專(zhuān)利名稱(chēng)：樣本的組群或子組群的選定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及從樣本中分離出所需或不需組群或子組群以便單獨(dú)得到所需組群或子組群，或在一個(gè)或多個(gè)不需子組群從其中除去后得到一個(gè)強(qiáng)化組群或子組群的方法。更具體點(diǎn)說(shuō)，本發(fā)明的目標(biāo)是要分離出所需或不需組群或子組群，例如從骨髓或血液中分離出細(xì)胞，辦法是將組群或子組群結(jié)合到較密實(shí)的粒子中，然后利用重力沉積將組群或子組群從其余的樣本上層清液中分離出來(lái)。
樣本組群或子組群的強(qiáng)化可應(yīng)用于多種用途。例如在有B細(xì)胞淋巴瘤的情況下，可能需要在骨髓中除去所有的非何杰金氏的B淋巴瘤細(xì)胞。如果骨髓要清除B細(xì)胞并重新輸送給病人，那么要緊的是，骨髓必須完全凈化，否則骨髓會(huì)受到損害。
目前流行的一種方法是利用許多磁性的微球體，這些微球體通常是由具有較低密度的以聚合物為基的磁性材料制成。它們需要具有較低的密度，因?yàn)樗鼈儗⑴c骨髓或血液混合在一起并且專(zhuān)門(mén)被設(shè)計(jì)為不會(huì)被重力沉積法沉積出來(lái)。這些微球體典型地具有較小的尺寸，一般直徑約為或小于一微米。但美國(guó)紐約州Grest Neck的Dynal公司所銷(xiāo)售的一種采用磁性聚合物微球體的產(chǎn)品，其公稱(chēng)直徑為28或4.5微米，其較低的微球體密度約為1.5g/cc?，F(xiàn)有技術(shù)的微球體要求在樣本中維持懸浮狀態(tài)，因此被設(shè)計(jì)成為在樣本懸浮液中進(jìn)行極其緩慢的或基本上消失的重力沉積。
磁性微球體具有至少一個(gè)連結(jié)在其上的抗體專(zhuān)門(mén)針對(duì)所需除去的組群或子組群。通常，如在Dynal方法中，有一第一單克隆抗體連結(jié)到所關(guān)心的細(xì)胞并有一個(gè)專(zhuān)門(mén)針對(duì)第一單克隆抗體的第二抗體連結(jié)在微球體上。這些細(xì)胞在連結(jié)到單克隆抗體之前通常先從整個(gè)血液或骨髓中被分離出來(lái)然后被清洗，該清洗步驟不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成可辨別的損失。微球體和細(xì)胞隨后混合在一起并通過(guò)第一和第二抗體將微球體連結(jié)到細(xì)胞上。為了凈化血液或骨髓，一個(gè)樣本將和許多連結(jié)著微球體的抗體混合，然后被放置在一個(gè)磁場(chǎng)內(nèi)。當(dāng)微球體被保持在磁場(chǎng)內(nèi)時(shí)，剩下的樣本或上層清液即可除去。這道程序通常必須重復(fù)多次，因?yàn)閱我坏膬艋襟E往往不能把不需的組群或子組群排除到足夠的百分比。凈化的目標(biāo)是要把所有的(100％)作為目標(biāo)的組群或子組群都排除掉。這一點(diǎn)通常不能完全做到，此時(shí)只能盡可能地將樣本凈化到接近100％。
磁性排除程序存在著若干問(wèn)題。該程序在每一次進(jìn)行排除步驟時(shí)也從其他組群中非特定地排除掉一些細(xì)胞。這將減少產(chǎn)出，即其余的所需組群所占的百分比。這時(shí)單一的排除步驟將產(chǎn)生一個(gè)百分比較低的可變的產(chǎn)出，每一個(gè)接續(xù)步驟也將減少產(chǎn)出。另外，磁性微球體是比較費(fèi)錢(qián)的。
磁性微球體程序也被用來(lái)強(qiáng)化子組群以便研究該子組群。在這種情況下，磁性微球體被連結(jié)到所需子組群上，而連結(jié)著細(xì)胞的微球體則從樣本中被排除。這樣子組群便可直接被研究或者可從微球體中除出來(lái)供研究。這個(gè)程序非常耗費(fèi)時(shí)間，大約需要耗費(fèi)一至六個(gè)小時(shí)或更長(zhǎng)，并且可議論的是未能產(chǎn)生一個(gè)原來(lái)的子組群，這是因?yàn)樽咏M群已有至少一個(gè)單克隆抗體連結(jié)到至少一種細(xì)胞抗原上。
凈化的另一用途是研究或強(qiáng)化一個(gè)特定的子組群，例如淋巴細(xì)胞(L)的CD4組群。在這種情況下，微球體具有專(zhuān)門(mén)針對(duì)一個(gè)或多個(gè)非CD4組群的單克隆抗體連結(jié)在其上。排除其他組群可提高樣本的總共留下的細(xì)胞組群內(nèi)的CD4細(xì)胞數(shù)。但當(dāng)采用磁性微球體時(shí)，一部分CD4子組群的非特定的排除能夠嚴(yán)重地影響到CD4子組群留下來(lái)的數(shù)目。當(dāng)采用一個(gè)大體積的樣本如為5ml或更大時(shí)，由于需要大量的磁性微球體，細(xì)胞的非特定的排除會(huì)帶來(lái)更多的問(wèn)題。當(dāng)將磁性微球體放置在一個(gè)磁場(chǎng)內(nèi)時(shí)，其他非目標(biāo)的細(xì)胞的非特定的捕捉和排除帶會(huì)發(fā)生。
包括用抗體標(biāo)記的表面在內(nèi)的其它各種正面的或負(fù)面的選定方法都曾被應(yīng)用以便從一個(gè)不同型式的細(xì)胞混合物中產(chǎn)生細(xì)胞的子組群。這些方法通常都有抗體共價(jià)地連結(jié)到一個(gè)柱管內(nèi)的塑料表面或聚合物粒子上。一般地說(shuō)，要使這個(gè)混合的細(xì)胞組群與連結(jié)的抗體結(jié)合起來(lái)，或是將它們加入到一個(gè)柱管中任它們培育或是使它們沉積在一個(gè)表面上。要使這些程序順利進(jìn)行，須先將紅血球(RBC)和血漿從混合的細(xì)胞組群中除去，辦法是通過(guò)密度梯度制備一個(gè)血沉棕黃色層或一個(gè)單細(xì)胞核的制劑，然后清洗細(xì)胞并使它們與用抗體標(biāo)記的表面結(jié)合。這兩種方法在使用前都還需要準(zhǔn)備分離系統(tǒng)并用一緩沖劑沖洗，這樣在采用柱管和燒瓶的方法時(shí)，連同與抗體培育的時(shí)間30至60分鐘，整個(gè)程序需要至少三個(gè)小時(shí)。這些方法能夠用來(lái)對(duì)所關(guān)心的細(xì)胞組群進(jìn)行負(fù)面的或正面的選定。在這兩種方法中，直接分離造成高濃縮的組群，同時(shí)非特定地造成非目標(biāo)的細(xì)胞的損失。釋出的細(xì)胞在其表面上可具有抗體，這些細(xì)胞常被分離技術(shù)激活，而這通常是不希望有的。
實(shí)施本發(fā)明的方法和設(shè)備能夠應(yīng)用到各種免疫反應(yīng)上，如含有反應(yīng)劑和細(xì)胞的免疫反應(yīng)。本文在使用時(shí)，細(xì)胞被定義為動(dòng)物的或植物的細(xì)胞，包括細(xì)胞狀的細(xì)菌和真菌，這些細(xì)胞可分開(kāi)來(lái)或成為集合物予以辨認(rèn)。細(xì)胞是有生命物質(zhì)的最小的結(jié)構(gòu)集合體，它能作為獨(dú)立的單元而發(fā)揮其功能。例如，細(xì)胞可以是人體的組織、骨髓及/或血液的樣本中的紅血球(RBC)和白血球(WBC)組群、癌或其他不正常的細(xì)胞。適當(dāng)加標(biāo)志或標(biāo)記的細(xì)胞當(dāng)然可望像人體的血球或骨髓那樣以相同的方式用本發(fā)明的方法和設(shè)備來(lái)進(jìn)行操作。
本文在使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“反應(yīng)劑”被定義為各種分子，如單克隆或多克隆抗體，它們能夠檢測(cè)并與一個(gè)或多個(gè)在細(xì)胞表面上的特定的互補(bǔ)分子如抗原反應(yīng)。下面給出一些實(shí)例反應(yīng)劑特定分子抗體抗原藥劑藥劑受體激素激素受體生長(zhǎng)素 生長(zhǎng)素受體外源凝集素 碳水化合物分子核酸序列互補(bǔ)的核酸序列酶 余因子或抑制劑反應(yīng)劑偶合或連結(jié)到細(xì)胞上的特定分子上。因此需要有一個(gè)有效的方法來(lái)清除或選出一個(gè)或多個(gè)子組群而不影響樣本如全部血液和骨髓中的其余組群。這個(gè)方法應(yīng)該是化費(fèi)不多的、快速的、高收獲率的并且對(duì)所要作用的樣本的體積是沒(méi)有限制的。
本發(fā)明提供一種方法和設(shè)備可以用來(lái)從一個(gè)生物液體樣本如全部血液中分離出一個(gè)所需或不需的組群或子組群，不僅快速而且具有高收獲率。連結(jié)著一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)劑如單克隆或多克隆抗體的多個(gè)密實(shí)的、比較重的粒子與樣本混合在一起。連結(jié)在粒子上的抗體可瞄準(zhǔn)不感興趣的細(xì)胞。通過(guò)重力使連結(jié)著細(xì)胞的粒子分化沉積，然后除去其余的樣本。這樣便可提高在樣本中留下的關(guān)心細(xì)胞的數(shù)目，這種細(xì)胞是沒(méi)有被粒子作為目標(biāo)的。連結(jié)在粒子上的抗體也可瞄準(zhǔn)關(guān)心的細(xì)胞。然后可將樣本液體中的其余部分和非目標(biāo)的細(xì)胞從連結(jié)著目標(biāo)細(xì)胞的粒子中除去并分析確定除去了多少非目標(biāo)細(xì)胞。然后再將目標(biāo)細(xì)胞從粒子上取出以便進(jìn)一步分析。一種較好的有價(jià)值的粒子材料可能是鎳。鎳粒子在需要時(shí)能夠加熱來(lái)使粒子成為無(wú)菌。如果樣本已被凈化并要移植到人體內(nèi)，那么可用磁場(chǎng)和清洗程序來(lái)除去RBC并進(jìn)一步確保所有的密實(shí)粒子都從樣本中取出。
下面對(duì)附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
圖1為按照本發(fā)明的選定方法的第一實(shí)施例的示意方塊圖；圖2為按照本發(fā)明的連結(jié)著目標(biāo)細(xì)胞的粒子的概念上的實(shí)施方案；圖3A-3E為本發(fā)明的血袋混合器的前視、側(cè)視和端視圖；圖4A和4B分別為按照本發(fā)明得到的全部血液控制和粒細(xì)胞富集的方形圖；圖5A和5B分別為按本發(fā)明得到的全部血液控制和淋巴細(xì)胞富集的方形圖；圖6A-6C為Rhon-Poulenc磁性粒子的重力沉積與本發(fā)明的密實(shí)粒子比較的方形圖；圖7A-7B分別為按本發(fā)明得到的全部血液控制和血小板或粒細(xì)胞已被排除的方形圖；圖8A-8C分別為按照本發(fā)明得到的全部血液控制和血小板及粒細(xì)胞已被排除的方形圖；圖9A-9F為示出本發(fā)明的重力沉積與本發(fā)明的加速沉積的比較結(jié)果的方形圖；圖10A-10F為示出本發(fā)明的重力沉積時(shí)間變化后的結(jié)果的方形圖；圖11A-11C為本發(fā)明的加熱粒子與不加熱粒子比較的方形圖。
下面詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式現(xiàn)在參閱圖1，按照本發(fā)明的選定方法和設(shè)備在總體上用標(biāo)號(hào)10指出。選定設(shè)備10包括一個(gè)液體樣本，該樣本包含一個(gè)視需要準(zhǔn)備加強(qiáng)或除去的預(yù)先選定的組群或子組群，該組群或子組群可以是細(xì)胞的組群或子組群，包括在骨髓或血液中查到的細(xì)胞，如血小板、嗜中性細(xì)胞(N)、嗜曙紅細(xì)胞(E)、單核細(xì)胞(M)、淋巴細(xì)胞(L)、淋巴細(xì)胞子集、從干細(xì)胞開(kāi)始的發(fā)育不全的細(xì)胞到成熟的白細(xì)胞，及患病的細(xì)胞和人體或動(dòng)物的癌細(xì)胞。
液體樣本可以是一種生物液，包括全部血液或其一部分、骨髓、脊髓液或尿、或其他液體，其中含有的組群或子組群有如上述。
分離設(shè)備10還包括一個(gè)粒子源14。粒子14包括一個(gè)連結(jié)在其上的單克隆或多克隆抗體，該抗體將特定地連結(jié)到選定的細(xì)胞上。該抗體能夠共價(jià)地或被吸附地直接連結(jié)到粒子14上，或者通過(guò)第二抗體以任一種傳統(tǒng)方式間接地連結(jié)到粒子14上。多個(gè)粒子14和至少一部分樣本12通過(guò)各自的路線16和18在一混合站20中結(jié)合。結(jié)合的樣本部分和粒子14混合在一起，然后用重力沉積法進(jìn)行分化沉積如圖中方塊22所示。樣本12和粒子14的混合使粒子迅速地與樣本內(nèi)所選定的細(xì)胞接觸，從而促使粒子迅速地與所關(guān)心而選定的細(xì)胞連結(jié)。采用密實(shí)粒子14的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它們將會(huì)由于重量的不同而分別沉降通過(guò)進(jìn)行混合的樣本12，基本上不會(huì)捕捉非選定的或非目標(biāo)的細(xì)胞。在混合時(shí)，粒子14的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，混合是在使粒子14反復(fù)通過(guò)樣本而沉積時(shí)完成的，能使細(xì)胞與粒子連結(jié)而不會(huì)在實(shí)際上損害細(xì)胞和粒子14。就大約為數(shù)微升的小體積而言，混合可以迅速進(jìn)行，如用美國(guó)專(zhuān)利5,238,812號(hào)所公開(kāi)的渦旋方法，該專(zhuān)利在這里提到供參閱。對(duì)于大約為0.5毫升至幾公升的大體積而言，一種有效的混合方法是將粒子14和樣本12以上下顛倒的方式翻滾。
一旦粒子14與樣本12混合，便可使粒子沉積在容器(未示出)的底面上，然后便可將其余的樣本液和細(xì)胞分離出去，如圖中的方塊24所示。粒子14具有比樣本12中的組群，不管是目標(biāo)的還是非目標(biāo)的，都大到足夠程度的密度，以致粒子和連結(jié)在其上的目標(biāo)組群在通過(guò)樣本12時(shí)會(huì)分化沉積，留下未被結(jié)合的或非目標(biāo)的組群懸浮在液體中。例如，如果樣本12為一血液樣本，血細(xì)胞的密度約為1.05g/cc，那么粒子14應(yīng)該顯著地比細(xì)胞更為密實(shí)，其密度至少約為細(xì)胞密度的兩至三倍。其余的樣本液體和細(xì)胞可移走供研究之用，而所關(guān)心的選定細(xì)胞則留在液體中并得到加強(qiáng)，且沒(méi)有與粒子14連結(jié)。如果需要，也可使連結(jié)的粒子14和細(xì)胞從其余的樣本液體中取出以便從粒子14上取出細(xì)胞，研究這個(gè)所關(guān)心而被連結(jié)的細(xì)胞。其余的液體和細(xì)胞也可重新植入到活的器官中，這時(shí)在該液體中已不再含有需要從樣本或液體中除去的連結(jié)著細(xì)胞的粒子。
設(shè)備10可以是一自動(dòng)的裝置，它將樣本12和粒子14結(jié)合起來(lái)并使它們?cè)诟髡鹃g移動(dòng)；或者也可是一手動(dòng)程序，如同由一操作者利用試管或容器作為各個(gè)中間站20、22和24來(lái)實(shí)施；或者也可將在兩種情況結(jié)合起來(lái)。
而且，當(dāng)沉積和分離步驟22和24能單獨(dú)用重力分離法來(lái)較好地完成時(shí)，如果需要，還可增加另外的步驟，樣本12和粒子14可簡(jiǎn)單地旋轉(zhuǎn)，如方塊26所示，以便使沉積的步驟加速。粒子14也可為一磁性材料，這時(shí)，一個(gè)如方塊28所示的磁鐵或磁場(chǎng)可施加在容器(未示出)的底部以便使沉積步驟加速。另外，磁場(chǎng)28可保持著或者可施加在容器的底部以便確保在分離步驟中該粒子14不會(huì)被取走。其余的樣本可移走并可使它通過(guò)一個(gè)磁場(chǎng)30的旁邊或穿過(guò)以資確保在液體樣本中不再留有粒子碎片或粒子14，當(dāng)該樣本要重新值入到活的器官如人體內(nèi)時(shí)，這道步驟是必需的。
現(xiàn)在參閱圖2的概念圖，其中示出一個(gè)粒子14，有兩個(gè)不同的抗體A和B連結(jié)在其上。
作為例子，假定所示出的一對(duì)A正細(xì)胞32包括至少一個(gè)抗原A’，該抗原A’特定地將與粒子14上連結(jié)著的一個(gè)抗體A連結(jié)。同時(shí)示出的一對(duì)B正細(xì)胞34包括至少一個(gè)抗原B’，該抗原B’特定地將與粒子14上連結(jié)著的一個(gè)抗體B連結(jié)。實(shí)際上，細(xì)胞的連結(jié)并沒(méi)有特殊的次序，并且通常有一A或B的正細(xì)胞會(huì)堵住粒子在其兩個(gè)自由側(cè)(未示出)上的視域，而且，在一個(gè)粒子14上的A和B會(huì)連結(jié)到一個(gè)代表A’和B’兩種抗原的單一細(xì)胞上。例如，如果A細(xì)胞為CD4正細(xì)胞，B細(xì)胞為CD8細(xì)胞，那么可以有四或五個(gè)A細(xì)胞而只有一或兩個(gè)B細(xì)胞連結(jié)到粒子14上。雖然在該例子中說(shuō)有兩個(gè)不同的抗體A和B都連結(jié)到粒子14上，但如果需要，每一種抗體都可連結(jié)到分開(kāi)的粒子14上。
再一次如前所述，目標(biāo)細(xì)胞或選定細(xì)胞可從樣本12中取出，連結(jié)到粒子14上，然后再?gòu)牧Ｗ?4上取出該細(xì)胞以便對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行分開(kāi)的研究。該細(xì)胞可從粒子14上用傳統(tǒng)的技術(shù)如生物化學(xué)的分離法或機(jī)械的分裂法來(lái)取出。
雖然沒(méi)有一個(gè)特定的粒子能起決定性的作用，但一個(gè)磁性的高密度粒子14通常是較好的。一種較好的粒子14是羰基鎳如INCO所制造稱(chēng)為型號(hào)123的鎳粉制成的。粒子14最好制成公稱(chēng)直徑約為5微米，較好的范圍為3-35微米，但并不以此為限。細(xì)小的部分(較小的碎片)在應(yīng)用前便已去除。粒子14較重，密度最好約為9g/cc。粒子的密度這樣選擇使它在通過(guò)樣本懸浮液時(shí)將比細(xì)胞分化沉積得更快。這樣連結(jié)在粒子上的目標(biāo)細(xì)胞便可在未連結(jié)(非目標(biāo))的細(xì)胞的沉積作出任何顯著分離之前被重力分離出來(lái)。顯然，在樣本組群與粒子14之間的密度差異越大，分化沉積將會(huì)發(fā)生得越快。
樣本液體的體積視所要完成的程序而變。對(duì)于血液、骨髓或脊髓液的分析，小到10微米便可夠用，而對(duì)于臨床的移值如骨髓，體積可從約100毫升到3公升。骨髓程序?yàn)榈湫偷膬艋绦颍獜墓撬枰褐星宄恍枰募?xì)胞。在全部血液或骨髓內(nèi)有許多程序可以應(yīng)用，例如干細(xì)胞分離是由消除其他血細(xì)胞來(lái)達(dá)到的，這些其它血細(xì)胞被連結(jié)到一個(gè)或多個(gè)粒子集14所連結(jié)著的一個(gè)或多個(gè)單克隆抗體上。
混合粒子14和樣本12的一種較好的方法是溫和地上下翻滾粒子14和樣本的混合物使粒子14反復(fù)地從上面掉下通過(guò)樣本12而連結(jié)到所關(guān)心的組群上。這種方法是比較好的，但如果能防止重而密實(shí)的粒子對(duì)所關(guān)心的細(xì)胞產(chǎn)生有形的損害時(shí)，常見(jiàn)的滾動(dòng)搖擺器或較強(qiáng)的混合程序也是有效的。一種這樣的裝置可以是一種試管夾持器，該器可緩慢地旋轉(zhuǎn)使試管或類(lèi)似的容器上下顛倒地旋轉(zhuǎn)。這樣便可使粒子14和樣本12“溫和地混合”，其時(shí)每一次旋轉(zhuǎn)，粒子14都通過(guò)相當(dāng)大的一部分樣本，與它們混合并沉積，這樣便可使目標(biāo)細(xì)胞連結(jié)到粒子上而不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的有形損害。將試管來(lái)回旋轉(zhuǎn)或擺動(dòng)，使試管的每一端一忽兒在上、一忽兒在下，就象上下顛倒的旋轉(zhuǎn)那樣，也可得到相同的混合運(yùn)動(dòng)。滾動(dòng)搖擺器的速率也可設(shè)定使它執(zhí)行基本上相同的混合程序。
血袋型上下顛倒混合器的一個(gè)實(shí)施例在圖3A-3E中示出并在總體上用標(biāo)號(hào)40指出。松開(kāi)夾持器的頂部42和底部44便可將血袋(未示出)插入到混合器40內(nèi)。頂部42和底部44有一按壓搭扣46可將兩個(gè)部分夾持在一起。頂部和底部42、44并且最好用一鉸鏈48鉸接在一起。
雖然在圖3A和3B中示出的是在水平位置上，但混合器40的取向基本上是垂直的，以便對(duì)樣本液體12和粒子14提供上下顛倒的翻滾。混合器40可用支架50(圖3E)裝在一個(gè)基本上為水平的電動(dòng)機(jī)軸(未示出)的軸線上。支架50連結(jié)到混合器40的一個(gè)部分44上。
支架50可以通過(guò)在部分44上制出的多個(gè)小孔52(圖3D)連結(jié)到部分44上。支架50設(shè)有多個(gè)配合孔54(圖3E)可與小孔52對(duì)準(zhǔn)，然后將支架50裝上并用多個(gè)螺栓或其他緊固件固緊。支架50用一個(gè)中心孔56裝到一根電動(dòng)機(jī)軸(未示出)上并通過(guò)一個(gè)或多個(gè)螺紋孔58以便與電動(dòng)機(jī)一起旋轉(zhuǎn)。有螺栓(未示出)用螺紋旋入到螺紋孔58內(nèi)以便抵壓在電動(dòng)機(jī)軸上使混合器40旋轉(zhuǎn)。
如同血液試管那樣，在混合器40中的血袋緩慢旋轉(zhuǎn)，使粒子在每一次旋轉(zhuǎn)時(shí)通過(guò)相當(dāng)大的一部分樣本混合并沉積，以便與樣本中的目標(biāo)細(xì)胞連結(jié)。
標(biāo)記粒子的一種較好的方法是用抗體，該抗體可有效地從樣本混合物即全部血液、骨髓、混合的細(xì)胞組群或體液中排除特定的細(xì)胞子組群，并且由于粒子的密度可立即被重力分化沉積，從而可將特定連結(jié)的細(xì)胞與粒子一起移走。關(guān)于粒子的標(biāo)記，下文還要列出。材料
鎳粒子-從Novamet特種產(chǎn)品公司(Wyckoff，NJ 07481)得到的一批INCO(Suffern，NY10901)的型號(hào)為123的鎳粉。這批鎳粉曾通過(guò)400號(hào)篩(每平方時(shí)為400孔)，去除了大顆粒和空氣，定級(jí)為粗粒。最后形成的粒子按Fisher，大小為5.7微米，表面積為0.34m2/g。
緩沖劑A-三胺/Nacl，pH7.29.55g/L的三胺4.0g/L的Nacl在dH2O中化合；用Conc.Hcl使達(dá)到pH7.2緩沖劑B-三胺/Nacl/BSA將牛血清白蛋白(BSA)0.2g/100ml加入到緩沖劑A中。
抗體溶液-從粒子標(biāo)記用的表I，確定需要添加到粒子上去的抗體的數(shù)量。計(jì)算能得出所需純抗體必需量的現(xiàn)有抗體溶液的體積。從現(xiàn)有抗體溶液中量出所需體積并正好在添加到粒子上去之前添加到緩沖劑A內(nèi)。方法1.量出鎳粒子的重量(按1g粒子/0.34m2表面積計(jì)算)。
2.用dH2O清洗粒子兩次。
2a.將dH2O添加到粒子上并用渦旋和顛倒試管的方法來(lái)混合。
2b.使粒子沉積約兩分鐘以便從液體中分離出來(lái)并除去液體。
3.用1％的漂白劑溶液像步驟2那樣清洗粒子。
4.用緩沖劑A像步驟2那樣清洗粒子。
5.用BSA最佳地將鎳粒子掩蔽起來(lái)。
5a.在緩沖劑A中使粒子重新懸浮在體積為2ml/g粒子的體積內(nèi)。
5b.將數(shù)量為50mg/ml的BSA溶液(緩沖劑B的1∶4的稀釋)添加進(jìn)去使最后得出的濃度為3mg的BSA/m2的粒子表面。
5c.在室溫下將試管放在滾動(dòng)器上3-6小時(shí)。
5d.用緩沖劑A像步驟2那樣清洗粒子兩次，在兩次清洗之間放在滾動(dòng)器上30-60分鐘。
6.將抗體添加到粒子上。
6a.使步驟5中“掩蔽”起來(lái)的粒子(珠子)重新懸浮在體積為1ml/g珠子的體積內(nèi)。
6b.在加入以前制備好的抗體溶液時(shí)用超聲波處理珠子。
6c.洗凈試管，在試管內(nèi)用緩沖劑A制成抗體溶液并使這個(gè)溶液與粒子結(jié)合。
6d.用緩沖劑A使體積增加到1ml/g。
7.將試管放在滾動(dòng)器上并在室溫下將粒子/抗體溶液滾動(dòng)過(guò)夜。
8.用BSA將標(biāo)記粒子堵塞。
8a.像步驟5d那樣用緩沖劑A清洗粒子兩次。
8b.按2ml/g的體積將緩沖劑B添加到粒子上。
8c.用超聲處理和渦旋使粒子重新懸浮。
8d.滾動(dòng)粒子一個(gè)小時(shí)。
8e.更換緩沖劑B兩次，在兩次更換之間滾動(dòng)30分鐘。
9.標(biāo)記珠子的存儲(chǔ)。
9a.除去最后堵塞的緩沖劑B。
9b.加入新鮮的緩沖劑B使體積達(dá)到2ml/g。
9c.在室溫下在帶蓋的試管內(nèi)存儲(chǔ)覆蓋著抗體的珠子。
10.抗體/粒子制備液的試驗(yàn)。
10a.將抗體/粒子計(jì)量過(guò)的數(shù)量加入到試管內(nèi)，通常的范圍是10-200μl的抗體/粒子每ml的全部血液。
10b.用三倍Isoton II(Coulter氏診斷法)和葡萄糖的混合物的體積(4.5g/L)清洗抗體/粒子三次。
10c.緩慢注入IG溶液并加入1ml的全部血液(用EDTA(乙二胺四乙酸)或肝素的抗凝血?jiǎng)┦占?。
10d.用上下顛倒翻滾4-5分鐘來(lái)混合。
10e.將試管垂直地放置在試管夾持器內(nèi)4-5分鐘。
10f.用一吸管將粒子之上的血液轉(zhuǎn)移到另一試管內(nèi)(在轉(zhuǎn)移時(shí)吸管可夾持在一個(gè)磁鐵上以便除去在步驟10e中沒(méi)有沉淀的鎳粒子)。
10g.用對(duì)被排除的組群為最好的方法進(jìn)行分析，并將剩余的細(xì)胞與原始樣本中存在原始組群進(jìn)行比較。
10h.選擇一個(gè)每ml的全部血液所需的粒子數(shù)量以便有效地除去所考慮的細(xì)胞組群。
本發(fā)明特別適用于將微球體連結(jié)到血小板上和白血球的組群或白血球的子組群上。這里所說(shuō)的白血球的子組群是特定的單克隆抗體能連結(jié)上的白血球組群的子集。世界衛(wèi)生組織和國(guó)際免疫學(xué)學(xué)會(huì)曾對(duì)單克隆抗體定出一個(gè)命名法則，稱(chēng)為集束標(biāo)志(CD)命名法，該命名法限定細(xì)胞或細(xì)胞群的特殊品種和專(zhuān)門(mén)對(duì)那個(gè)CD群適用的單克隆抗體。只是為了舉例的目的，在下表中列出與Coulter的抗體標(biāo)志符相應(yīng)的CD群。
表I排除用鎳粒子制備時(shí)所需抗體數(shù)量粒子標(biāo)記 抗體/標(biāo)志符(數(shù)量/m2)血小板CD41 PLT-1 (3mg)B細(xì)胞 CD20 B1 (9mg)CD19 B4 (3mg)MYCD14 MY4A (10.5mg)CD33 MY9(4.5mg)MT8 CD2 T11 (6.75mg)CD5 T1 (4.6mg)CD7 3A1 (2.25mg)CD26TA1 (1.5mg)T4CD4 T4 (5mg)T8CD8 T8 (5mg)KC-48 CD15 KC-48 (5mg)HLA-DRI3 (5mg)例1從全部血液中制備粒細(xì)胞組群在EDTA內(nèi)收集到的全部血液樣本中的一部分被轉(zhuǎn)到Coulter的STKS儀器(該器用溶解法除去紅血球)上運(yùn)行作為下一步排除的控制，結(jié)果如圖4A所示?？刂茍D示出用DC(Coulter)和光散射(LS)為參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)的組群模式，包括L60.M62的組群、粒細(xì)胞(N64和E66)和廢棄部68。預(yù)先計(jì)量好的覆蓋著抗體的適量的鎳粒子被放入到一12×75mm的玻璃試管內(nèi)并用含有4.5g/L葡萄糖的IsotonII溶液(IG緩沖劑)(Coulter公司)重力沉積清洗三次。將3毫升的全部血液樣本加入到洗過(guò)的粒子上，并將試管蓋嚴(yán)。然后將試管放在一可上下顛倒的滾動(dòng)器上以大約30轉(zhuǎn)/分的速率旋轉(zhuǎn)。這樣就可將粒子保持在懸浮狀態(tài)，使粒子反復(fù)通過(guò)血液降落。血液和粒子放在這個(gè)輥?zhàn)由匣旌?分鐘。在混合后取出試管，將它垂直地放在試管架上4分鐘以便進(jìn)行分化重力沉積。為了分析其余組群，可用吸管將粒子之上的血液轉(zhuǎn)移到另一試管內(nèi)。在某些情況下，吸管筒可夾持在一個(gè)磁鐵上以資確保未被沉積出來(lái)的Ni微粒都被排除。樣本然后在Coulter的STKS儀器上運(yùn)行，結(jié)果可與全部血液的控制圖比較。這種操作的說(shuō)明已在美國(guó)專(zhuān)利5,125,737號(hào)中公開(kāi)，這里提到供參考。顯然粒子和全部血液混合在一起并且粒子與白血球的組群或分組群連結(jié)，在每種情況下紅血球都是在得到圖示結(jié)果之前便已被溶解除去。這里提到的血小板和紅血球的結(jié)果是在與白血球通道分開(kāi)的儀器通道內(nèi)只用一個(gè)Coulter體積(DC)的參數(shù)得到的。
全部血液樣本部分用下列標(biāo)記鎳粒子來(lái)排除MY4 200μl/ml、T4 100μl/ml、B1100μl/ml、PLT-180μl/ml、T8 50μl/ml和3A1 50μl/ml。這個(gè)連結(jié)著抗體的標(biāo)記粒子的混合物可排除大部分的M62’、L60’和血小板，從而得出富含粒細(xì)胞(N64’和E’66)的組群如圖4B所示。排除的結(jié)果是，與全部血液比較，血小板減少86％，在排除過(guò)的樣本內(nèi)M62’和L60’被清除。這樣就造成一個(gè)含有98％粒細(xì)胞64’和66’的細(xì)胞制劑，而原先的粒細(xì)胞數(shù)為91％。紅血球保持在控制全部血液樣本的91％，指示出細(xì)胞排除物的品種。
例2用鎳粒子分配和保持淋巴細(xì)胞制備淋巴細(xì)胞制劑淋巴細(xì)胞制劑是用抗體覆蓋的鎳粒子制成的如圖5A和5B所示。全部血液控制在Coulter的STKS血液學(xué)分析儀上運(yùn)行后結(jié)果在圖5A中示出。得出的標(biāo)準(zhǔn)模式為27％的L70，9％的M72，61％的N74，和2％的E76。將以前用PLT-1(70μl的粒子/ml的血液)KC-48(50μl的粒子/ml的血液)和MY-4(100μl的粒子/ml的血液)標(biāo)記過(guò)的鎳粒子的適量的復(fù)合物(按10ml的全部血液配制)放入到-15ml的聚苯乙烯試管內(nèi)，并用IG緩沖劑清洗三次。移走最后一次清洗的上層清液并將在EDTA內(nèi)收集的全部血液10ml加入到粒子上，使粒子重新在血液中懸浮，然后放到一個(gè)可上下顛倒的滾動(dòng)器上翻滾4分鐘。在混合后，將試管垂直放置在試管架上停留4分鐘使粒子分化沉積。在粒子沉積后用塑料轉(zhuǎn)撳吸管移走用過(guò)的血液并將它放到新的試管內(nèi)。在轉(zhuǎn)移時(shí)將試管筒夾持在一個(gè)磁鐵上以便除去任何鎳微粒。分析在CoulterSTKS血液分析儀中上的淋巴細(xì)胞制劑(圖5B)指出淋巴細(xì)胞組群提高到92％。與全部血液(圖5A)比較，其他細(xì)胞組群的減少為，血小板減少94％，N74減少98％，M72減少80％，E76減少95％和紅血球減少1％。這就指出最終排除的樣本是由L70組成的，只有極小一部分非特定地被除去(淋巴細(xì)胞保留量大于99％)。
例3在排除全部血液后從抗體標(biāo)記的鎳粒子中回收T8細(xì)胞用T8抗體標(biāo)記的鎳粒子在初始時(shí)被用來(lái)排除全部血液的T8淋巴細(xì)胞。采用次優(yōu)排除用量(采用15μl而不用50μl/ml的全部血液)的T8標(biāo)記的鎳粒子在IG緩沖劑內(nèi)清洗三次，將全部血液加入到粒子上并放在上下顛倒?jié)L動(dòng)器上10分鐘，再直立放置5分鐘。移走用過(guò)的血液，粒子和結(jié)合的細(xì)胞用IG緩沖劑清洗兩次，使它重新懸浮在一個(gè)等于樣本原來(lái)數(shù)量一半的體積內(nèi)，輕輕倒轉(zhuǎn)使粒子和結(jié)合的細(xì)胞沉積出來(lái)。在清洗后，粒子/細(xì)胞粒重新懸浮在IG緩沖劑中，然后放在一個(gè)磁性攪動(dòng)器內(nèi)進(jìn)行機(jī)械分裂大約30秒。結(jié)果細(xì)胞就從粒子上分開(kāi)。使粒子沉積出來(lái)，上層清液便與粒子分開(kāi)，可用吸管移走并用流動(dòng)的血細(xì)胞計(jì)數(shù)器來(lái)分析。分析三個(gè)樣本一個(gè)全部血液控制樣本，另一個(gè)是用T8標(biāo)記的粒子排除后的血液，還有一個(gè)是在粒子/細(xì)胞被攪動(dòng)后使粒子沉積出來(lái)后的帶有釋出細(xì)胞的上層清液。在Profile II(一種血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的型號(hào))上的結(jié)果指出排除后的血液的標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)，淋巴細(xì)胞的組群有少量的16％的減少。但回收的細(xì)胞卻顯示有高度富集并純化的淋巴細(xì)胞組群。在用熒光的T4和T8的表面標(biāo)記器分析后發(fā)現(xiàn)排除后的血液T8組群從26％減少到6.3％，而T4組群則從52.5％增加到56.1％，這是由于T8細(xì)胞的減少。在回收的組群中超過(guò)96％的細(xì)胞都是T8正細(xì)胞。
例4標(biāo)記各種密實(shí)粒子探討A在表II中列出的各種密實(shí)粒子按本方法用T8抗體標(biāo)記。采用標(biāo)記型號(hào)123鎳粒子的標(biāo)準(zhǔn)程序來(lái)用5mg/m2的T8抗體標(biāo)記包括用3-30mg/m2的BSA堵塞的各種粒子。在標(biāo)記并清洗全部血液的T8排除物后，按標(biāo)準(zhǔn)的方法測(cè)定所加入的標(biāo)記粒子的數(shù)量。在與血液進(jìn)行4分鐘后，使粒子沉積4分鐘。然后在一流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(CoulterProfile II)上分析最終排除后的樣本內(nèi)的T8細(xì)胞的百分比。排空量將被計(jì)算為留下的T8細(xì)胞的百分比與全部血液內(nèi)T8該值的比。型號(hào)123的鎳粒子不僅用于其他試驗(yàn)上并且是其他型式粒子的比較對(duì)象。從滴定情況看，每ml全部血液使用25μl的型號(hào)123的鎳粒子，T8細(xì)胞排除的程度可超過(guò)96％。而不銹鋼粒子即使采用100μl/ml的全部血液也不能起排除作用。用T8抗體標(biāo)記的鋅粒會(huì)使全部血液凝集，這可能是由于鋅和EDTA抗凝劑之間的化學(xué)作用將樣本內(nèi)的鈣釋放出來(lái)引起纖維蛋白原的激活所致。其他型號(hào)的鎳粒子也可起排除作用，但不如型號(hào)123那樣有效。
探討B(tài)幾種用T4抗體標(biāo)記但沒(méi)有用BSA預(yù)先覆蓋的粒子用來(lái)進(jìn)行標(biāo)記試驗(yàn)以便確定它們連結(jié)細(xì)胞的能力。所有連結(jié)著抗體的粒子都是用同一方法來(lái)確定的，Pd和VM63-Ni在連結(jié)細(xì)胞方面是等價(jià)的或稍?xún)?yōu)于型號(hào)123的Ni，只是沉積緩慢。TiO2、Pb和VM63-Ni在標(biāo)記細(xì)胞以便進(jìn)行顯微鏡辨認(rèn)方面都是有效的。只有Ta在用抗體標(biāo)記后被指稱(chēng)為在連結(jié)細(xì)胞方面是無(wú)效的。
探討C按照對(duì)型號(hào)123鎳粒子的標(biāo)準(zhǔn)程序用對(duì)嗜中性細(xì)胞特定的KC-48抗體標(biāo)記粒子，然后將粒子與全部血液混合，制成一個(gè)血斑在顯微鏡下檢查，所有這些粒子顯示都能特定地連結(jié)在嗜中性細(xì)胞上。
總起來(lái)講，差不多所有試驗(yàn)的金屬粒子都至少有幾分吸收抗體的能力。但就排除能力而言，型號(hào)123的鎳是最為有利的，這是由于它的表面性能和沉積率。作為一個(gè)例子，鈀和二氧化錳粒子也能很好排除，但不能足夠快地沉積以致不能有效地在本發(fā)明中應(yīng)用。吸附在二氧鈦粒子上的抗體能有效地標(biāo)志出細(xì)胞便于用顯微鏡辨認(rèn)，但由于粒子的尺寸很小，不能在全部血液中形成顯著不同的沉積率。
表II材料標(biāo)志 制造者/樣本/批號(hào) 物理和磁的特性排除能力探討A鎳型號(hào)123 Novamet/3451313不規(guī)則 + + +鎳VM163 Novamet/VM63 特細(xì)粉 + + +鎳10/585A Novamet/10/585A球粒 + +鎳HDNP Novamet/347355 粉 + +不銹鋼 P316L Ametek/0813290 形狀不規(guī)則-鋅粒 Aldrich/HY13401CY 無(wú)磁性*探討B(tài)鎳型號(hào)123 Novamet/3451313+ + +鎳VM63 Novamet/VM63 特細(xì)粉 + + +鎳8/209ANovamet/8/209A 球粒 + +鎳08841RSpex Ind.08841R粉 + +鎳01509BW Aldrich/01509BW粉 + +鎳347355Novamet/347355 粉 + +PdD13A17John Mattheney+ + + +Elec./D13A17TiO2ANATASE 無(wú)磁性-TaSGQ Norton Metals+Div./SGQ-2-3764SiO2無(wú)磁性+NiO2N04990Pflatz&無(wú)磁性 + +Bauer/040291探討CPdD13A17John Matthenev 直徑約0.5μ + + + +Elec./D13A17TiO ANATASE直徑約1.0μ-MnO2Aldrich/23，094-4 粉 + +TaSGQ Norton Metals粉+Div./SGQ-2-3764*鋅加入到全部血液內(nèi)會(huì)造成凝集。
例5用抗體標(biāo)記的鎳粒子排除全部血液的T4和T8子組群按上面提到的抗體標(biāo)記的程序用T4或T8抗體標(biāo)記鎳粒子。為了排除，將粒子(50μl/ml的全部血液)轉(zhuǎn)移到一試管內(nèi)并用IG緩沖劑清洗三次。在移走第三次的洗液后，將全部血液加入到粒子上并以上下顛倒的方式混合兩者4分鐘。在混合后，將試管放置在直立狀態(tài)使它沉積4分鐘。排除過(guò)的血液然后用T4-RDI/T8-FITC熒光抗體(Coulter公司，Coulter Cytostat部件號(hào)6603802)標(biāo)記并在一流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Coulter ProfileII)上檢測(cè)。所有樣本均計(jì)數(shù)一分鐘，然后比較不同象限內(nèi)的T4和T8的淋巴細(xì)胞。與全部血液控制圖相比，當(dāng)采用T4粒子時(shí)，94％的T4組群都被排除，只有18％的T8被移走。當(dāng)采用T8粒子時(shí)，96％的T8組群被排除，只有4％的T4組群被移走。
例6分化沉積圖6A-C示出本發(fā)明的密實(shí)粒子與現(xiàn)有技術(shù)的Rhone-Poulenc磁性粒子所得出的不同沉積率的對(duì)比。圖6A并示出STKS上的一個(gè)控制的方形圖，包括一個(gè)由L80、M82、N84和E86組成的標(biāo)準(zhǔn)組群模式。圖6B示出用KC-48單克隆抗體標(biāo)記的鎳粒子排除后得出的模式。在圖6A中示出的N84為白血球控制組群的59.6％，而在圖6B中示出的N84已減少到為白血球組群的2.3％。
Rhone-Poulenc粒子與鎳粒子按類(lèi)似方式使用，但如圖6C所示出的方形圖，實(shí)際上沒(méi)有重力沉積。特別是，連結(jié)的N和Rhone-Poulenc粒子示出的模式為88，而不連結(jié)的Rhone-Poulenc粒子顯示的模式90如同一個(gè)噪聲或廢棄物那樣。正像Rhone-Poulenc的刊物所聲稱(chēng)的那樣“在沒(méi)有任何磁場(chǎng)時(shí)在好幾小時(shí)內(nèi)不會(huì)有顯著的沉積發(fā)生”，可見(jiàn)這些粒子的設(shè)計(jì)本來(lái)就是防止重力沉積的。
例7混合時(shí)間混合時(shí)間和方法可隨樣本體積和所需的培育時(shí)間而變化。對(duì)于約為0.5ml或更小的體積，兩種快速混合方法如密實(shí)粒子的渦旋或盤(pán)旋和上下顛倒地翻滾沉積都可有效地使用，不會(huì)有形地?fù)p傷細(xì)胞組群。渦旋是用分開(kāi)的連結(jié)著抗體的粒子KC48-Ni(50μl/mlWB)和PLT-Ni(100μl/mlWB)在Coulter的STKS上完成的，結(jié)果如表III。在表III中以及在每一個(gè)類(lèi)似的表如表V、VIII、IX和XII中，血小板和白血球的單位都是103/μl，而紅血球的單位是106/μl。
表IIIWBCN L M PLTRBCA)5.62.82.10.52304.09B)4.11.42.10.491 4.19C)3.40.72.00.558 4.15例A作為控制，沒(méi)有任何粒子，渦旋30秒，例B包括粒子，渦旋15秒，例C包括粒子，渦旋30秒，這三個(gè)例子都沉積4分鐘。
總結(jié)起來(lái)，在15秒的渦旋下，嗜中性細(xì)胞被排除50％，血小板被排除60％，而在增加的15秒的渦旋下，嗜中性細(xì)胞的排除增加到75％，血小板的排除也增至75％。還可注意到其他細(xì)胞組群保持沒(méi)有非特定的流失。
同一血液樣本用顛上下顛倒的方式混合，變化其混合時(shí)間如表IV所示。
表IVA)作為控制，無(wú)粒子參加，10分鐘B)KC48/PLT， 30-45秒C)KC48/PLT， 1分鐘D)KC48/PLT， 1.5分鐘E)KC48/PLT， 2.0分鐘F)KC48/PLT， 4.0分鐘G)KC48/PLT， 10分鐘用表IV的混合程序得出的排除結(jié)果在表V中示出。當(dāng)STKS儀器報(bào)告為0.0時(shí)(如N在表V的F或G中)，實(shí)際的結(jié)果是在0.05之下，即排除率一般大于99％。
表V(％排除)結(jié)果WBCN L MPCT RBC作為控制 A)5.6 2.8 2.10.5 240 4.2030-45秒 B)3.7 1.0(64％) 2.00.5 69(71％) 4.081分 C)3.2 0.6(79％) 1.90.5 39(84％) 4.021.5分 D)2.8 0.4(86％) 1.80.4 37(85％) 4.002.0分 E)2.9 0.3(89％) 1.90.5 14(94％) 4.104.0分 F)2.6 0.0(＞99％) 2.00.5 1(99.6％) 4.1910分 G)2.7 0.0(＞99％) 2.00.6 0(＞99％) 4.22對(duì)于這些粒子和抗體，看來(lái)最少的混合時(shí)間為4分鐘，對(duì)于其他的粒子和抗體，混合時(shí)間可在本發(fā)明所定的范圍內(nèi)變化。顯然，在最少時(shí)間之外進(jìn)行小量的混合在某些情況下可以是合乎需要而不會(huì)有害于本發(fā)明的。
例8最小樣本體積20μl的小體積的全部血液可與5μl的KC48的鎳粒子一起渦旋4分鐘。結(jié)果顯示可有95％的N被消除，這個(gè)結(jié)果是從傳統(tǒng)的全部血液的血斑檢測(cè)中得出的如表VI所示。
表VIN L M E作為控制，無(wú)粒子 5827122排除后3 82113第二個(gè)10μl的小體積的全部血液在用1μl的KC48和2μl的PLT-1一起渦旋4分鐘后，結(jié)果是粒細(xì)胞的82％可被排除，這個(gè)結(jié)果是在ProfileII型流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上得到的。
例9從樣本制劑中移走粒細(xì)胞及/或血小板血小板是全部血液和骨髓的一個(gè)組成部分，它在制備細(xì)胞懸浮液要用各種方法移走。血小板的屬性使它在治療創(chuàng)傷方面起到有效的作用，但對(duì)細(xì)胞的準(zhǔn)備工作卻是不利的，因?yàn)檠“鍟?huì)凝集并且非特定地粘結(jié)在其他細(xì)胞上。由于在全部血液內(nèi)的每一個(gè)淋巴細(xì)胞約有20-50個(gè)血小板，在任何分離工作之前移走血小板可增加淋巴細(xì)胞的回收能力，形成一個(gè)與全部血液非常相似的淋巴細(xì)胞分布并減少制備時(shí)間，因最普通的移走血小板的方法是在細(xì)胞懸浮液隔離后用三個(gè)分開(kāi)的低速的離心分離來(lái)完成。在一要給病人服用的制劑中，如果在冷凍之前能先移走血小板，可以減少要注射的細(xì)胞的非特定的流失并消除血小板的凝集。另外，成熟的粒細(xì)胞含有的微粒在注射時(shí)會(huì)釋放出來(lái)給病人以沖擊。如將成熟的粒細(xì)胞和血小板兩者都移走，那么用來(lái)注射的細(xì)胞制劑，不管是立即使用的還是冷凍后使用的，都將對(duì)病人比較安全而較少會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題。
圖7A示出一個(gè)控制用的全部血液組群，該組群含有L100、M102、N104、E106和血小板(未示出)。血小板在控制圖上為276×103血小板/μl，而粒細(xì)胞(N和E)為3.2×103/μl。兩組密實(shí)粒子被結(jié)合起來(lái)并與血液一起混合4分鐘然后沉積4分鐘。一組粒子包括用PLT-1標(biāo)記的粒子，用量為80μl/ml，另一組粒子包括用KC-48標(biāo)記的粒子，用量為50μl/ml。如圖7B所示，L100’和M102’受到的影響很小，而N104’和E106’都被減少約99.9％。血小板被減少到約為2×103/μl。
血小板和粒細(xì)胞也可在分開(kāi)的血液樣本部分中分別移走。圖8A示出一個(gè)控制用的全部血液組群，該組群含有L110、M112、N114、E116和血小板(未示出)。圖8B示出一個(gè)仍然用PLT-1標(biāo)記的密實(shí)粒子在排除血小板后用的樣本部分。血小板從在控制用的全部血液組群中的231×103血小板/μl減少到在排除過(guò)的樣本部分中的3×103血小板/μl。其余的組群L110’、M112’、N114’和E116’相對(duì)地沒(méi)有受到影響。
圖8C示出應(yīng)用KC-48標(biāo)記的密實(shí)粒子在排除N114和E116以后的樣本部分。N114”和E116”從N114和E116的總數(shù)為2.8×103/μl減少到基本為零。血小板相對(duì)地沒(méi)有受到影響。
例10強(qiáng)化重力沉積圖9A-9F示出采用本發(fā)明的粒子的重力沉積與簡(jiǎn)單的加速沉積比較的方形圖。圖9A-9D示出采用表VII中所列各種抗體標(biāo)記的粒子制備的N制劑。
表VIIT450μl/mlT850μl/mlMY4 50μl/mlB150μl/mlPLT 50μl/mlI350μl/ml圖9A還示出一個(gè)控制用的全部血液組群，衾中L120、M122、N124、E126、血小板(未示出)和紅血球(未示出)。
表VIII圖樣本W(wǎng)RC NLMEPLT RBC9A控制用 6.9 4.1 2.2 0.4 0.2 288 4.879B排除、沉積 4.3 3.9 0.2 0.0 0.1 35 4.599C旋轉(zhuǎn)、控制用6.9 4.1 2.2 0.4 0.1 297 4.749D排除、旋轉(zhuǎn) 4.3 3.9 0.2 0.0 0.1 15 4.609E旋轉(zhuǎn)、控制用7.4 4.5 2.2 0.4 0.2 293 4.969F排除、旋轉(zhuǎn) 2.7 0.0 2.1 0.4 0.1 280 4.94采用表VII中的標(biāo)記粒子的N制劑可以得出一個(gè)富含N的組群124’，使N在WBC中的百分比從59.7％增加到89.6％。L從32.1％減少到4.9％，M從5.5％減少到08％，如圖9B所示。
圖9C示出一個(gè)控制用的全部血液組群，含有L130、M132、N134和E136。在本例中，沒(méi)有使樣本部分和粒子重力沉積，而是用一小的離心機(jī)，如Fisher 59A型科學(xué)的微型離心機(jī)使它們?cè)诘诙n離心旋轉(zhuǎn)15秒。這個(gè)簡(jiǎn)單的離心分離或加強(qiáng)的重力沉積如果需要，可在較短時(shí)間內(nèi)得到與重力沉積相似的結(jié)果。N的百分比從59.5％增加到89.1％，L從31.5％減少到5.7％，而M則從5.8％減少到0.5％如圖9D所示。
任何單一的組群或子組群都可用相同的程序，例如，如圖9E和9F所示。圖9E示出一個(gè)控制用全部血液由L140、M142、N144和E146組成的組群。在本例中，N144是用樣本和粒子加強(qiáng)的重力旋轉(zhuǎn)移走的。N從控制圖中的61.4％減少到0.7％如圖9F中的144’所示，其余的組群相對(duì)地沒(méi)有受到影響。
本發(fā)明的第一方案趨向于采用密實(shí)粒子重力沉積。但加強(qiáng)的重力沉積對(duì)密度梯度系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)胞如ficoll也是可以用的，在那種情況下粒子只要求比細(xì)胞和梯度系統(tǒng)略為更密實(shí)一些就可以了。采用加強(qiáng)的重力沉積(旋轉(zhuǎn))，略為更密實(shí)一些的粒子和連結(jié)在其上的細(xì)胞能夠在ficoll梯度系統(tǒng)中分離出來(lái)。
例11沉積時(shí)間圖10A-10F示出本發(fā)明的具有各種重力沉積時(shí)間的結(jié)果的方形圖，這些結(jié)果被匯總列在表IX中。
表IX圖 樣本 WBCN L M RBC PLT10A控制4分 8.23.53.31.05.45 31510B排除后4分5.00.13.41.15.44 31510C控制2小時(shí)8.43.73.21.05.08 35010D排除后2小時(shí) 4.60.13.31.05.33 31910E控制3小時(shí)8.33.63.21.05.48 32110F排除后3小時(shí) 4.60.03.41.05.31 321表IX的結(jié)果是這樣得到的，將同一全部血液的組群樣本的四個(gè)3ml的部分分別加入到四個(gè)分離的試管或容器內(nèi)。第一個(gè)試管為控制管，另外三個(gè)試管的每一個(gè)試管中都各加入120μl的用KC48標(biāo)記的粒子。然后將四個(gè)試管都上下顛倒地混合4分鐘，再使它們分別重力沉積4分鐘、2小時(shí)和3小時(shí)。然后將在粒子之上的樣本部分移走、混合并分析。將控制部分(圖10A、10C和10E)與各該排除過(guò)的樣本(圖10B、10D和10F)比較。如同圖和表所示，控制部分的全部血液樣本在4分鐘到3小時(shí)的范圍內(nèi)實(shí)際上并無(wú)變化。同時(shí)，如所示出，排除過(guò)的部分對(duì)每一種沉積時(shí)間基本上也都是相同的。
就4分鐘的沉積例子言，N150(圖10A)從42.9％減少到N150’(圖10B)的2.5％。同樣在2小時(shí)的沉積例子中，N152(圖10C)從43.5％減少到N152’(圖10D)的1.1％。在3小時(shí)沉積的例子中，N154(圖10E)從42.7％減少到N154’(圖10F)的08％。
例12粒子加熱圖11A-11C示出來(lái)加熱的型號(hào)123的鎳粒子與加熱的型號(hào)123的鎳粒子的比較，結(jié)果在表X中列出表X圖 樣本W(wǎng)RCN L M RBC PLT11A控制用 6.43.91.80.54.2833711B未加熱 2.40.01.90.44.1431111C熱 2.40.01.90.44.19307再一次，結(jié)果是用KC48標(biāo)記的粒子得到的，除了N以外，其他的組群相對(duì)地沒(méi)有受到影響，同時(shí)未加熱的粒子(圖11B)與加熱的粒子(圖11C)的結(jié)果基本上是一樣的。在吸附抗體之前將粒子加熱到250℃維持3小時(shí)以便消毒(除去細(xì)菌)并從粒子去除內(nèi)毒素，這種方法特別用于當(dāng)一處理過(guò)的樣本要重新注入到病人體內(nèi)時(shí)。加熱粒子由于在粒子表面形成一個(gè)氧化層，同時(shí)減少粒子中的Ni離子的溶解。如同以前一樣，粒子在混合4分鐘后再沉積4分鐘。N156(圖11A)在使用未加熱粒子時(shí)從61.8％減少到N156’(圖11B)的1.4％，而在使用加熱粒子時(shí)則減少到N156”(圖11C)的1.7％。通常，型號(hào)123的鎳粒子可加熱到250℃至280℃的范圍維持3至5小時(shí)。由于加熱粒子與未加熱粒子的結(jié)果基本相同，其他例子將不再重復(fù)舉出而只反映未加熱粒子的應(yīng)用。
例13移植用的改進(jìn)的細(xì)胞制劑本發(fā)明的粒子也可用來(lái)排除骨髓制劑(prep)內(nèi)的血小板。傳統(tǒng)的骨髓加工方法與本發(fā)明的粒子去除技術(shù)的比較在表XI中示出。
表XI傳統(tǒng)法粒子/PLT排除法解凍后的回收率29％ 46％成活率95％ 99％CFU回收率 56％ 71％骨髓制劑的傳統(tǒng)方法是用ficoll離心機(jī)上分離物使它重新懸浮并清洗進(jìn)行三次的低速離心分離來(lái)去除血小板的。傳統(tǒng)技術(shù)的實(shí)例在骨髓解凍后只能回收29％，其中95％是有活力的，并能回收56％的群體形成單位(CFU)或原始粒子細(xì)胞。與此不同，本發(fā)明的粒子排除比傳統(tǒng)法要快捷得多，復(fù)雜程度也小得多，在解凍后可回收46％，其中99％具有活力，并且CFU的回收率可達(dá)71％。血小板是在進(jìn)行ficoll分離之前用粒子從骨髓上分離出來(lái)的。這樣可取消傳統(tǒng)的緩慢的離心分離和清洗，減少血小板/細(xì)胞的凝集，從而提高CFU的回收率。在表XI示出的例子中，30ml的骨髓是用600μl的PLT-1標(biāo)記的鎳粒子來(lái)排除的，上下顛倒地混合并進(jìn)行沉積各4分鐘。然后將樣本放在ficoll機(jī)的上層，以600G進(jìn)行30分鐘的離心分離。然后收獲界面上附著物并在三胺/Nacl+0.05％BSA中用離心作用進(jìn)行濃縮?；厥盏募?xì)胞被重新懸浮在培養(yǎng)基RPMI1640+10％FCS(小牛胎血清)。再將加工過(guò)的樣本凍結(jié)并解凍以便與傳統(tǒng)法進(jìn)行比較。
要使CFU進(jìn)一步富集，可將一小部分(1.3ml)的第一次排除過(guò)血小板的骨髓樣本進(jìn)一步用標(biāo)記粒子，包括15μl的KC48粒子、50μl的T11粒子、50μl的標(biāo)有B1和B4的粒子及50μl的標(biāo)有MY4和MY9的粒子來(lái)排除。這將在基本上將所有的血統(tǒng)正(成熟的)細(xì)胞從骨髓上排除。排除成熟的細(xì)胞后，一個(gè)高度富集的原始粒子/干細(xì)胞(CFU)的組群便可回收供分析。用傳統(tǒng)的制備法在冷凍前的樣本中得到的每105個(gè)細(xì)胞中的CFU-GM(粒細(xì)胞、單核細(xì)胞)為143CFU-GM，用本發(fā)明的粒子的血小板排除法可得到147CFU-GM，而用本發(fā)明的進(jìn)一步用粒子排除血統(tǒng)正細(xì)胞可得到620CFU-GM。
例14
凍干的粒子如表XII所示，本發(fā)明的凍干的粒子在排除N和PLT上也可起到有效的作用。兩組粒子，其一用KC48標(biāo)記，另一用PLT-1標(biāo)記，結(jié)合起來(lái)排除N和PLT。
表XII樣本 WBCN L M PLTRBC白血球控制用 7.24.22.40.52074.33白血球帶有凍 3.10.12.50.46 4.45干粒子總結(jié)地說(shuō)，凍干粒子顯得與非凍干粒子同樣有效。凍干粒子可用于隨身儀器上或其他用途上，因?yàn)閮龈闪献涌刹恍鑼⒘Ｗ颖３衷谌芤褐小?br>
在上述說(shuō)明的啟示下，本發(fā)明有可能作出許多種修改和變化。因此應(yīng)該知道，在本發(fā)明的權(quán)利要求限定的范圍內(nèi)，本發(fā)明在實(shí)施時(shí)不一定要像上面具體說(shuō)明的那樣。
權(quán)利要求
1.一種從液體樣本中移走一個(gè)選定的組群或子組群的方法，該方法包括備有多個(gè)密度大到足夠施行分化重力沉積的粒子；所說(shuō)粒子具有連結(jié)在其上專(zhuān)門(mén)針對(duì)至少一個(gè)預(yù)先選定的組群或子組群的反應(yīng)劑；將所說(shuō)樣本的一部分與所說(shuō)粒子混合，使所說(shuō)粒子與所說(shuō)預(yù)先選定的組群或子組群連結(jié)而不顯著有形地?fù)p害所說(shuō)預(yù)先選定的組群或子組群；使所說(shuō)粒子連同所說(shuō)連結(jié)的組群或子組群在所說(shuō)樣本部分內(nèi)進(jìn)行分化重力沉積；及將含有所說(shuō)非選定的組群或子組群的所說(shuō)樣本部分的所得到的上層清液的至少一部分從所說(shuō)粒子和所說(shuō)連結(jié)在組群或子組群上分離開(kāi)來(lái)。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，所說(shuō)組群或子組群為細(xì)胞的組群或子組群。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征為，所說(shuō)細(xì)胞為血細(xì)胞。
4.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征為，所說(shuō)細(xì)胞為癌細(xì)胞白血球、血小板、免疫細(xì)胞和血統(tǒng)特定細(xì)胞中的至少一種。
5.按照權(quán)利要求1的所述方法，其特征為，所說(shuō)混合是將所說(shuō)樣本和所說(shuō)粒子上下顛倒翻滾來(lái)達(dá)到的。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，所說(shuō)粒子是由鎳構(gòu)成的。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，所說(shuō)粒子的直徑約從3至35微米。
8.按照權(quán)利要求7所述的方法，其特征為，所說(shuō)粒子的直徑約為5微米。
9.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，所說(shuō)粒子的密度約為2g/cm2或更大。
10.按照權(quán)利要求9所述的方法，其特征為，所說(shuō)粒子的密度約為9g/cm3。
11.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，所說(shuō)粒子的密度約為所說(shuō)組群的密度的兩至三倍。
12.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，所說(shuō)反應(yīng)劑為抗體、藥物、激素、生長(zhǎng)素、外源凝集素、酶或核酸序列中的至少一種。
13.按照權(quán)利要求1的所述方法，其特征為，所說(shuō)反應(yīng)劑為抗體。
14.按照權(quán)利要求13所述的方法，其特征為，所說(shuō)抗體為專(zhuān)門(mén)針對(duì)血小板的抗體或白血球中的至少一種。
15.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，所說(shuō)混合約需進(jìn)行15秒至30分鐘。
16.按照權(quán)利要求15所述的方法，其特征為，所說(shuō)混合約需進(jìn)行4分鐘。
17.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，所說(shuō)重力沉積約需進(jìn)行15秒至180分鐘。
18.按照權(quán)利要求17所述的方法，其特征為，所說(shuō)重力沉積約需進(jìn)行4分鐘。
19.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，所說(shuō)分離步驟包括將所說(shuō)樣本部分的所得到的上層清液的至少一部分移走而不移走所說(shuō)粒子和所說(shuō)連結(jié)在組群或子組群。
20.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，所說(shuō)分離步驟包括隔離所說(shuō)粒子，然后從所說(shuō)粒子上移走所說(shuō)連結(jié)的組群或子組群。
21.按照權(quán)利要求20所述的方法，其特征為，所說(shuō)連結(jié)的子組群為CD8正細(xì)胞。
22.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，所說(shuō)粒子和所說(shuō)樣本部分的混合是使所說(shuō)粒子反復(fù)通過(guò)所說(shuō)樣本部分的相當(dāng)大的部分進(jìn)行沉積來(lái)達(dá)到的。
23.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，從全部血液中制備富含粒細(xì)胞制劑的方法是提供至少有單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板的單克隆抗體連結(jié)在其上的粒子，然后從所說(shuō)樣本部分的所得到的上層清液中至少移走一部分即得，其時(shí)所說(shuō)粒子和所說(shuō)連結(jié)的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板的組群或子組群并不移走。
24.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，從全部血液中制備富含淋巴細(xì)胞制劑的方法是提供至少有單核細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞和血小板的單克隆抗體連結(jié)在其上的粒子，然后從所說(shuō)樣本部分的所得到的上層清液中至少移走至少一部分即得，其時(shí)所說(shuō)粒子和所說(shuō)連結(jié)的單核細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞和血小板的組群或子組群并不移走。
25.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，所說(shuō)樣本是全部血液或骨髓的一部分，這部分是這樣制備的，提供至少有血小板的單克隆抗體連結(jié)在其上的粒子，然后從所說(shuō)樣本部分的所得到的上層清液中至少移走一部分即得，其時(shí)所說(shuō)粒子和所產(chǎn)連結(jié)的血小板的組群或子組群并不移走。
26.按照權(quán)利要求25所述的方法，其特征為，提供包括連結(jié)在其上的嗜中性細(xì)胞的單克隆抗體的粒子，在從所說(shuō)樣本部分的所得到的上層清液中至少移走一部分時(shí)，所說(shuō)粒子和所說(shuō)連結(jié)的嗜中性細(xì)胞的組群或子組群并不移走。
27.按照權(quán)利要求25所述的方法，其特征為，提供具有對(duì)基本上所有血統(tǒng)正細(xì)胞為正作用的單克隆抗體的粒子，在從所說(shuō)樣本部分的所得到的上層清液中至少移走一部分時(shí)，所說(shuō)粒子和所說(shuō)連結(jié)的血統(tǒng)正細(xì)胞的組群或子組群并不移走。
28.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，在與所說(shuō)反應(yīng)劑連結(jié)之前先將所說(shuō)粒子加熱。
29.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，將所說(shuō)粒子凍干。
30.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，所說(shuō)樣本是全部血液或骨髓的一部分，這部分是這樣制備的，所提供的粒子具有對(duì)基本上所有血統(tǒng)正細(xì)胞為正作用的單克隆抗體，然后從所說(shuō)樣本部分的所得到的上層清液中至少移走一部分即得，其時(shí)所說(shuō)粒子和所說(shuō)連結(jié)的血統(tǒng)正細(xì)胞的組群或子組群并不移走。
31.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，所說(shuō)樣本是全部血液或骨髓的一部分。
32.一種用來(lái)從液體樣本中移走一個(gè)選定的組群或子組群的設(shè)備，該設(shè)備具有多個(gè)密度大到足夠施行分化重力沉積的粒子，所說(shuō)粒子具有連結(jié)在其上專(zhuān)門(mén)針對(duì)至少一個(gè)預(yù)先選定的組群或子組群的反應(yīng)劑；用來(lái)將所說(shuō)樣本的一部分與所說(shuō)粒子混合的裝置，使所說(shuō)粒子與所說(shuō)預(yù)先選定的組群或子組群連結(jié)而不顯著有形地?fù)p害預(yù)先選定的組群或子組群；用來(lái)使所說(shuō)粒子連同所說(shuō)連結(jié)的組群或子組群在所說(shuō)樣本部分內(nèi)進(jìn)行分化重力沉積的裝置；及用來(lái)將含有所說(shuō)非選定的組群或子組群的所說(shuō)樣本部分的上層清液的至少一部分從所說(shuō)粒子和所說(shuō)連結(jié)的組群或子組群上分離開(kāi)來(lái)的裝置。
33.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)組群或子組群為細(xì)胞的組群或子組群。
34.按照權(quán)利要求33所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)細(xì)胞為血細(xì)胞。
35.按照權(quán)利要求33所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)細(xì)胞為癌細(xì)胞、白血球、血小板、免疫細(xì)胞和血統(tǒng)特定細(xì)胞中的至少一種。
36.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)用來(lái)混合的設(shè)備包括用來(lái)將所說(shuō)樣本和所說(shuō)粒子上下顛倒翻滾的裝置。
37.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)粒子是由鎳構(gòu)成的。
38.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)粒子的直徑約從3至35微米。
39.按照權(quán)利要求38所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)粒子的直徑約為5微米。
40.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)粒子的密度約為2g/cm2或更大。
41.按照權(quán)利要求40所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)粒子的密度約為9g/cm3。
42.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)粒子的密度約為所說(shuō)組群的密度的兩至三倍。
43.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，所說(shuō)反應(yīng)劑為抗體、藥物、激素、生長(zhǎng)素、外源凝集素、酶或核酸序列中的至少一種。
44.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)反應(yīng)劑為抗體。
45.按照權(quán)利要求44所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)抗體為專(zhuān)門(mén)針對(duì)血小板的抗體或白血球中的至少一種。
46.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)混合約需進(jìn)行15秒至30分鐘。
47.按照權(quán)利要求46所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)混合約需進(jìn)行4分鐘。
48.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)重力沉積約需進(jìn)行15秒至180分鐘。
49.按照權(quán)利要求48所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)重力沉積約需進(jìn)行4分鐘。
50.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)分離裝置包括用來(lái)將所說(shuō)樣本部分的所得到的上層清液的至少一部分移走而不移走所說(shuō)粒子和所說(shuō)連結(jié)的組群或子組群的裝置。
51.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)分離裝置包括用來(lái)隔離所說(shuō)粒子，然后從所說(shuō)粒子上移走所說(shuō)連結(jié)的組群或子組群的裝置。
52.按照權(quán)利要求51所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)連結(jié)的子組群為CD8正細(xì)胞。
53.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)用來(lái)混合的裝置包括用來(lái)使所說(shuō)粒子反復(fù)通過(guò)所說(shuō)樣本部分的相當(dāng)大的部分進(jìn)行沉積從而使所說(shuō)粒子和所說(shuō)樣本部分混合的裝置。
54.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，用來(lái)從全部血液中制備富含粒細(xì)胞制劑的裝置包括提供至少有單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板的單克隆抗體連結(jié)在其上的粒子，然后從所說(shuō)樣本部分的所得到的上層清液中至少移走一部分而并不移走所說(shuō)粒子和所說(shuō)連結(jié)的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板的組群或子組群的裝置。
55.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，用來(lái)從全部血液中制備富含淋巴細(xì)胞制劑的裝置包括提供至少有單核細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞和血小板的單克隆抗體連結(jié)在其上的粒子，然后從所說(shuō)樣本的所得到的上層清液中至少移走一部分而并不移走所說(shuō)粒子和所說(shuō)連結(jié)的單核細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞和血小板的組群或子組群的裝置。
56.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)樣本為全部血液或骨髓的一部分，制備所說(shuō)樣本的裝置包括提供至少有血小板的單克隆抗體連結(jié)在其上的所說(shuō)粒子及從所說(shuō)樣本部分的所得到的上層清液中至少移走一部分而并不移走所說(shuō)粒子和所說(shuō)連結(jié)的血小板的組群或子組群的裝置。
57.按照權(quán)利要求56所述的設(shè)備，其特征為，所提供的粒子還包括連接在其上的嗜中性細(xì)胞的單克隆抗體，所說(shuō)裝置在從所說(shuō)樣本部分的最終上層清液中至少移走一部分時(shí)，并不移走所說(shuō)粒子和所說(shuō)粒子和所說(shuō)連結(jié)的嗜中性細(xì)胞的組群或子組群。
58.按照權(quán)利要求56所述的設(shè)備，其特征為，所提供的粒子還具有對(duì)基本上所有血統(tǒng)正細(xì)胞為正作用的單克隆抗體，所說(shuō)裝置在從所說(shuō)樣本的所得到的上層清液中至少移走一部分時(shí)，并不移走所說(shuō)粒子和所說(shuō)連結(jié)的血統(tǒng)正細(xì)胞的組群或子組群。
59.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，備有在與所說(shuō)反應(yīng)劑連結(jié)之前將所說(shuō)粒子加熱的裝置。
60.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，備有將所說(shuō)粒子凍干的裝置。
61.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)樣本為全部血液或骨髓的一部分，制備所說(shuō)樣本的裝置包括提供具有對(duì)基本上所有血統(tǒng)正細(xì)胞為正作用的單克隆抗體的粒子及從所說(shuō)樣本部分的所得到的上層清液中至少移走一部分而并不移走所說(shuō)粒子和所說(shuō)連結(jié)的血統(tǒng)正細(xì)胞的組群或子組群的裝置。
62.按照權(quán)利要求32所述的設(shè)備，其特征為，所說(shuō)樣本是全部血液或骨髓的一部分。
全文摘要
一種應(yīng)用較重的密實(shí)粒子和重力沉積從生物樣本中分離出選定的所需或不需組群的分離程序。粒子具有一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)劑連結(jié)在其上，該反應(yīng)劑專(zhuān)門(mén)針對(duì)所選定的組群并容易與它連結(jié)。粒子與樣本的混合最好是使粒子反復(fù)通過(guò)樣本的相當(dāng)大的部分進(jìn)行沉積以便與選定的組群連結(jié)。然后最好使粒子和連結(jié)在其上的選定的組群在樣本內(nèi)沉積，包括非選定組群的上層清液可從粒子和連結(jié)著的選定組群上分開(kāi)。粒子可以加熱以便殺菌并清除內(nèi)毒素。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1150841SQ95192581
公開(kāi)日1997年5月28日 申請(qǐng)日期1995年4月11日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月15日
發(fā)明者華萊士·H·科特, 羅伯特·K·茲沃納, 羅伯特·J·施米特林, 托馬斯·R·拉塞爾 申請(qǐng)人:科特公司