熒光顯微篩檢生長(zhǎng)快和油脂高的微藻單細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是關(guān)于生物質(zhì)能利用技術(shù)，特別設(shè)及巧光顯微篩檢生長(zhǎng)快和油脂高的微藻 單細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 微藻對(duì)太陽(yáng)能利用效率高、生長(zhǎng)繁殖迅速、對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)、油脂產(chǎn)量高。據(jù) 報(bào)道微藻的光合作用轉(zhuǎn)化效率理論值可達(dá)10%，在單位面積上每年油脂產(chǎn)量可達(dá)棟桐油產(chǎn) 量的8?24倍化U et al.，2008)?；痠sti (化isti，2007)建立數(shù)學(xué)模型計(jì)算得到微藻生 物柴油是取代石化油的重要選擇，化eng等人發(fā)現(xiàn)核福射誘變可W顯著提高小球藻的生長(zhǎng) 速率和生物質(zhì)密度煙leng et al.,2013a)?；痮zin等人綜述了缺氮條件下娃藻油脂合成 中基因的表達(dá)情況化 hozin-Goldberg and Cohen, 2011)，Mock 等人（Mock et al., 2008) 發(fā)現(xiàn)在缺娃條件下娃藻化alassiosira pseudonana有75對(duì)基因誘導(dǎo)。但是微藻生長(zhǎng)速 率與其富集油脂之間存在相互矛盾，當(dāng)絕大多數(shù)微藻達(dá)到最高的生長(zhǎng)速率時(shí)，其細(xì)胞中油 脂含量往往比較低；而人為控制細(xì)胞生長(zhǎng)的宏觀條件（溫度、光照、pH、氮源、碳源等）使微 藻細(xì)胞內(nèi)油脂含量增加時(shí)，其細(xì)胞的生長(zhǎng)速率W及微藻對(duì)于太陽(yáng)能的轉(zhuǎn)化效率則會(huì)明顯降 低。國(guó)外一些主要的研發(fā)機(jī)構(gòu)都將高產(chǎn)油藻株的種質(zhì)創(chuàng)新列為整個(gè)微藻產(chǎn)油系統(tǒng)工程中的 首要位置，故如何獲得生長(zhǎng)速率快、油脂含量高的優(yōu)勢(shì)藻種是關(guān)鍵問(wèn)題。
[0003] 傳統(tǒng)測(cè)量微藻生長(zhǎng)速率的方法是將藻細(xì)胞接種后擴(kuò)大培養(yǎng)數(shù)日，然后過(guò)濾脫水和 烘干測(cè)量單位體積藻液中的生物質(zhì)密度。但是該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力成本較高，尤其是對(duì)于大量 篩檢核誘變后的成千上萬(wàn)個(gè)藻種突變體時(shí)，往往因工作量過(guò)于龐大而難W完成全部篩檢任 務(wù)。例如將菱形藻液（含有藻細(xì)胞約6. 7X 1〇5個(gè)/mL)在lOOGy的丫射線下進(jìn)行核福射 誘變，由于藻細(xì)胞致死率約為60 %，故至少會(huì)產(chǎn)生2. 7 X 105個(gè)/mL突變單細(xì)胞活體。利用 巧光顯微鏡自動(dòng)移位對(duì)焦的電子控制載物臺(tái)新技術(shù)、W及配套的CCD相機(jī)在白光條件下對(duì) 大量藻細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)掃描拍攝，通過(guò)辨別藻細(xì)胞顏色進(jìn)行定量化數(shù)據(jù)分析則有希望高速篩 選出生長(zhǎng)速率快的藻細(xì)胞，而目前關(guān)于該方面的研究報(bào)道還比較少。
[0004] 巧羅紅染色利用巧光定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)油脂含量由Greenspan最早提出 (Greenspan et al. , 1985)，此方法的準(zhǔn)確性已在多種生物中被證實(shí)（Genicot et al.，2005出uang et al.，2009)，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的稱重法對(duì)細(xì)胞內(nèi)油脂含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。由于巧 羅紅在水中很快發(fā)生巧光澤滅，多余的染料無(wú)需清除，與蘇丹黑、巧羅藍(lán)-A等染料比較，巧 羅紅能夠準(zhǔn)確地將細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì)與其他貶藏物區(qū)分開來(lái)（Kranz et al.，1997)，經(jīng)常被 用于檢測(cè)動(dòng)物W及微生物細(xì)胞內(nèi)油脂情況。故利用巧羅紅與油脂成分結(jié)合后在巧光顯微鏡 下發(fā)出巧光的特性，建立一套利用巧光顯微測(cè)量藻細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的油脂含量，是一種快 速篩檢高產(chǎn)油藻種的高效可行方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種巧光顯微篩檢生長(zhǎng)快和 油脂高的微藻單細(xì)胞的方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的解決方案是：
[0006] 提供巧光顯微篩檢生長(zhǎng)快和油脂高的微藻單細(xì)胞的方法，具體包括下述步驟：
[0007] (1)取5 y L微藻液體接種至固體平板培養(yǎng)基進(jìn)行單細(xì)胞分離，將藻細(xì)胞取出接種 到20mL培養(yǎng)基，放入=角瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得許多株單細(xì)胞藻液；
[000引 似用96孔板接種300化單細(xì)胞藻液，初始接種抑調(diào)至8?9,在恒溫20?30°C、 光照強(qiáng)度5000?70001UX、光照2化條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定期；將96孔板置于巧光顯微鏡自動(dòng) 移位對(duì)焦的電子控制載物臺(tái)上，利用顯微鏡配套的CCD相機(jī)在白光條件下對(duì)96孔板中每孔 的藻細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)掃描拍攝，利用顯微鏡圖像處理軟件通過(guò)拍攝的顯微鏡圖像對(duì)每孔藻細(xì) 胞的顏色進(jìn)行定量化數(shù)據(jù)分析，篩選出生長(zhǎng)速率快（生長(zhǎng)速率>0.4g/L，d)的優(yōu)勢(shì)微藻單 細(xì)胞（由于藻細(xì)胞密度越大時(shí)顏色越深則表明生長(zhǎng)速率越快，從而能夠篩選出生長(zhǎng)速率快 的優(yōu)勢(shì)微藻單細(xì)胞）；
[0009] 做用0. Ig/L的巧羅紅巧光染料Nile/DMSO對(duì)步驟似中篩選得到生長(zhǎng)速率快的 微藻單細(xì)胞進(jìn)行染色，巧羅紅巧光染料終濃度達(dá)到0. Img/l，染色時(shí)間7min ;將染色藻細(xì)胞 置于巧光顯微鏡的載物臺(tái)上，在EX 450-490nm波長(zhǎng)下結(jié)合圖像處理軟件觀察測(cè)量藻細(xì)胞 的巧光強(qiáng)度，測(cè)量視野中所有藻細(xì)胞的面積W及細(xì)胞內(nèi)所有油滴的面積，計(jì)算藻細(xì)胞的油 脂含量，從而篩選出油脂含量高（油脂含量> 40% )的優(yōu)勢(shì)微藻單細(xì)胞；
[0010] 油脂含量的計(jì)算方法為：
[0011] 油脂含量L'Ca = ^x1(K)%其中Ac為藻細(xì)胞的面積總和（ym2)，A歷細(xì)胞中油脂 顆粒的面積總和（ym2)。
[0012] 本發(fā)明中，所述培養(yǎng)基的組分及配比關(guān)系為；0. 15g化肥化、0. 02g皿2口〇4、〇. 〇27g VBi、1. 5X 10-6g VBi2、〇.2g Na2SiO3.9H2CKl.Og NaN〇3、0.0005g Biotin、1血微量元素和 980血人工海水。
[001引本發(fā)明中，所述微量元素的組分及配比關(guān)系為；1000血蒸饋水中含有4. 35g 化2邸TA、7. 3mg Na2Mo04?2H20、12mgCoCl2*6H20、3. 9g 化〔6&07?5&0、10111肖 CuS04?5H20、 23mg ZnS04、178mg MnClg ?軸20 和 600mg H3BO3。
[0014] 本發(fā)明中，所述人工海水的組分及配比關(guān)系為（鹽度=3.0%) :1000血蒸饋水中 含有 21.2157g 化Cl、3. 407g Na2S〇4、0. 3577g KC1、9. 3042g MgCl2.6H2〇、1.3044g CaCls、 0. 0862g 邸r、0. 0226g &8〇3、0. 2760g NaF 和 0. 0219g SrCla ? 6&0。
[0015] 本發(fā)明中，所述微藻液體中的藻種是下述任意一種；從自然環(huán)境中篩選得到的天 然藻種、物理化學(xué)誘變得到的藻種突變體或經(jīng)過(guò)基因改良得到的轉(zhuǎn)基因藻種。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0017] 利用巧光顯微鏡自動(dòng)移位對(duì)焦的電子控制載物臺(tái)和巧羅紅染色技術(shù)，在白光條件 下定量分析藻細(xì)胞的顏色數(shù)據(jù)篩選出生長(zhǎng)速率快的藻細(xì)胞，然后根據(jù)藻細(xì)胞及油滴的巧光 強(qiáng)度測(cè)量計(jì)算出油脂含量，從而能夠在10分鐘左右對(duì)96孔板的藻細(xì)胞快速篩檢出生長(zhǎng)速 率快（>0.4g/L'd)和油脂含量高（>40%)的優(yōu)勢(shì)藻株，大大提高了篩選目標(biāo)藻株的工 作效率，減少了勞動(dòng)時(shí)間成本。
【附圖說(shuō)明】
[001引圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合附圖與【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述：
[0020] 如圖1所示一種巧光顯微篩檢生長(zhǎng)快和油脂高的微藻單細(xì)胞的方法，具體包括下 述步驟：
[0021] (1)取5 y L微藻液體接種至固體平板培養(yǎng)基進(jìn)行單細(xì)胞分離，所述微藻液體的藻 種包括從自然環(huán)境中篩選得到的天然藻種、物理化學(xué)誘變得到的藻種突變體、經(jīng)過(guò)基因改 良得到的轉(zhuǎn)基因藻種。將藻細(xì)胞取出接種到20mL培養(yǎng)基，放入S角瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。
[00。] 所述培養(yǎng)基的組分及配比關(guān)系為；0. 15g NaHC〇3、0. 02g皿2口〇4、〇. 〇27g VBi、 1.5Xl〇-6g VBi2、0. 2g Na2Si〇3.9H2〇、1.0g NaN〇3、0. 0005g BiotinUmL 微量元素和 980mL 人工海水。所述微量元素組分及配比關(guān)系為；1000血蒸饋水中含有4. 35g化2邸TA、7. 3mg NagMoO* ? 2H2〇、12mgCoCl2 ? 6&0、3. 9g 化〔6&〇7 ? 5H2〇、10mg OiS〇4 ? 5H2〇、23mg ZnS〇4、178mg MnCla .A&O和600mg H3BO3。所述人工海水配方（鹽度=3. 0% )為；1000血蒸饋水中含有 21.2157g NaCl、3. 407g Na2S〇4、0. 3577g KC1、9. 3042g MgCl2.6H2〇、1.3044g CaCl2、0. 0862g 邸r、0. 0226g &8〇3、0. 2760g NaF 和 0. 0219g SrCla ? 6&0。
[002引 似用96孔板接種300化單細(xì)胞藻液，初始接種抑調(diào)至8?9,在恒溫20?30°C、 光照強(qiáng)度5000?70001UX、光照2化條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定期；將96孔板置于巧光顯微鏡自動(dòng) 移位對(duì)焦的電子控制載物臺(tái)上，利用顯微鏡配套的CCD相機(jī)在白光條件下對(duì)96孔板中每孔 的藻細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)掃描拍攝，利用顯微鏡圖像處理軟件對(duì)每孔藻細(xì)胞的顏色進(jìn)行定量化數(shù) 據(jù)分析。由于藻細(xì)胞密度越大時(shí)顏色越深則表明生長(zhǎng)速率越快，從而能夠篩選出生長(zhǎng)速率 快（> 0. 4g/L ? d)的優(yōu)勢(shì)微藻單細(xì)胞；
[0024] (3)用0. Ig/L的巧羅紅巧光染料Nile/DMSO對(duì)篩選得到生長(zhǎng)速率快的微藻單細(xì)胞 進(jìn)行染色，巧羅紅巧光染料終濃度達(dá)到0. Img/l，染色時(shí)間7min ;將染色藻細(xì)胞置于巧光顯 微鏡的載物臺(tái)上，在EX 450-490nm波長(zhǎng)下結(jié)合圖像處理軟件觀察測(cè)量藻細(xì)胞的巧光強(qiáng)度， 測(cè)量視野中所有藻細(xì)胞的面積W及細(xì)胞內(nèi)所有油滴的面積，計(jì)算藻細(xì)胞的油脂含量，從而 篩選出油脂含量高40% )的優(yōu)勢(shì)微藻單細(xì)胞；
[0025] 油脂含量的計(jì)算方法為：
[0026] 油脂含量= 其中Ac為藻細(xì)胞的面積總和（ym 2)，A巧細(xì)胞中油脂 C ? 顆粒的面積總和（ym2)。
[0027] 下面的實(shí)施例可W使本專業(yè)的專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不W任何方 式限制本發(fā)明。
[00測(cè)實(shí)施例1
[0029] (1)取5 y L菱形藻液體接種至固體平板培養(yǎng)基進(jìn)行單細(xì)胞分離，將藻細(xì)胞取出接 種到20mL培養(yǎng)基，放入S角瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0030] 所述培養(yǎng)基的組成為；0. 15g NaHC〇3、0. 02g 皿2口〇4、〇. 〇27g VBi、l. 5Xl〇-6g VBi2、 0. 2g Na2SiO3.9H2OJ.Og NaN〇3、0. 0005g BiotinU血微量元素和 980血人工海水；所 述微量元素主要成分為；1〇〇〇血蒸饋水中含有4. 35g化2邸TA、7. 3mg Na2Mo〇4.2H2〇、 12mgCoCl2*6H2〇、3. 9g FeCeH5〇7*5H2〇、10mg CuS〇4*5H2〇、23mg ZnS〇4、178mg MnClg.A