專利名稱：生物活性探針及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫檢測技術(shù)，特別涉及一種可直接檢測生物分子活性的探針及制備方法和用途。
目前免疫檢測技術(shù)中所使用的檢測方法如文獻1，楊宜為編著，“免疫檢測技術(shù)”，科學(xué)出版社，158(1991)中所述的。免疫熒光技術(shù)是一種免疫分子檢測技術(shù)，它以熒光染料為待測分子標記物，因為熒光染料(色素)不但能和抗體蛋白結(jié)合，用于檢測或定位各種抗原，也可以與其它蛋白質(zhì)結(jié)合，用于檢測或定位各種抗體，識別和測定免疫分子活性。但是，這些方法必須以熒光色素為待測分子標記物，而要求所用的熒光色素具有一定的熒光效率或量子產(chǎn)量，以及其他條件，但大多數(shù)熒光色素不能滿足這些條件；在該技術(shù)中還要求制備高效價的特異性抗血清，為此，免疫的抗體必須高度提純，這將造成工藝上麻煩。還要經(jīng)過標本染色，再用昂貴的熒光顯微鏡觀察。雖然該方法特異性強，速度快(染色步驟和顯微鏡檢查能在1-2小時內(nèi)完成)，敏感性高。但是，該方法中的非特異性染色問題尚未解決，結(jié)果判定的客觀性不足，工藝過程也比較復(fù)雜。需要特殊昂貴的熒光顯微鏡。并制備出的染色標本只能作短期觀察，不能長期保存。熒光的強度隨Ph值和熒光染料與抗體的比例而改變，而且對熒光強度的判定帶有一定的主觀性。
在免疫檢測技術(shù)中還使用一種免疫酶技術(shù)的檢測方法如文獻2，朱培坤，“免疫酶技術(shù)”，山東科學(xué)技術(shù)出版社，3(1983)中所述的。最初發(fā)展的免疫酶檢測方法是使酶與抗原或抗體結(jié)合，用于檢查組織中相應(yīng)的抗原和抗體的存在。后來發(fā)展為將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進行免疫染色，底無顯色后用肉眼或分光度計來判斷結(jié)果。也就是說免疫酶技術(shù)是將抗原和抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)相結(jié)合的免疫分子檢測技術(shù)。該方法的敏感性和特異性同免疫熒光技術(shù)相當，它不需特殊的熒光顯微鏡，應(yīng)用范圍廣泛。但是該方法中使酶與抗體(或抗原)交聯(lián)起來的工藝與條件，直接影響酶標抗體(或抗原)的活性，從而影響免疫酶技術(shù)的使用。只有獲得一定數(shù)量的純化酶才能用于對抗體(或抗原)的標記，或者在非標記免疫酶技術(shù)中作為抗原使用。在免疫酶技術(shù)的固相載體方法中，固相載體的選擇是否合適，會直接影響實驗結(jié)果。在免疫酶技術(shù)的組織化學(xué)方法中，則要注意消除組織中內(nèi)源酶染色與非特異性染色的干擾，否則會使實驗達不到預(yù)期的目的。
另外在免疫檢測技術(shù)中還有一種檢測方法如文獻1，楊宜為編著，“免疫檢測技術(shù)”，科學(xué)出版社，158(1991)中所述的“放射免疫測定”方法。該方法是目前使用最廣泛的免疫分子檢測方法，它有特異性強，靈敏度高，能夠精確地測定體液中的微量活性物質(zhì)的優(yōu)點。但是，嚴重的缺點是，不得不使用放射性物質(zhì)為分子標記物，同時需要特殊的檢測儀器和安全防護器材，造成實驗設(shè)備昂貴，實驗操作要求嚴格，實驗室中各種試劑、各種儀器、各個步驟等方面的細微變化，都可能造成測定誤差。由于該技術(shù)使用放射物質(zhì)，所以易對環(huán)境和操作者造成污染和傷害。
本發(fā)明的目的在于克服上述已有技術(shù)的缺點和不足，為了檢測過程中既不使用放射性物質(zhì)又不使用標記物，盡可能減少影響檢測結(jié)果的因素；為了提高檢測靈敏度，可直接實時檢測生物分子活性和生物分子作用的動態(tài)過程，從而提供一種可用于內(nèi)分泌學(xué)、免疫病理學(xué)、血液學(xué)、寄生蟲學(xué)、微生物學(xué)、人體及動物病毒學(xué)、植物病毒學(xué)、獸醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)、細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及藥物學(xué)、食品衛(wèi)生學(xué)等學(xué)科；可用于醫(yī)院臨床疾病和健康狀況診斷；并且使用簡單，價格低廉的快速生物活性探針及制備方法和用途。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明提供的生物活性探針包括三層結(jié)構(gòu)；第一層為固體基片，第二層為在固體基片上經(jīng)化學(xué)方法處理形成親或疏水極化表面層；然后在此表面上制備一層具有生物活性的單分子吸附膜層，以形成探測生物活性的感應(yīng)表面膜層為第三層。
將上述已制作好的感應(yīng)表面膜層放入含有待測活性分子的溶液中，利用探針上的具有生物活性的感應(yīng)表面及生物分子的特異結(jié)合性，溶液中的活性分子與感應(yīng)表面上的相應(yīng)活性分子相結(jié)合，而形成復(fù)合分子，使感應(yīng)表面的形貌發(fā)生變化，即出現(xiàn)表面復(fù)合膜層或復(fù)合分子進入溶液使原表面的感應(yīng)膜層部分或全部消失。此表面形貌的變化可以通過橢偏成像系統(tǒng)觀察到，以此判定溶液中生物活性存在與否。
本發(fā)明提供的生物活性探針的制備方法依下列步驟進行
1、固體基片表面處理。
a、首先把所需大小的固體基片表面經(jīng)常規(guī)的清潔處理；b、表面親水化處理將上述清潔處理干凈的固體基片在清洗液1中清洗5分鐘；再放入清洗液2中清洗5分鐘后，即得表面親水化處理的固體基片；其中清洗液配方如下清洗液1組分H2O∶H2O2(濃度30％wt)∶NH4OH(濃度25％wt)=5∶1∶1(V/V)清洗液2組分H2O∶H2O2(濃度30％wt)∶HCl(濃度37％ wt)=6∶1∶1(V/V)c、或者表面疏水化處理將上述親水化處理好的固體基片放入按4∶1(V/V)=三氯乙烯∶硅烷的溶液中，浸泡5分鐘，即得表面疏水化處理的固體基片；2、具有生物活性的感應(yīng)膜層制備將固體基片表面經(jīng)親水化處理或表面疏水化處理好的固體基片的一端浸入生物分子溶液內(nèi)自然吸附生物分子，浸泡的時間根據(jù)溶液濃度來定，以吸附飽和為止，取出后用去離子水洗凈，即得具有感應(yīng)表面的生物分子的活性探針。
其中所述的固體基片包括半導(dǎo)體材料(硅片、鍺片等)、玻璃、金屬、塑料和固體復(fù)合材料，如半導(dǎo)體表面鍍金屬膜的基片等。
其中所述的生物分子包括各種具有特異性結(jié)合的生物分子。
本發(fā)明的生物分子活性探針可對多種生物分子溶液(如人體的體液、血液去細胞后的液體、尿液去不溶物等生物分子溶液)進行生物分子的活性檢測，將具有感應(yīng)表面的生物分子的活性探針的一部分浸入待測分析物溶液，經(jīng)一定反應(yīng)時間(時間長短根據(jù)溶液濃度而定)，溶液中的分子與感應(yīng)表面上的分子特異性結(jié)合，形成分子復(fù)合物，使感應(yīng)表面的形貌發(fā)生變化，即出現(xiàn)表面復(fù)合膜層或復(fù)合分子進入溶液，使原表面的感應(yīng)膜層部分或全部消失。此表面形貌的變化可以通過橢偏成像系統(tǒng)觀察到，以此判定溶液中生物活性存在與否。
本發(fā)明的用途包括1)優(yōu)化免疫測定；2)篩選，鑒定受體或配體；
3)免疫特異識別機理的研究；4)內(nèi)分泌激素檢測；5)生物活性探測；6)藥物篩選；7)常規(guī)門診免疫檢測。
可用于內(nèi)分泌學(xué)、免疫病理學(xué)、血液學(xué)、寄生蟲學(xué)、微生物學(xué)、人體及動物病毒學(xué)、植物病毒學(xué)、獸醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)、細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及藥物學(xué)、食品衛(wèi)生學(xué)等學(xué)科的研究。
可用于醫(yī)院臨床疾病和健康狀況診斷。
本發(fā)明的優(yōu)點及效果1、本發(fā)明提供的生物活性探針克服了已有檢測方法必須要標記物的缺點，使用本發(fā)明的探針進行檢測無須標記物；2、對待測分析物無特殊要求；待測樣品用量少；只需幾微升至幾百微升；3、直接測量非純化分析物；4、可以通過橢偏成像系統(tǒng)直接觀察到溶液中生物活性存在與否，實時檢測生物分子活性作用的動態(tài)過程；5、能夠有效排除非特異性吸附、脫吸附或表面污染帶來的誤差，具有分辨和排除干擾信號能力；6該方法操作簡單、只需兩步，檢測速度快，一般性檢測只需30分鐘7、檢測靈敏度高，同放射免疫方法的靈敏度相當；8、適用范圍廣，可在氣、液相中進行檢測。
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細說明

圖1是本發(fā)明生物活性探針的結(jié)構(gòu)示意2是本發(fā)明生物活性探針進行檢測的變化示意圖實施例1按圖1制作一抗IgG生物活性探針，圖1中抗IgG生物活性探針包括以下三層組成1-固體基片；2-親或疏水極化處理表面層；3-具有生物活性的感應(yīng)膜層。
其制備一抗IgG生物活性探針的方法如下
1)表面處理(疏水處理)將按常規(guī)清洗干凈的6×20mm2的硅片(1)先在清洗液1中清洗5分鐘，再在清洗液2中清洗5分鐘進行親水處理；清洗液1H2O∶H2O2(濃度30％wt)∶NH4OH(濃度37％wt)=5∶1∶1(V/V)清洗液2H2O∶H2O2(濃度30％wt)∶HCl(濃度25％wt)=6∶1∶1(V/V)；將親水處理好的該表面放入4∶1(V/V)三氯乙烯∶硅烷，浸泡5分鐘，即得到疏水極化處理表面層(2)；2)具有生物活性的感應(yīng)膜層(3)的制備將上述制備好的基片的一部分浸入人血免疫球蛋白G(IgG)(1mg/ml)溶液內(nèi)自然吸附，持續(xù)30分鐘時間，然后取出，用去離子水洗凈，即得具有探測抗IgG的感應(yīng)表面層(3)的生物活性探針。
3)用于進行抗IgG活性探測如圖2所示，將上述制備好的部分感應(yīng)表面浸入待測抗人血免疫球蛋白G(IgG0.1mg/ml的分子溶液(不同的生物活性探針，可以浸入任意種生物分子溶液進行檢測)，以自然吸附飽和為止，如果溶液中有抗IgG分子，那麼溶液中抗IgG分子與感應(yīng)表面上的IgG分子特異性結(jié)合，形成IgG/抗IgG分子復(fù)合物，使感應(yīng)表面出現(xiàn)表面分子復(fù)合膜層，可以通過橢偏成像系統(tǒng)觀察到，以此判定溶液中抗IgG生物活性存在。
上述3)的探針和檢測方法可用于免疫學(xué)研究及多種免疫檢測。
實施例2制備一種抗HSA活性探針1)表面處理(親水處理)將6×20mm2的硅片上鍍金膜(50納米厚)為固體基片(1)，在清洗液2H2O∶H2O2(濃度30％wt)∶HCl(濃度37％wt)=6∶1∶1(V/V)中處理5分鐘，得到親水極化處理表面層(2)；2)具有生物活性的感應(yīng)膜層(3)的制備將親水處理的基片的一部分浸入人血清白蛋白HSA(1mg/ml)溶液內(nèi)自然吸附，持續(xù)30分鐘時間，然后取出、洗凈即得到在親水處理的基片上有一層具有探測抗HSA的感應(yīng)表面層(3)，而成為一種抗HSA活性探針。
3)用本實施例制作的抗HSA活性探針的檢測過程將部分感應(yīng)表面浸入待測抗HSA分子溶液(0.1mg/ml)，經(jīng)一定反應(yīng)時間，溶液中抗HSA分子與感應(yīng)表面上的HSA分子特異性結(jié)合，形成HSA/抗HSA分子復(fù)合物，使感應(yīng)表面出現(xiàn)表面分子復(fù)合膜層，可以通過橢偏成像系統(tǒng)觀察到，以此判定溶液中抗HSA生物活性存在。實施例3制備一種抗BSA活性探針1)表面處理(疏水處理)將清洗干凈的6×20mm2硅片先在清洗液1中清洗5分鐘，再在清洗液2中清洗5分鐘；清洗1液H2O∶H2O2(濃度30％wt)∶NH4OH(濃度25％wt)=5∶1∶1(V/V)清洗2液H2O∶H2O2(濃度30％ wt)∶HCl(濃度37％wt)=6∶1∶1(V/V)；將該硅片表面放入4∶1(V/V)三氯乙烯∶硅烷，浸泡5分鐘，即得到在硅片上疏水極化處理表面層(2)；2)具有生物活性的感應(yīng)膜層(3)的制備將表面疏水處理的硅片的一部分浸入牛血清白蛋白BSA(1mg/ml)溶液內(nèi)自然吸附，持續(xù)30分鐘時間，然后取出，洗凈，即得到在表面疏水處理的硅片上具有探測抗BSA的感應(yīng)膜層(3)，而作成一種抗BSA活性探針。
3)本實施例制備的抗BSA活性探針應(yīng)用實時液相抗BSA活性探測過程將部分感應(yīng)表面浸入樣品池中，在樣品池中加入抗BSA溶液，通過橢偏成像系統(tǒng)實時拍攝牛血清白蛋白與其抗體特異性結(jié)合過程。隨著時間的延長BSA/抗BSA分子復(fù)合物膜層逐漸增厚，直到膜層厚度不再變化時停止拍攝。根據(jù)膜層厚度的變化就可判定抗BSA生物活性。
權(quán)利要求
1.一種生物活性探針，其特征在于包括三層結(jié)構(gòu)，第一層為固體基片，第二層為在固體基片上經(jīng)化學(xué)方法處理形成親或疏水極化表面層；第三層為在第二層上吸附一層具有生物活性的感應(yīng)表面膜層。
2.按權(quán)利要求1所述的一種生物活性探針，其特征在于所說的固體基片包括半導(dǎo)體材料、玻璃、金屬、塑料和固體復(fù)合材料。
3.按權(quán)利要求1所述的一種生物活性探針，其特征在于所說的半導(dǎo)體材料包括硅片、鍺片、砷化鎵、鎘、硒。
4.按權(quán)利要求1所述的一種生物活性探針，其特征在于所說的固體復(fù)合材料包括半導(dǎo)體表面鍍金屬膜的基片和玻璃、金屬、塑料材料表面鍍金屬膜。
5.一種制備權(quán)利要求1所述的生物活性探針的方法，其特征在于依下列步驟進行(1)固體基片表面極化改性處理a、首先把所需大小的固體基片(1)表面經(jīng)常規(guī)的清潔處理；b、將上述清潔處理干凈的固體基片(1)在清洗液1中清洗5分鐘，再放入清洗液2中清洗5分鐘，得到具有表面親水極化處理層(2)的固體基片；其中清洗液配方如下清洗1液組分H2O∶H2O2(濃度30％wt)∶NH4OH(濃度25％wt)=5∶1∶1(V/V)；清洗2液組分H2O∶H2O2(濃度30％wt)∶HCl(濃度37％wt)=6∶1∶1(V/V)；(2)具有生物活性的感應(yīng)膜層的制備將固體基片表面經(jīng)親水化處理或表面疏水化處理好的固體基片的一端浸入生物分子溶液內(nèi)自然吸附生物分子，浸泡的時間根據(jù)溶液濃度來定，以吸附飽和為止，取出后用去離子水洗凈。
6.按權(quán)利要求5所述的生物活性探針的制備方法，其特征在于所述的固體基片表面處理，還包括表面疏水化處理，將親水化處理好固體基片再放入按4∶1(V/V)=三氯乙烯∶硅烷的溶液中，浸泡5分鐘；
7.按權(quán)利要求5所述的生物活性探針的制備方法，其特征在于所述的生物分子溶液包括各種具有特異性結(jié)合的生物分子配制的溶液。
8.應(yīng)用權(quán)利要求1的生物活性探針檢測生物分子溶液中生物活性的方法，其特征在于將具有感應(yīng)表面的生物分子的活性探針的一部分浸入待測分析物溶液，經(jīng)溶液中的分子與感應(yīng)表面上的分子特異性結(jié)合反應(yīng)，其反應(yīng)時間取決于溶液濃度，形成分子復(fù)合物，使感應(yīng)表面的形貌發(fā)生變化，在表面出現(xiàn)復(fù)合膜層或復(fù)合分子進入溶液，使原表面的感應(yīng)膜層部分或全部消失；該表面形貌的變化再通過橢偏成像系統(tǒng)觀察到，判定溶液中生物分子生物活性存在與否。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可直接檢測生物分子活性的探針及制備方法和用途。該探針由固體基片和經(jīng)處理形成親或疏水極化表面,在該表面上制備一層具有生物活性的單分子吸附膜層作為探測生物活性的感應(yīng)表面膜層組成。將活性探針的一部分浸入待測分析物溶液,經(jīng)溶液中的分子與感應(yīng)表面上的分子特異性結(jié)合反應(yīng),形成分子復(fù)合物,使感應(yīng)表面的形貌發(fā)生變化,該表面形貌的變化再通過橢偏成像系統(tǒng)觀察到,判定溶液中生物活性存在與否。
文檔編號G01N33/50GK1289045SQ9911948
公開日2001年3月28日 申請日期1999年9月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月20日
發(fā)明者靳剛 申請人:中國科學(xué)院力學(xué)研究所