專利名稱：波長(zhǎng)分散電泳儀的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種電泳儀，用于分別測(cè)定脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及其類型物，更確切地說(shuō)，它是一種波長(zhǎng)分散電泳儀，特別適用于測(cè)定由不同波長(zhǎng)的多種熒光電泳所標(biāo)記的試樣發(fā)出的熒光。
以往DNA堿基序例的測(cè)定方法是這樣的用放射自顯影術(shù)將分離的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)拍成照片，然而用這種方法處理放射性元素很麻煩，而且廢刀廢時(shí)。為此，就考慮了這樣工作的系統(tǒng)在電泳分離期間通過(guò)DNA通過(guò)熒光標(biāo)記實(shí)時(shí)地測(cè)定DNA斷片(L.M.史密斯等，自然，第321卷，674-679頁(yè)(1986年))。用這種方法，當(dāng)特定的DNA的一端固定時(shí)，在另一端或中間做上熒光標(biāo)記，以便分出四種DNA斷片組，每一種DNA斷片的另一端的核酸堿基分別為腺膘(A)，胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)或(G)。這時(shí)，用發(fā)射不同波長(zhǎng)的熒光電泳來(lái)標(biāo)記各個(gè)堿基試樣，然后將四種斷斷片組放在一起由凝膠電泳分離。電泳在較短的DNA斷片上移動(dòng)速度更快些，因此當(dāng)某一試樣進(jìn)入一固定距離的某一處被激光照射后，DNA斷片便從照射過(guò)的地方通過(guò)，其中最短的斷片會(huì)成功地發(fā)出熒光。由于不同堿基試樣發(fā)射波長(zhǎng)不同，所以可用波長(zhǎng)來(lái)測(cè)定不同的堿基試樣。而斷片的長(zhǎng)度則可用移動(dòng)的時(shí)長(zhǎng)來(lái)測(cè)定。
為辯別四種不同波長(zhǎng)的熒光。L.M.史密斯等轉(zhuǎn)換四種發(fā)射不同波長(zhǎng)的濾光器。此外，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)股份公司出售一種儀器，儀器上有一淺盤式凝膠可供測(cè)量多種試樣。此儀器內(nèi)有一激光束照射著凝膠平面的一個(gè)點(diǎn)。熒光從這里發(fā)射穿過(guò)一旋轉(zhuǎn)濾光器，熒光由光敏部位測(cè)定，測(cè)定大量試樣時(shí)，用激光交替照射不同部位，直線掃描凝膠并檢測(cè)光敏部位，用這種方法取得各項(xiàng)信息。
以前的工藝是采用旋轉(zhuǎn)濾光器，沒有考慮增強(qiáng)被測(cè)定部位接收熒光的量，更確切地說(shuō)，在測(cè)定水平方向(與電泳垂直的方向)10Cm之內(nèi)的電泳盤表面區(qū)域時(shí)，激光照射每個(gè)點(diǎn)的周期為一個(gè)掃描周期(通常為1秒鐘左右)的 1/200 假設(shè)激光束的寬度為0.5mm，另外由于四個(gè)濾光旋轉(zhuǎn)與四個(gè)堿基樣本相對(duì)應(yīng)，測(cè)定每個(gè)堿基試樣的周期則僅是每個(gè)點(diǎn)周間的四分之一。最終，測(cè)定一個(gè)堿基試樣某一點(diǎn)所用的時(shí)間僅為一個(gè)整測(cè)定時(shí)間的 1/800 ，因此由于吸收的熒光量很小，所以靈敏度不高。
本發(fā)明的目標(biāo)是要提供一個(gè)高靈敏度的波長(zhǎng)分散電泳儀。該儀器采用沒有旋轉(zhuǎn)濾光器的簡(jiǎn)單裝置，在整個(gè)檢測(cè)周期內(nèi)接受各種波長(zhǎng)的熒光。
為達(dá)到上述目標(biāo)，本發(fā)明的波長(zhǎng)分散電泳儀的構(gòu)造是這樣的;一個(gè)測(cè)量區(qū)(即一個(gè)復(fù)蓋了水平方向上一段固定長(zhǎng)度的區(qū)域，此固定長(zhǎng)度是予先確定的，自電泳盤上的電泳起點(diǎn)起始)同時(shí)被一光束照射，發(fā)射的熒光由一直視棱鏡(即一復(fù)合棱鏡，它由一組不同材料做成的棱鏡組合而成，該鏡使D線的偏斜幾乎為零，并將其兩面的其他線分散開)產(chǎn)生波長(zhǎng)散射，而后透鏡系統(tǒng)使波長(zhǎng)的散射聚焦在一圖象增強(qiáng)器上，平面探測(cè)器檢測(cè)聚焦的圖象。
也就是說(shuō)，本發(fā)明的波長(zhǎng)分散電泳儀達(dá)到其目標(biāo)的方法是這樣的通過(guò)在聚焦透鏡前配置一直視棱鏡來(lái)聚焦熒光(在聚焦透鏡和電泳盤之間)使其能進(jìn)行波長(zhǎng)分散并同時(shí)將分散的熒光聚焦。
更具體的說(shuō)，該電泳儀有用電泳分離一試樣組的裝置，該試樣組是由標(biāo)有至少二種熒光電泳標(biāo)記的試驗(yàn)組成。激發(fā)裝置用以激發(fā)已標(biāo)定試樣的熒光電泳，使試樣發(fā)射熒光，探測(cè)裝置用于探測(cè)發(fā)射出的熒光;本發(fā)明的波長(zhǎng)分散電泳儀含有一直視棱鏡。它能分散各種波長(zhǎng)的熒光，并將其配置在上面所說(shuō)的探測(cè)器前。
更詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明的波長(zhǎng)分散電泳儀的典型結(jié)構(gòu)如下ⅰ)由平行配置的多個(gè)移動(dòng)通道所構(gòu)成的電泳分離裝置;ⅱ)所說(shuō)的激發(fā)裝置是指形成激發(fā)光的裝置，激發(fā)光與所有移動(dòng)通道相交，并垂直射入移動(dòng)通道;ⅲ)由平面檢測(cè)器構(gòu)成所述的檢測(cè)裝置;Ⅵ)直視棱鏡和探測(cè)裝置的安排可以使熒光圖象按垂直方向(移動(dòng)方向)進(jìn)行波長(zhǎng)分散。
通常，把激光束作為激發(fā)光，一般情況下，激光束可看作一平行光束，在測(cè)量區(qū)域內(nèi)的那段光束基本上是圓環(huán)狀，其直徑為0.3mm或小于0.3mm。
多種熒光標(biāo)記物之間的波長(zhǎng)差異及直視棱鏡角度分散之間的差異都得到完善的處理，以致使圖象增強(qiáng)器上基于不同電泳的熒光圖象之間的間隔在0.1mm以上，原因是在當(dāng)今具有圖象增強(qiáng)器的熒光探測(cè)器上，其熒光圖象的位置分辯力是0.03～0.05mm。
另外，直視棱鏡前通常配置一切割激發(fā)激光束的濾光器(位于直視棱鏡與電泳盤之間)。
相應(yīng)地，這些裝置的排列順序?yàn)橐苿?dòng)通道，濾光器，直視棱鏡，聚光透鏡，圖象增強(qiáng)器和平面探測(cè)器。
移動(dòng)通道是凝膠做成的，如眾所周知的聚丙烯酰胺凝膠。通常使用的電泳盤具有多條移動(dòng)通道。一般，電泳盤的結(jié)構(gòu)是凝膠被夾在面熒平盤的支架之間。
通常平面探測(cè)器的輸出信號(hào)經(jīng)一檢測(cè)電路傳到監(jiān)視器，也可經(jīng)過(guò)檢測(cè)電路和計(jì)算機(jī)傳送到輸出裝置，如繪圖儀，陰極射線管，這一輸出信號(hào)是經(jīng)過(guò)處理和分析的。
眾所周知，圖象增強(qiáng)器可將光學(xué)圖象聚焦在其感光熒光屏上，然后轉(zhuǎn)換成光電子，這些光電子又被放大為次電子被投射到熒光屏上，從而可看到清晰的密度圖象。該設(shè)備是一種光信號(hào)放大器。
上面所描述的本發(fā)明的波長(zhǎng)分散電泳儀避免了以前那種使用旋轉(zhuǎn)濾光器的缺陷。而且本發(fā)明的電泳儀使用的是直視棱鏡，它不同于傳統(tǒng)的信號(hào)棱鏡，它由多種棱鏡組成。發(fā)射的光路并不完全不同于入射的光路，僅基于波長(zhǎng)導(dǎo)致分散。因此，利用透鏡系統(tǒng)并以波長(zhǎng)分散的形式，無(wú)失直的熒光圖象能在圖象增強(qiáng)儀或高靈敏度的平面探測(cè)器上聚焦。
假設(shè)，熒光圖象在水平方向上出現(xiàn)，熒光圖象在垂直方向上產(chǎn)生波長(zhǎng)分散，則各種波長(zhǎng)是由其在垂直方向上的不同部位來(lái)區(qū)分的，而所照射的不同部位是由水平方向的坐標(biāo)來(lái)區(qū)分的。垂直方向的散射表示帶有不同熒光標(biāo)記的基本物質(zhì)，而水平方向的位置則反映了加載位置的不同并表示了試樣的差異性。
本發(fā)明很好的利用了已知的熒光檢測(cè)型的電泳儀技術(shù)，只是更新了區(qū)分熒光波長(zhǎng)的測(cè)量方法，尤其是采用了直視棱鏡和激發(fā)激光束的(不同)進(jìn)入方向。


圖1是一原理圖，展示了一臺(tái)波長(zhǎng)分散電泳儀的結(jié)構(gòu)，是該發(fā)明的具體裝置。
圖2A是一個(gè)解釋性的圖解，示出了一個(gè)DNA堿基序列的例子。
圖2B是一個(gè)解釋性的圖解，說(shuō)明了確定DNA堿基序列的原理。
圖3是一個(gè)截面圖，展示了用于該發(fā)明的波長(zhǎng)分散電泳儀具體裝置的直視棱鏡。
現(xiàn)對(duì)本發(fā)明的具體裝置作一圖解說(shuō)明。
圖1顯示了整個(gè)儀器的結(jié)構(gòu)，圖2A、2B說(shuō)明了堿基序列判決的原理，圖3是復(fù)合棱鏡的工作原理。
要測(cè)定其序列的DNA16的一端(見圖2A)用熒光電泳F1作標(biāo)記，另一端(〔A〕組)備有一組斷片，每一段片為腺膘呤堿基(A)，同時(shí)備有類似的其他幾組堿基斷片;胞嘧啶(C)，烏嘌呤，(G)和胸腺嘧啶(T)，然后對(duì)不同的斷片組變換使用標(biāo)定的熒光電泳即對(duì)C、G和T分別改用F2、F3和F4。最后將〔A〕、〔C〕、〔G〕和〔T〕堿基斷片組放在一起并將試樣放到電泳凝膠上的試樣槽18內(nèi)，以便進(jìn)行電泳，一個(gè)試樣用一條移動(dòng)通道(31)在這裝置中，電泳盤17可容納多條移動(dòng)通道31，這樣便可同時(shí)測(cè)定大量的試樣，如圖2B所示，較短的DNA斷片移動(dòng)得快些。因此，用光照射一段距離的某一點(diǎn)(在這一裝置中為20～30cm)，這段距離是事先確定并從電泳的起始點(diǎn)開始的，然后在觀察通過(guò)這一點(diǎn)的DNA斷片發(fā)射出的各種熒光時(shí)，便可從經(jīng)歷的時(shí)間周期來(lái)測(cè)定堿基的長(zhǎng)度，通過(guò)熒光的波長(zhǎng)可確定在另一端的堿基種類。
電泳凝膠含有3-8重量百分比的聚丙烯酰凝膠，其厚度為0.2mm，寬度為20cm，長(zhǎng)度為30cm，電泳凝膠夾在石英平盤中間。雖然圖2B中DNA帶15只出現(xiàn)在移動(dòng)通道31的左邊，但實(shí)際上DNA帶可出現(xiàn)在移動(dòng)通道31的各個(gè)通道上。
至于激發(fā)光，以所使用的激光束13(圖1)為例，激光器2發(fā)射出激光束13，經(jīng)鏡子3適當(dāng)?shù)胤瓷洌瓷涔馑降剡M(jìn)入凝膠盤1的一面，且基本與盤子的表面平行。測(cè)定區(qū)域是電泳盤上水平方向的10cm范圍。
從凝膠發(fā)射出去的熒光圖象以及包含多條移動(dòng)通道的激發(fā)光在直線部位上所發(fā)射出的電泳都通過(guò)濾光器4以供切割激發(fā)光直視棱鏡14迫使激發(fā)光波長(zhǎng)分散，分散的圖象通過(guò)聚焦鏡5在圖象增強(qiáng)器6上聚焦，形成所發(fā)射的區(qū)域圖象。平面檢測(cè)器7接收了分散的和增強(qiáng)后的圖象。檢測(cè)器的水平位置表示了發(fā)射區(qū)的座標(biāo)，而垂直方向則與波長(zhǎng)的分散相對(duì)應(yīng)，因此，從一組DNA斷片發(fā)出的熒光信號(hào)在檢測(cè)器上接收到的是一條或幾條水平線，波長(zhǎng)分散的熒光信號(hào)在檢測(cè)器上獲得至少4條的水平線，檢測(cè)電路9采集了這些信號(hào)，信號(hào)檢測(cè)的狀態(tài)可在監(jiān)控器8上觀察到，另外，檢測(cè)電路9產(chǎn)生的信號(hào)可由存儲(chǔ)器10，計(jì)算機(jī)11和輸出設(shè)備12進(jìn)行處理和分析。
這里進(jìn)一步給出一個(gè)例子，波長(zhǎng)為488nm的激光束作為激發(fā)光，同時(shí)FITC(異硫氰酸熒光素的發(fā)射波長(zhǎng)為515nm)和它的同質(zhì)異能素(發(fā)射波長(zhǎng)為535nm，555nm，575nm)作為熒光電泳，正如圖3所說(shuō)明的，棱鏡的折射組合系數(shù)為n2和n3不同波長(zhǎng)的折射角所產(chǎn)生的散射角
可由下列公式
這里uout表示偏差角，λ為波長(zhǎng)，α2分別為第一塊棱鏡20和第三塊棱鏡22的頂角，n2為第一和第三塊棱鏡的平均折射系數(shù)(“平均折射系數(shù)”指的是四種熒光波長(zhǎng)取平均值后的折射系數(shù))。
η1為空氣的折射系數(shù)，η3為第二塊棱鏡21的平均折射系數(shù)。進(jìn)一步說(shuō)，
為第一塊棱鏡20和第三塊棱鏡22的光學(xué)成分玻璃的ηd值(D線折射系數(shù)為587.6nm)ηd3為第二塊棱鏡21的光學(xué)成分玻璃的ηd值，νd2為第一和第三塊棱鏡的光學(xué)成分玻璃的νd值(D線折射系數(shù)的散射)，νd3′為第二塊棱鏡的光學(xué)成分玻璃的νd值，λF、λC和λd(下線、C線、D線的波長(zhǎng)分別為486.1nm，656.3nm和587.6nm，另外，折射系數(shù)n1取值為1。
當(dāng)頂角α2取值為15°，“SFS1”和“FK5”分別取值于第一塊棱鏡和第二塊棱鏡的材質(zhì)，得出折射系數(shù)η2為1.92，折射系數(shù)η3為1.4第二塊棱鏡21的頂角α3為
另外，νd2＝21，ηd2＝1.92，νd3＝70，ηd3＝1.4進(jìn)而，可算出下式
這里，假設(shè)波長(zhǎng)之間的差值△λ＝20nm，透鏡和透鏡圖象之間的距離L＝60mm，進(jìn)而在圖象增強(qiáng)器上散射△l為l＝0.095·△λ·L＝0.11(mm)即0.11mm的散射加在圖象增強(qiáng)器上。另舉一個(gè)要求更大散射的例子，設(shè)α2＝30°，L＝100mm得出更大的散射為0.36mm，這里不同的波長(zhǎng)可令人滿意地分辯出來(lái)。順提一下，圖象增強(qiáng)器上的位移分辯力為0.03mm圖3中的數(shù)19表示一入射光束，數(shù)19′，19″，19″表示輸出光束，輸出光束分別具有D線波長(zhǎng)、比D線長(zhǎng)的波長(zhǎng)以及比D線短的波長(zhǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的波長(zhǎng)分散電泳儀，不需要更大地改變光路就能完成波長(zhǎng)的分散，因此可以通過(guò)沒有失真的波長(zhǎng)分散來(lái)測(cè)定熒光圖象，這一發(fā)明體系不同先前的技術(shù)手段，不需要用不同的旋轉(zhuǎn)濾光器來(lái)分別接收不同的波長(zhǎng)。在整個(gè)測(cè)量周期內(nèi)，使用一個(gè)簡(jiǎn)單的裝置就能接收到足夠飭渴褂玫母髦植煌ǔさ撓?，因此获得了窚\８叩牧槊舳取
權(quán)利要求
1.電泳儀是用電泳方法分離試樣組的裝置，試樣組由標(biāo)以至少二種熒光電泳的試樣組成，激發(fā)裝置用于激發(fā)已標(biāo)定的試樣的熒光電泳使試樣發(fā)射熒光，檢測(cè)裝置用于檢測(cè)發(fā)射出的熒光。而波長(zhǎng)分散電泳儀的特殊是一個(gè)復(fù)合棱鏡(14)，該鏡是由多種用不同材料做成的一組棱鏡組成，它將不同波長(zhǎng)的熒光分散，并將熒光投射在所說(shuō)的檢測(cè)裝置前面。
2.權(quán)利要求1中所說(shuō)的波長(zhǎng)分散電泳儀中的電泳分散裝置實(shí)際是由鄉(xiāng)條并行配置的移動(dòng)通道(31)組成，所說(shuō)的激發(fā)裝置是由激發(fā)光(13)組成，激發(fā)光與所有的移動(dòng)通道(31)相交，并垂直射入移動(dòng)通道(31)，檢測(cè)裝置是一種平面檢測(cè)器(7)，復(fù)合棱鏡(14)和檢測(cè)裝置的安排應(yīng)使是波長(zhǎng)分散發(fā)生在與熒光圖家垂直的方向上。
3.權(quán)利要求2中所說(shuō)的波長(zhǎng)分散電泳儀的復(fù)合鏡前配置一濾光器(4)，用于切割。
4.波長(zhǎng)分散電泳儀的組成ⅰ，一個(gè)電泳盤(17)，它包括多條移動(dòng)通道(31)，對(duì)標(biāo)有至少兩種熒光電泳的試樣組成的一組試樣進(jìn)行電泳;ⅱ一個(gè)濾光器(4)用于切割激發(fā)光;ⅲ，一個(gè)復(fù)合棱鏡(14)，它是由不同材料做成的多個(gè)棱鏡組成;Ⅳ)一個(gè)聚焦透鏡(5);Ⅴ，一個(gè)圖象增強(qiáng)器(6);Ⅵ，一個(gè)平面熒光檢測(cè)器(7)，上述部件按ⅰ，-Ⅵ，的順序排列放置。另有一個(gè)激發(fā)光裝置，導(dǎo)致激光束(13)射入以便與所有的移動(dòng)通道(31)垂直相交。
5.權(quán)利要求4中的波長(zhǎng)分散電泳儀中的激光束(13)是一種平行光束，其截面為環(huán)形，在電泳盤(17)的測(cè)量區(qū)域內(nèi)，其直徑不超過(guò)3mm。
全文摘要
波長(zhǎng)分散電泳儀用于測(cè)定標(biāo)有多種熒光電泳的脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及其類似物試樣發(fā)射出的不同波長(zhǎng)的熒光。為了分離和分辯各種熒光電泳的發(fā)射波長(zhǎng)，儀器中裝有一個(gè)直視棱鏡(14)，該鏡置于一平面熒光檢測(cè)器(7)和一電泳盤(17)之間，直視棱鏡(14)分離熒光波長(zhǎng)的方法是采用一簡(jiǎn)單的裝置將不同波長(zhǎng)的熒光分離開作測(cè)定，靈敏度高且不會(huì)破壞熒光圖象。
文檔編號(hào)G01N27/447GK1037214SQ8810743
公開日1989年11月15日 申請(qǐng)日期1988年10月29日 優(yōu)先權(quán)日1987年10月30日
發(fā)明者神原秀記, 伊藤嘉敏 申請(qǐng)人:株式會(huì)社日立制作所