一種γ-干擾素定量檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及體外診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種丫-干擾素定量檢測(cè)方法及試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。據(jù)WK)估計(jì)，全球有約20億人感染結(jié) 核分枝桿菌，每年有約200萬(wàn)人死于結(jié)核。我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié) 核感染導(dǎo)致的死亡人數(shù)是其他傳染性疾病總死亡人數(shù)的2倍W上。結(jié)核病的臨床表現(xiàn)多 樣，可W累及全身各個(gè)系統(tǒng)，尤其是肺外結(jié)核病變往往十分隱匿，給臨床診斷帶來(lái)極大的困 難。傳統(tǒng)的結(jié)核病診斷方法存在成本高、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，給結(jié)核患者和家庭帶來(lái)沉重負(fù) 擔(dān)。近年來(lái)，有一類(lèi)用于診斷結(jié)核分枝桿菌感染的新方法進(jìn)入了人們的視線，即丫 -干擾素 釋放試驗(yàn)（interferongamma release assay, IGRA)，對(duì)結(jié)核患者的診斷帶來(lái)了新的途徑， 該方法準(zhǔn)確率高，不要回訪，逐漸被歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家所采用。丫-干擾素是致敏的淋己細(xì)胞 再次受到抗原刺激時(shí)釋放的一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過(guò) 細(xì)胞表面受體作用使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制病毒的復(fù)制。該類(lèi)試驗(yàn)采用ELISA/ 化ISP0T (酶聯(lián)免疫吸附/酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)）方法定量檢測(cè)檢測(cè)全血/外周血單核細(xì)胞在結(jié)核 菌特異性抗原刺激下釋放丫 -干擾素的水平，用于診斷潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染W(wǎng)及結(jié)核 病。但是現(xiàn)有試劑盒在實(shí)現(xiàn)丫干擾素定量的同時(shí)，操作相對(duì)繁瑣，中間設(shè)及多步的洗漆和 加樣，浪費(fèi)人力且容易造成污染。
[0003] 有鑒于上述的缺陷，本設(shè)計(jì)人，積極加W研究創(chuàng)新，W期創(chuàng)設(shè)一種丫-干擾素定量 檢測(cè)方法及試劑盒，使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種操作較為簡(jiǎn)單、同時(shí)有效實(shí)現(xiàn)丫 干擾素定量檢測(cè)的丫-干擾素定量檢測(cè)方法。
[000引本發(fā)明的丫-干擾素定量檢測(cè)方法，包括W下步驟：
[0006] 1)捕獲巧光微球的制備；采用碳二亞胺法制備，依次包括W下步驟：
[0007] a、將巧光微球懸液經(jīng)洗漆液清洗后，加入偶聯(lián)緩沖液、碳二亞胺和N服活化劑避 光下混勻；
[000引 b、加入抗人丫-干擾素抗體混勻避光下混勻；
[0009] C、加入封閉液后避光搖振后得到捕獲巧光微球；
[0010] t將捕獲巧光微球放入儲(chǔ)存緩沖液中避光保存；
[0011] 2) 丫-干擾素的體外釋放；采集結(jié)核菌特異性抗原刺激下的全血樣本，經(jīng)分裝、培 養(yǎng)和離屯、后，收集血漿溶液；
[0012] 3)捕獲巧光微球與丫-干擾素的結(jié)合；將步驟1)中得到的捕獲巧光微球與步驟 2)中得到的血漿溶液混合，室溫解育得到待檢溶液；
[0013] 4)抗原抗體復(fù)合物的制備：在待檢溶液中加入巧光素標(biāo)記的抗人y-干擾素抗 體，室溫解育得到抗原抗體復(fù)合物；
[0014] 5)定量檢測(cè)：利用流式細(xì)胞儀對(duì)步驟4)制備的抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)。
[0015] 進(jìn)一步的，還包括對(duì)照組檢測(cè)酪蛋白溶液替代步驟2)中收集的血漿溶液，重 復(fù)步驟3)、4)和5)。
[0016] 進(jìn)一步的，還包括標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備；用樣本稀釋液倍比稀釋丫-干擾素標(biāo)準(zhǔn)品W 替代步驟2)中收集的血漿溶液，重復(fù)步驟3)、4)和5)，根據(jù)不同濃度的丫-干擾素標(biāo)準(zhǔn)品 產(chǎn)生的巧光信號(hào)的強(qiáng)度不同繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0017] 進(jìn)一步的，所述抗人丫 -干擾素抗體為鼠源抗人丫-干擾素抗體。
[001引進(jìn)一步的，所述巧光素標(biāo)記的抗人丫-干擾素抗體為巧光素標(biāo)記（APC-CY7)的兔 源抗人丫-干擾素抗體。
[0019] 本發(fā)明的另一目的是提供一種操作較為簡(jiǎn)單、同時(shí)有效實(shí)現(xiàn)丫干擾素定量的 丫-干擾素定量檢測(cè)試劑盒，包括巧光微球、偶聯(lián)緩沖液、碳二亞胺、N服活化劑、W及巧光 素標(biāo)記的抗人丫-干擾素抗體。
[0020] 進(jìn)一步的，還包括酪蛋白溶液和丫-干擾素標(biāo)準(zhǔn)品。
[0021] 借由上述方案，本發(fā)明至少具有W下優(yōu)點(diǎn)；1)流式液相蛋白定量技術(shù)是借助流式 細(xì)胞儀通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和巧光標(biāo)記法完成對(duì)可溶性蛋白進(jìn)行定性定量的一種分析技術(shù)， 隨著流式細(xì)胞儀的普及和廣泛使用，W巧光微球作為載體的生物檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)滲透到細(xì)胞 生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。由于流式細(xì)胞儀具有可根據(jù)微球粒徑及所 帶特征巧光信號(hào)對(duì)微球進(jìn)行特異性識(shí)別的能力，因此可利用巧光微球結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)建立 特異分子的檢測(cè)技術(shù)。駿基巧光微球由于自身具有發(fā)光的特性，加上駿基可W和抗體的氨 基進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，從而具有特異的祀向性。本發(fā)明利用巧光微球標(biāo)記抗丫-干擾素抗體結(jié) 合流式細(xì)胞術(shù)建立的丫-干擾素定量檢測(cè)方法及試劑盒，具有操作較為簡(jiǎn)單、同時(shí)有效實(shí) 現(xiàn)丫干擾素定量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。2)本發(fā)明所采用的巧光微球具有粒徑均一、穩(wěn)定性好，比表 面積大、可通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)的方法和相應(yīng)的抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了抗體的"細(xì)胞"化。3)只需一步 既可W實(shí)現(xiàn)丫-干擾素的快速定量檢測(cè)，省去了傳統(tǒng)方法的洗漆步驟，規(guī)避了在操作過(guò)程 造成交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，增加了檢測(cè)結(jié)果的可信度。4)通過(guò)增加不同粒徑大小的微球和相應(yīng) 的目的抗體偶聯(lián)，同時(shí)添加到同一個(gè)樣本中，從而實(shí)現(xiàn)單一樣本的多個(gè)項(xiàng)目的同時(shí)檢測(cè)，省 時(shí)省力。
[0022] 上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 并可依照說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容予W實(shí)施，W下W本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明如后。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1是本發(fā)明中抗原抗體復(fù)合物的模式圖；
[0024] 圖2是丫-干擾素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為125pg/ml時(shí)的流式細(xì)胞分析圖；
[0025] 圖3是倍比稀釋丫 -干擾素標(biāo)準(zhǔn)品的巧光值標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0026] 圖4是本發(fā)明技術(shù)方法與國(guó)外相關(guān)試劑盒的相關(guān)性分析。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。W下實(shí)施 例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0028] 實(shí)施例一
[0029] 本發(fā)明的丫-干擾素定量檢測(cè)方法，包括W下步驟：
[0030] 1)捕獲巧光微球的制備
[0031] 為了實(shí)現(xiàn)捕獲微球的祀向性，需要對(duì)巧光微球進(jìn)行抗丫-干擾素抗體的化學(xué)偶聯(lián) (碳二亞胺法）：
[00扣]a、取1 y L200-220nm的巧光微球（激發(fā)波長(zhǎng)488nm)懸液（約1 X 1〇5個(gè)/ y L)用 洗漆液（PBS 0. Olmol/L，抑7. 4)洗一遍；
[003引 b、加入80化偶聯(lián)緩沖液（化畔04,0. lmol/1，P冊(cè).。和10化碳二亞胺和 N服(5mg/mL)活化劑，混勻；
[0034] C、室溫下避光搖振20分鐘；
[00對(duì) d、向活化微球中加入100 y 1(4 y g/mL)鼠源抗人丫 -干擾素抗體（購(gòu)自 invitrogen)，混勻；
[0036] e、室溫下避光搖振2小時(shí)；
[0037] f、用洗漆液洗3次；
[003引 g、加入 200 y L 封閉液（0. Olmol/1 PBS+1% BSA+0. 02% NaNs);
[0039] h、室溫下避光搖振1小時(shí)；
[0040] i、將包被好的微球放在 800 y L 儲(chǔ)存緩沖液（0. Olmol/lPBS+1 % BSA+0. 02% NaNs) 中4 °C避光保存。
[0041] 2) 丫-干擾素的體外釋放
[0042] 本方法檢測(cè)的丫-干擾素由結(jié)核菌特異性抗原刺激進(jìn)行丫-干擾素的體外釋放， 體外釋放的丫-干