸除化晚，向剩余混合物中加入60mL冰蒸饋水， 2mol ?。肥1調(diào)抑至2. 0?3. 0,4°C下放置過夜。減壓抽濾并用冰蒸饋水洗漆3次后抽 干，淡黃色粉狀物質(zhì)即為OLA-服；
[0030] B.其次稱取 14. 528mg OLA-服溶于 0. 8血 DMF 中，加入 4. 603mg N服和 8. 253mg DCC，室溫下避光攬拌反應(yīng)1化后2000r/min離屯、lOmin，離屯、后上清液為A液。稱取20mg OVA(或BSA)溶于5血0. Olmol ? L-1磯酸鹽緩沖液（PBS，pH7. 4)中，此為B液。4°C下將 0.6mL A液逐滴加入到緩慢攬拌的B液中，4°C攬拌反應(yīng)過夜。次日轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)，PBS透析 2d，離屯、棄沉淀，交聯(lián)產(chǎn)物命名為0LA-服-OVA和0LA-服-BSA。
[003U 似 Eu3+-0LA-mAb 的制備；
[003引 A. 5血純化好的嗟己醇單克隆抗體（OLA-mAb)與0. 5血0. 01M抑為7. 4的PBS溶 液1:1混合；
[003引 B.稱取3. Omg環(huán)化二己締S胺五醋酸酢，加入90 y L