專(zhuān)利名稱(chēng):用于生物分子鑒定及表征的方法和儀器的制作方法
1.簡(jiǎn)介本發(fā)明涉及計(jì)算機(jī)輔助的方法和儀器，其用于高效及系統(tǒng)地研究存在于生物學(xué)樣品中的分子并測(cè)定它們?cè)诮】岛图膊≈械淖饔?。尤其是，本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)圖(protemics)的成像領(lǐng)域，其包括存在于生物學(xué)樣品中的蛋白質(zhì)的系統(tǒng)鑒定及表征，其中蛋白質(zhì)包括糖基化的或展示其它翻譯后修飾的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)圖方法對(duì)于鑒定對(duì)診斷、預(yù)后或監(jiān)測(cè)應(yīng)答治療的有用之蛋白質(zhì)以及在鑒定用于疾病預(yù)防和治療的蛋白質(zhì)目標(biāo)中提供了極大的優(yōu)點(diǎn)。
2.發(fā)明背景在分子遺傳學(xué)上的最新進(jìn)展揭示了用于在特定細(xì)胞或組織中核酸表達(dá)研究的高通量的測(cè)序技術(shù)和系統(tǒng)策略的益處。這些進(jìn)展已經(jīng)突出了對(duì)不依賴(lài)操作者的計(jì)算機(jī)介導(dǎo)的方法的需求，這些方法用于鑒定和選擇來(lái)自蛋白質(zhì)、寡糖及其它生物分子的復(fù)雜混合物的子集或個(gè)體分子，并分離這種選擇的生物分子用于進(jìn)一步分析。
用于靶物驅(qū)動(dòng)的藥物發(fā)現(xiàn)以及合理的藥物設(shè)計(jì)的策略需要鑒定在因果關(guān)系上涉及疾病過(guò)程的關(guān)鍵細(xì)胞組分，例如蛋白質(zhì)，以及使用這種組分作為治療干預(yù)的靶物。然而，現(xiàn)在的分析生物分子例如蛋白質(zhì)的方法耗費(fèi)時(shí)間并且昂貴，而且在檢測(cè)、成像、純化及分析方面要受效率低下的困擾。
雖然基因組方法已經(jīng)推進(jìn)了我們對(duì)生物學(xué)過(guò)程之遺傳基礎(chǔ)的理解，但有明顯的局限性。首先，鑒定的基因，尤其是部分cDNA序列編碼的產(chǎn)物的功能經(jīng)常是未知的。其次，有關(guān)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的信息很少能從其基因序列的知識(shí)推導(dǎo)出，并且現(xiàn)在很明顯大部分蛋白質(zhì)經(jīng)歷能夠深刻地影響其生物化學(xué)特性的翻譯后修飾(例如糖基化及磷酸化)。第三，蛋白質(zhì)表達(dá)通常受翻譯后控制，所以細(xì)胞的mRNA水平不是必定與其基因產(chǎn)物的表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)。第四，自動(dòng)化的核酸隨機(jī)測(cè)序策略包括在確定其顯示臨床或科學(xué)意義(如果有的話(huà))之前大量核酸分子的分析。
因?yàn)檫@些原因，需要補(bǔ)充基因組資料，方法是通過(guò)研究蛋白質(zhì)和碳水化合物的表達(dá)模式以及通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)、寡糖和其它生物分子的直接分析研究其在生物學(xué)或疾病過(guò)程中翻譯后修飾的模式。然而，技術(shù)上的局限到現(xiàn)在為止已經(jīng)阻礙了在生物學(xué)樣品中蛋白質(zhì)或其它生物分子的快速、經(jīng)濟(jì)、可重復(fù)的系統(tǒng)分析。
3.發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于生物學(xué)樣品中生物分子的鑒定、選擇和表征的高效計(jì)算機(jī)輔助的方法及儀器。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)分離存在于復(fù)雜混合物中的生物分子產(chǎn)生一個(gè)二維陣列。本發(fā)明提供了一種計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的數(shù)字化分布圖，其表示在二維陣列中檢測(cè)的多數(shù)生物分子的特征性及相對(duì)豐度，籍此允許計(jì)算機(jī)介導(dǎo)的來(lái)自多重生物學(xué)樣品分布圖的比較。這種篩選生物學(xué)樣品并比較其分布圖的自動(dòng)化技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)個(gè)體生物分子快速高效的鑒定，這些分子的存在、缺乏或改變的表達(dá)與疾病或目標(biāo)病況相聯(lián)系。這種生物分子可用作治療劑，用作用于治療干預(yù)的靶物以及用作診斷、預(yù)后和評(píng)價(jià)對(duì)治療反應(yīng)的標(biāo)記。這種技術(shù)也實(shí)現(xiàn)了快速并高效的鑒定成套的生物分子，其表達(dá)模式與疾病或目標(biāo)病況相聯(lián)系；這些成套的生物分子提供了用于診斷、預(yù)后及評(píng)價(jià)對(duì)治療反應(yīng)標(biāo)記的圖樣。
本發(fā)明的高通量、自動(dòng)化的方法和儀器進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了根據(jù)預(yù)先規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)個(gè)體分離的生物分子(或分離的生物分子的子集)不依賴(lài)操作者的選擇，而不需要任何序列信息或生物分子的其它結(jié)構(gòu)特征的知識(shí)。而這又提供了在生物學(xué)樣品中檢測(cè)的多數(shù)所選生物分子的自動(dòng)化、不依賴(lài)操作者的分離以及并行表征。因此，本發(fā)明在測(cè)序或結(jié)構(gòu)表征之前，有利地實(shí)現(xiàn)了生物分子的自動(dòng)化選擇。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種適于生物分子(如蛋白質(zhì))電泳的凝膠并且其結(jié)合于固體支持物上以使凝膠具有二維空間穩(wěn)定性，并且支持物基本上不干擾關(guān)于與凝膠中一個(gè)或多個(gè)生物分子相結(jié)合的標(biāo)記的檢測(cè)(例如結(jié)合于一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記)。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)綜合的計(jì)算機(jī)程序，該計(jì)算機(jī)程序通過(guò)比較數(shù)字化分布圖來(lái)選擇在二維陣列中檢測(cè)的一個(gè)或多個(gè)生物分子，并產(chǎn)生指令指導(dǎo)一種機(jī)器人裝置從二維陣列中分離這種選擇的生物分子。然而在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，這個(gè)程序也實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)(LIMS)，其跟蹤實(shí)驗(yàn)室樣品以及相關(guān)的數(shù)據(jù)例如臨床數(shù)據(jù)，在樣品上進(jìn)行的操作和通過(guò)分析樣品產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。
4.附圖簡(jiǎn)述
圖1是根據(jù)本發(fā)明特定的實(shí)施方案，在不同蛋白質(zhì)的混合物上進(jìn)行的操作流程圖。
圖2是闡明在本發(fā)明特定的實(shí)施方案中依靠計(jì)算機(jī)執(zhí)行的功能的流程圖。
圖3是用來(lái)從本發(fā)明的被支持的凝膠中分離生物分子的機(jī)器人裝置的圖解。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用來(lái)快速和有效地鑒定及表征生物學(xué)樣品中生物分子如蛋白質(zhì)的方法和儀器。在本發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用中，生物學(xué)樣品進(jìn)行兩個(gè)連續(xù)的分離步驟。在第一個(gè)分離步驟中，生物分子根據(jù)一種物理或化學(xué)特性被分離，以產(chǎn)生包含生物分子的一維陣列；例如，蛋白質(zhì)通過(guò)等電聚焦沿著第一軸被分離。在第二個(gè)分離步驟中，在該一維陣列中的生物分子根據(jù)第二種物理或化學(xué)特性被分離，以產(chǎn)生一個(gè)分離的生物分子的二維陣列；例如，通過(guò)等電聚焦分離的蛋白質(zhì)沿著與第一個(gè)軸垂直的第二個(gè)軸進(jìn)行SDS-PAGE。分離的生物分子穩(wěn)定地保持在二維陣列中以隨后成像。基于對(duì)來(lái)自成像數(shù)據(jù)的自動(dòng)化計(jì)算機(jī)分析，穩(wěn)定的二維陣列可保存或存檔一段較長(zhǎng)的時(shí)期(如數(shù)月或數(shù)年)，并且選擇的生物分子能在任何要求的時(shí)間從陣列中檢索。
對(duì)每個(gè)檢測(cè)的生物分子，通過(guò)檢測(cè)器對(duì)二維陣列成像而產(chǎn)生包含一組x，y坐標(biāo)及一個(gè)信號(hào)值的計(jì)算機(jī)可讀的輸出信號(hào)。如需要，在計(jì)算機(jī)介導(dǎo)的分析之前或之后計(jì)算機(jī)可讀的輸出信號(hào)能夠在顯示器或任何適當(dāng)?shù)拿浇樯弦杂?jì)算機(jī)產(chǎn)生的圖像顯示給人類(lèi)操作者。對(duì)計(jì)算機(jī)可讀的輸出信號(hào)之計(jì)算機(jī)介導(dǎo)的分析導(dǎo)致計(jì)算機(jī)可讀的分布圖，對(duì)大多數(shù)檢測(cè)的生物分子而言它表示每個(gè)這種生物分子的相對(duì)豐度以及從其在二維陣列中x，y坐標(biāo)推斷的屬性。例如，來(lái)自包含通過(guò)等電聚焦后由SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)的凝膠成像的分布圖，顯示了大多數(shù)被檢測(cè)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)、表觀分子量(MW)以及相對(duì)豐度。
本發(fā)明的計(jì)算機(jī)可讀的分布圖適于計(jì)算機(jī)介導(dǎo)的分析來(lái)鑒定滿(mǎn)足特定標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)或多個(gè)生物分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一組分布圖與第二組分布圖比較以鑒定在所有第一組分布圖中存在(或以第一組分布圖的第一個(gè)百分比)而在第二組分布圖中缺失(或第二組分布圖的第二個(gè)百分比缺失，第一和第二百分比可以獨(dú)立地指定)的生物分子。在其它實(shí)施方案中，比較多組分布圖以鑒定與另一樣品組分布圖的指定百分比相比，在一個(gè)樣品組分布圖中存在以指定的較高水平表達(dá)的生物分子，或鑒定一個(gè)樣品組與另一個(gè)樣品組在翻譯后加工中不同的生物分子。
選擇如此鑒定的一個(gè)或多個(gè)生物分子來(lái)進(jìn)行分離。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種選擇是根據(jù)預(yù)先規(guī)定的編程的標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)計(jì)算機(jī)自動(dòng)進(jìn)行的，沒(méi)有更多的人類(lèi)干預(yù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人類(lèi)操作者綜合計(jì)算機(jī)介導(dǎo)的分析結(jié)果，然后輸入計(jì)算機(jī)一個(gè)選擇。為分離每個(gè)選擇的生物分子，計(jì)算機(jī)產(chǎn)生指導(dǎo)機(jī)器人裝置的機(jī)器可讀性指令(a)取出包含選擇的生物分子二維陣列的一個(gè)或多個(gè)部分并且(b)將取出的部分輸運(yùn)至一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)?shù)娜萜饔糜谶M(jìn)一步表征。例如，可以分析選擇的蛋白質(zhì)以確定其全部或部分的氨基酸序列，以檢測(cè)并表征任何結(jié)合的寡糖部分，以及研究翻譯后加工的其它方面，例如磷酸化、十四烷基化等等。本發(fā)明有利地實(shí)現(xiàn)了從二維陣列取出生物分子的自動(dòng)化并行步驟，從而促進(jìn)許多選擇的生物分子快速及有效的表征。圖一表示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案，一個(gè)樣品的圖解處理的流程圖。
本發(fā)明可用于鑒定及分析蛋白質(zhì)，但是一般地更適于鑒定及分析任何生物分子。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“生物分子”指的是存在于生物學(xué)樣品中的任何有機(jī)分子，并包括肽、多肽、蛋白質(zhì)、寡糖、脂類(lèi)、類(lèi)固醇、前列腺素、前列環(huán)素以及核酸(包括DNA和RNA)。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”包括糖基化的及非糖基化的蛋白質(zhì)。5.1.生物學(xué)樣品如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)樣品”指的是從任何活生物體排泄或分泌物中獲得的任何固體或液體樣品，包括單細(xì)胞微生物(例如細(xì)菌和酵母)以及多細(xì)胞生物(例如植物和動(dòng)物，如脊椎動(dòng)物或哺乳動(dòng)物，尤其是健康或表面上健康的人或由將被診斷或調(diào)查的病情或疾病侵襲的人類(lèi)患者)。生物學(xué)樣品可以是從任何部位(例如血液、血漿、血清、尿液、膽汁、腦脊液、含水的或玻璃樣體液，或任何身體分泌物)獲得的生物學(xué)液體，滲出液，分泌液(例如從膿腫或任何感染或發(fā)炎的其它部位獲得的液體)，或從關(guān)節(jié)(例如正常的關(guān)節(jié)或被疾病例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)或膿毒性關(guān)節(jié)炎侵襲的關(guān)節(jié))獲得的液體。另外，生物學(xué)樣品可從任何器官或組織(包括活組織檢查或尸體解剖樣品)獲得，或從包括細(xì)胞(無(wú)論是原代的或培養(yǎng)的細(xì)胞)或被任何細(xì)胞、組織或器官?zèng)Q定的介質(zhì)中獲得。如需要，生物學(xué)樣品可以經(jīng)過(guò)初步加工，包括初步分離技術(shù)。例如，可以提取細(xì)胞或組織并進(jìn)行亞細(xì)胞分級(jí)分離，用來(lái)在特定的亞細(xì)胞部分分離分析生物分子，例如在細(xì)胞的不同部分發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)或藥物。見(jiàn)Deutscher(編)，1990，酶學(xué)方法(Methods InEnzymology)182卷，147-238(在此引入其全部以供參考)。類(lèi)似地，可以進(jìn)行免疫沉淀以鑒定抗原相關(guān)的生物分子，例如蛋白質(zhì)。見(jiàn)Firestone和Winguth在Duetscher中，出處同前，688-699(在此引入其全部以供參考)。
優(yōu)選地，對(duì)分析有用的相關(guān)臨床信息依相應(yīng)的樣品按目錄分類(lèi)并編為索引；基于計(jì)算機(jī)的實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)(LIMS)優(yōu)選地用于此目的。這種信息優(yōu)選地包括患者資料例如家族史、臨床診斷、性別、年齡、民族、居住地、工作地以及病史。在LIMS中，涉及樣品本身的信息也優(yōu)選地編入索引；這種信息可包括樣品類(lèi)型、取樣的精確位置、取樣品的日時(shí)、采集與保存之間的時(shí)間、保存的方法及獲得樣品使用的方法。
將信息記錄索引到適合的樣品的方法可以包括對(duì)記錄和樣品分配匹配的編號(hào)。優(yōu)選地通過(guò)使用條形碼和條形碼掃描器使這個(gè)過(guò)程自動(dòng)化。處理每個(gè)樣品時(shí)，掃描器用于將樣品鑒定號(hào)碼記錄進(jìn)LIMS，通過(guò)其不同操作追蹤樣品，因而在記錄和樣品之間保持鏈接。條形碼的使用同樣實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)歸檔并檢索保存的樣品及凝膠。5.2.蛋白質(zhì)分析在一個(gè)實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的方法及儀器鑒定并表征在生物學(xué)樣品中的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)。5.2.1.第一步分離對(duì)那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，很多種分離蛋白質(zhì)的技術(shù)是眾所周知的，見(jiàn)例如，Deutscher(編)，1990，酶學(xué)方法182卷，9-18頁(yè)和285-554頁(yè)(在此引入其全部以供參考)，并可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行應(yīng)用。以舉例方式但并不限于此，蛋白質(zhì)可以基于等電點(diǎn)(例如通過(guò)層析聚焦或等電聚焦)、基于電泳遷移率(例如通過(guò)非變性電泳或通過(guò)在變性劑如尿素或十二烷基硫酸鈉(SDS)存在情況下，在有或沒(méi)有提前經(jīng)還原劑例如2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇處理的電泳)，通過(guò)在任何合適的基質(zhì)上的包括FPIC和HPIC的層析(例如凝膠過(guò)濾層析，離子交換層析，反相層析或親和層析，例如帶有固定化抗體或凝集素)，或通過(guò)離心(例如等密度離心或速度離心)分離。
任何分離技術(shù)，包括上面列舉的任何技術(shù)，可以用于第一步分離。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一步分離導(dǎo)致一個(gè)不連續(xù)的一維陣列(例如在親和層析中收集的級(jí)分)。更優(yōu)選地，第一步分離導(dǎo)致連續(xù)的一維陣列；特別優(yōu)選的是在配有合適電解質(zhì)的聚丙烯酰胺條形凝膠中的等電聚焦。5.2.2.第二步分離第二步分離應(yīng)用一種不同于在第一步分離中使用的分離技術(shù)，產(chǎn)生一個(gè)分離蛋白質(zhì)的二維陣列。在任何介質(zhì)中可使用任何分離技術(shù)(包括上文列舉的那些)只要(a)所得的生物分子(例如蛋白質(zhì))的二維陣列可以成像以檢測(cè)在分離介質(zhì)中許多生物分子的物理位置，并且(b)一個(gè)或多個(gè)選擇的生物分子可以從進(jìn)行第二步分離的介質(zhì)中分離。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二步分離在凝膠如聚丙烯酰胺平板凝膠中應(yīng)用電泳；特別優(yōu)選的是在十二烷基硫酸鈉存在下的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。如果第一步分離導(dǎo)致不連續(xù)的一維陣列，一維陣列的組分(或其等分樣品)經(jīng)受第二種分離技術(shù)。例如來(lái)自親和層析的等分樣品上樣于進(jìn)行SDS-PAGE的聚丙烯酰胺凝膠孔中。如果第一步分離導(dǎo)致連續(xù)的一維陣列，那么該陣列(或其部分)再經(jīng)過(guò)第二種分離技術(shù)。例如通過(guò)等電聚焦將包含沿著第一軸分離的蛋白質(zhì)的帶狀凝膠加樣于聚丙烯酰胺平板凝膠，用于沿著與第一軸垂直的第二軸進(jìn)行SDS-PAGE。5.2.3.被支持的聚丙烯酰胺凝膠本發(fā)明的一個(gè)方面是適用于電泳中的被支持的凝膠，其中凝膠穩(wěn)固地結(jié)合于固體支持物上以便凝膠具有二維空間穩(wěn)定性，此支持物是堅(jiān)硬的并基本上不干擾結(jié)合或以其它方式聯(lián)結(jié)凝膠中的一個(gè)或多個(gè)生物分子的標(biāo)記的有關(guān)檢測(cè)。優(yōu)選地，支持物基本上不干擾熒光標(biāo)記的有關(guān)檢測(cè)；玻璃支持物適用于此目的，因?yàn)椴ＡР幌笏芰?，缺乏損害或阻礙熒光成像的光學(xué)活性。
由于凝膠與固體支持物間穩(wěn)固的結(jié)合，現(xiàn)在凝膠的一個(gè)或多個(gè)部分可以移開(kāi)(例如通過(guò)切除)而不伴有凝膠剩余部分的位置移動(dòng)，或只有最小限度的變形，因此在操作及保存期間保持了分離蛋白質(zhì)二維陣列的完整性；優(yōu)選地，凝膠共價(jià)結(jié)合于固體支持物上。在成像確定分離蛋白質(zhì)的x，y坐標(biāo)之后，一個(gè)或多個(gè)部分的包含所選蛋白質(zhì)的被支持的凝膠可以被移開(kāi)用于進(jìn)一步分析，而剩余的蛋白質(zhì)穩(wěn)定地保持于先前成像位置，如需要可隨后移開(kāi)。本發(fā)明被支持的凝膠代表了在促進(jìn)分離生物分子精確的、可重復(fù)的切除及分離的生物分子的分離方面的主要進(jìn)展。此外，被支持的凝膠可條形碼化以提供在原始樣品的特征性與分離的生物分子二維陣列之間不可分離的鏈接；這種鏈接可以使用本發(fā)明的LIMS來(lái)保持。
為制備被支持的凝膠，固體支持物可以被功能化，例如用雙功能鏈接物如γ-異丁烯?；趸籽趸柰?；然后將凝膠澆注在功能化的支持物上。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，支持物通常是平板(如通常的平板玻璃)；特別優(yōu)選的是平直薄板玻璃。如需要，可以在例如低溫(如在4℃、-20℃或-70℃)保存被支持的凝膠。保存的適當(dāng)方法在1997年7月9日提交的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/GB97/01846中描述，在此引入其全部以供參考。對(duì)于有些操作(例如凝膠一個(gè)或多個(gè)部分的切除)，外露的被支持的凝膠是優(yōu)選的；對(duì)其它的操作(例如電泳)，凝膠可任選地夾在凝膠穩(wěn)定結(jié)合的第一個(gè)固體支持物(例如用雙功能鏈接物處理的玻璃板)與凝膠不穩(wěn)定結(jié)合的第二個(gè)固體支持物(例如未處理的玻璃板或經(jīng)硅烷化劑處理的玻璃板)之間。5.2.4.分離蛋白質(zhì)的檢測(cè)二維陣列中的蛋白質(zhì)可用任何期望的技術(shù)檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，如本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的，聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)用適當(dāng)?shù)娜玖?例如考馬斯蘭或熒光染料)或通過(guò)適當(dāng)染色技術(shù)(例如銀染)標(biāo)記。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)通過(guò)將凝膠用染料浸漬來(lái)標(biāo)記，其中當(dāng)染料結(jié)合或接觸到蛋白質(zhì)時(shí)，其變?yōu)闊晒饣钚曰蚋淖兤錈晒馓匦?，從而避免了在成像之前清除未結(jié)合染料的需要；Sypro Red(Molecular Bioprobes，Inc.，Eugene，俄勒岡州)適用于此目的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)可以通過(guò)將凝膠用抗體、凝集素或其它適當(dāng)?shù)呐潴w浸漬來(lái)標(biāo)記，這些配體與報(bào)告部分例如放射性核素、酶，或結(jié)合生物素的品種聯(lián)結(jié)；清除未結(jié)合的抗體、凝集素或其它配體后，報(bào)告物可以用任何適當(dāng)?shù)募夹g(shù)檢測(cè)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)在分離之前被放射標(biāo)記，例如用任何適當(dāng)?shù)姆派湫院怂赝ㄟ^(guò)新陳代謝標(biāo)記(例如氚，一種硫的放射性核素或碳的放射性核素)或用任何適當(dāng)?shù)姆派湫院怂?例如放射性碘)通過(guò)化學(xué)或酶法標(biāo)記。在又一實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)被電轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)哪ど闲纬梢粋€(gè)二維陣列的復(fù)制品，將它用與報(bào)告部分聯(lián)結(jié)的抗體、凝集素或其它適當(dāng)配體探查；這種Western印跡技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。
標(biāo)記的蛋白質(zhì)用任何能夠檢測(cè)所用的報(bào)告物(例如通過(guò)光密度測(cè)定法或光譜法、或通過(guò)檢測(cè)熒光或放射活性)并產(chǎn)生計(jì)算機(jī)可讀輸出信號(hào)的檢測(cè)器成像。在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)器是激光熒光掃描儀，其中旋轉(zhuǎn)鏡面沿著第一軸沿著凝膠掃描激光束，而凝膠沿著與第一軸垂直的第二軸前進(jìn)。這種掃描儀中凝膠沿直線傳送，穿過(guò)連續(xù)的掃描激光，使凝膠能夠從箱中(例如染色箱)被自動(dòng)地加載于傳送機(jī)件，掃描并在掃描完成后自動(dòng)密封，從而提高凝膠的通過(guò)量并減少手工處理。優(yōu)選地，由凝膠發(fā)出的熒光進(jìn)入波導(dǎo)并傳送至光電檢測(cè)器例如光電倍增管。在一個(gè)實(shí)施方案中，激光束從旋轉(zhuǎn)鏡面沿著與凝膠平行的平面?zhèn)鞑ブ敝吝_(dá)到第二個(gè)弓形鏡面，其以直角反射激光到凝膠。由于弓形鏡面，激光束的路徑長(zhǎng)度保持恒定而凝膠被從一邊到另一邊掃描。恒定的路徑長(zhǎng)度促進(jìn)了相位敏感的檢測(cè)，其中激光束的振幅是循環(huán)調(diào)制的；由蛋白質(zhì)染料復(fù)合物(信號(hào))發(fā)出的熒光信號(hào)顯示了用于區(qū)分信號(hào)與背景熒光(干擾)的相位移，在背景熒光中沒(méi)有觀察到相位移(或較小的相位移)。這種激光熒光掃描儀在Basiji，1997，應(yīng)用內(nèi)部反射光學(xué)及相敏感檢測(cè)的高通量熒光掃描儀的進(jìn)展(博士論文，University of Washington，Seattle，WA)中描述，在此引入其全部以供參考。
需要提供一個(gè)或多個(gè)由成像裝置可檢測(cè)的參照點(diǎn)，用于確定在分離的蛋白質(zhì)的二維陣列中檢測(cè)的任何特征的x，y坐標(biāo)。參照點(diǎn)可以在凝膠共價(jià)結(jié)合于其上的支持物(如通常功能化的平板玻璃面)上提供。另外，參照點(diǎn)可以在成像時(shí)凝膠固定于其上的框架上提供；匹配的框架可在機(jī)器人分離裝置中提供。5.3.寡糖分析生物學(xué)樣品中的寡糖(聚糖)可以用本發(fā)明的方法和儀器，利用已建立的切割、標(biāo)記和分離寡糖技術(shù)鑒定并表征。見(jiàn)例如，Townsend和Hotchkiss(編)，1997，糖生物學(xué)技術(shù)(Techniques in Glycobiology)(Marcel Dekker，Inc.，New York)；Takahashi，1996，層析雜志(J.Chromatography)720217-225，在此引入各自的全部以供參考。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡糖由熒光標(biāo)記(如用鄰位取代的苯胺衍生物如2-氨基苯甲脒或2-鄰氨基苯甲酸)并通過(guò)二維聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。見(jiàn)Starr等人，1996，層析雜志720295-321；Bigge等人，1995，分析生物化學(xué)(Analyt.Biochem.)230229-238(在此引入各自全部以供參考)。例如，為了達(dá)到主要基于寡糖內(nèi)在荷質(zhì)比的分離，熒光標(biāo)記的寡糖在第一維中可以經(jīng)歷聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)(例如使用15％丙烯酰胺凝膠以及3(羥甲基)氨基甲烷(“Tris”)/N-3(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(“TAPS”)緩沖液，pH7.4)。然后，為了達(dá)到主要基于來(lái)自伴隨寡糖的硼酸陰離子非共價(jià)絡(luò)合物的誘導(dǎo)電荷的分離，寡糖的一維陣列在第二維中進(jìn)行PAGE，使用20％丙烯酰胺凝膠及20mM Tris/硼酸緩沖液，pH8.5。所得的二維陣列中的寡糖用熒光掃描儀成像以產(chǎn)生計(jì)算機(jī)可讀的信號(hào)輸出信號(hào)。5.4.檢測(cè)器輸出信號(hào)的計(jì)算機(jī)分析本發(fā)明方便地提供了檢測(cè)器輸出信號(hào)的計(jì)算機(jī)介導(dǎo)的分析。以舉例方式但不限于此，本發(fā)明的此方面在首先通過(guò)等電聚焦然后通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)的情況中討論；然而，在此描述的方法和儀器同樣地適用于分析來(lái)自分離的生物分子之任何二維陣列成像的輸出信號(hào)，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
為了傳遞輸出信號(hào)用于分析，檢測(cè)器有效地連結(jié)于計(jì)算機(jī)上。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“有效地連接”包括直接連接(例如通過(guò)傳導(dǎo)電纜、紅外線通信設(shè)備等等永久的或間斷的連接)或間接連接，籍此數(shù)據(jù)通過(guò)中間存儲(chǔ)設(shè)備傳輸(例如服務(wù)器或軟盤(pán))。檢測(cè)器的輸出信號(hào)應(yīng)該是能被計(jì)算機(jī)接受的格式，這是容易理解的。位圖格式(例如GIF格式)優(yōu)選地用于此目的。
一旦傳輸?shù)胶线m的編程的計(jì)算機(jī)，輸出信號(hào)就可以被處理以檢測(cè)參照點(diǎn)；過(guò)濾并去除人為因素；檢測(cè)并定量特征；并產(chǎn)生圖像文件。特征可以通過(guò)計(jì)算機(jī)介導(dǎo)的潛在的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)與背景的比較來(lái)檢測(cè)。例如，計(jì)算機(jī)程序可以選擇對(duì)應(yīng)于顯示超過(guò)設(shè)定閾值的染色或熒光的凝膠區(qū)域的信號(hào)。
此外，計(jì)算機(jī)可以用于編輯檢測(cè)的特征并對(duì)給定樣品(或任何數(shù)目的復(fù)制品)進(jìn)行匹配的復(fù)制品分析。輸出信號(hào)可以被評(píng)價(jià)和比較并去掉不合格的圖像文件，它們總體上異常或上樣低或全部圖像亮度太低，或分辨率太差，或復(fù)制品太不相似。如果復(fù)制品的一個(gè)圖像文件不合格，那么屬于該復(fù)制品的圖像文件無(wú)論其圖像質(zhì)量如何也是不合格的。一經(jīng)給人類(lèi)操作者顯示一個(gè)圖像文件，所有這些功能可以根據(jù)操作者確定的標(biāo)準(zhǔn)，交互式地或自動(dòng)地執(zhí)行。
參照物鑒定可用于校正凝膠泳動(dòng)中的任何可變性。這個(gè)過(guò)程包括在給定生物學(xué)樣品中已知的或期望發(fā)現(xiàn)的一種或多種參照物蛋白質(zhì)的鑒定，它們具有恒定的等電點(diǎn)以及電泳遷移率。這些參照物蛋白質(zhì)可以作為內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn)以校正任何可能的凝膠變化或變形?；蛘?，另外一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)可加到樣品中以作為外在的標(biāo)準(zhǔn)。被認(rèn)為是人為因素的特征可以從分析中濾出；這種人為因素可能主要發(fā)生在凝膠邊緣，并尤其在或接近樣品作用點(diǎn)及染料前沿。
如需要，兩個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)中的輸出信號(hào)可以經(jīng)校準(zhǔn)并結(jié)合形成全景圖像文件；例如，含有蛋白質(zhì)的樣品可以通過(guò)雙向電泳分離，在第一個(gè)試驗(yàn)中使用pH4.0到5.0梯度的等電聚焦，而在第二個(gè)試驗(yàn)中使用pH5.0到6.0梯度的等電聚焦。為了觀察或進(jìn)一步分析，現(xiàn)在計(jì)算機(jī)可以用于表示從這些試驗(yàn)中得到的為單一全景圖像的輸出信號(hào)。
復(fù)制品凝膠可通過(guò)參照物加以排列且進(jìn)行匹配。匹配過(guò)程可包括復(fù)制品凝膠上對(duì)應(yīng)特征的配對(duì)。因?yàn)榕鋵?duì)的特征顯示了分離的可重復(fù)性，這為隨后的準(zhǔn)確測(cè)量等電點(diǎn)及表觀分子量提供了進(jìn)一步的保證。處理的圖像文件可以顯示于屏幕上為肉眼觀察，可作為圖形表示打印出來(lái)并用于隨后的分析。
在一個(gè)實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)用于測(cè)量所有檢測(cè)蛋白質(zhì)(或根據(jù)操作者確定的標(biāo)準(zhǔn)交互式或自動(dòng)選擇的子集)的x，y坐標(biāo)。參考用于分離步驟中的實(shí)驗(yàn)參數(shù)、參照物蛋白質(zhì)或外在標(biāo)準(zhǔn)，將這些坐標(biāo)與特定的等電點(diǎn)及表觀分子量關(guān)聯(lián)。表示蛋白質(zhì)特征的信號(hào)的強(qiáng)度也被測(cè)量和存貯。
圖像處理的適當(dāng)程序在本領(lǐng)域中是眾所周知的。由BioRad實(shí)驗(yàn)室，Hercules，加利福尼亞發(fā)布的商業(yè)化程序(版本2.2，1997)，商品名為MELANIE適用于此目的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，MELANIE用來(lái)對(duì)檢測(cè)器輸出信號(hào)執(zhí)行下面的操作(a)為了把列與行坐標(biāo)轉(zhuǎn)化為等電點(diǎn)(pI)及分子量(MW)值，通過(guò)參考參照物的定義校正凝膠；(b)凝膠圖像中特征的檢測(cè)；(c)復(fù)制品凝膠間的特征配對(duì)；(d)為每個(gè)檢測(cè)的特征，計(jì)算其絕對(duì)特征強(qiáng)度(Vol.)、相對(duì)特征強(qiáng)度(％Vol.)、pI及MW；和(e)來(lái)自不同樣品的凝膠間的特征配對(duì)。因此從MELANIE輸出的信號(hào)可以包括特征報(bào)告、參照物報(bào)告和配對(duì)報(bào)告。5.5.分布圖的計(jì)算機(jī)產(chǎn)生及分析圖像處理程序(如MELANIE)的輸出信號(hào)可用計(jì)算機(jī)進(jìn)一步處理，產(chǎn)生適于比較分析的數(shù)字化分布圖。5.5.1分布圖的構(gòu)建現(xiàn)在可以對(duì)MELANIE處理的每個(gè)圖像文件構(gòu)建數(shù)字化分布圖。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，每個(gè)樣品于兩個(gè)或多個(gè)復(fù)制品(稱(chēng)為“同胞”) 中分析，其中之一被隨意地指定為同胞集合的“代表性的”凝膠。對(duì)每個(gè)鑒定的特征，數(shù)字化分布圖優(yōu)選地包括1)唯一的隨意鑒定代碼，2)x，y坐標(biāo)，3)等電點(diǎn)，4)分子量以及5)熒光強(qiáng)度。
對(duì)每個(gè)同胞凝膠集合來(lái)說(shuō)，來(lái)自同胞圖像的特征報(bào)告通過(guò)匹配特征之間的平均％Vol、pI及MW匯集成綜合的合成畫(huà)面。然后綜合的合成畫(huà)面由分配給取自同胞集合代表性凝膠的特征ID的平均特征參數(shù)組成。另外，％Vol的平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差通過(guò)下面的公式(用于復(fù)制凝膠)計(jì)算D＝100*SQRT(sqr(<V>-V1)+sqr(<V>-V2))/<V>
其中<V>＝(V1+V2)/2，而V1，V2是成對(duì)特征的％Vol值。
另外的信息，例如用于凝膠的蛋白質(zhì)的總量及凝膠的條形碼同樣可與綜合的合成畫(huà)面相結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，綜合的合成畫(huà)面包括一個(gè)MELANIE格式的特征報(bào)告，參考代表性凝膠并為代表性凝膠的條形碼提供線索。
可通過(guò)對(duì)用于產(chǎn)生圖像的實(shí)際儲(chǔ)存凝膠追蹤分布圖，由此構(gòu)建綜合合成畫(huà)面圖像，以致通過(guò)計(jì)算機(jī)分析分布圖可檢索到鑒定的蛋白質(zhì)。分布圖也可追溯到原始樣品或患者。通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)及參照物繼之以與主凝膠(master gel)相關(guān)斑點(diǎn)的匹配，帶有校正的凝膠系統(tǒng)的可重復(fù)性使在相同或不同時(shí)間用相同或不同樣品進(jìn)行電泳的多個(gè)凝膠的比較成為可能。而且，為了進(jìn)行對(duì)基于如年齡或臨床結(jié)果這樣的信息選擇的樣品橫斷面的計(jì)算機(jī)分析，在收集原始生物學(xué)樣品收集中匯合的數(shù)據(jù)(如在5.1節(jié)中描述)可以與凝膠數(shù)據(jù)再結(jié)合。
圖2表示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案闡明的計(jì)算機(jī)介導(dǎo)的分析的流程圖。5.5.2.樣品間的交叉匹配現(xiàn)在將來(lái)自不同樣品分析中產(chǎn)生的資料進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，每一有意義特征被分配一個(gè)索引(“分子簇索引”，“MCI”)，其識(shí)別特征的分子內(nèi)容并在所有凝膠的匹配特征中具有相同的值。對(duì)樣品的每種類(lèi)型來(lái)說(shuō)，建立唯一地定義了每一凝膠連續(xù)映射到其上的坐標(biāo)系統(tǒng)的“分子簇表”。這種方法消除了試圖匹配凝膠集合中每一凝膠與其它凝膠的N×N問(wèn)題。
為了產(chǎn)生分子簇表，隨意選擇代表性的凝膠作為主凝膠，優(yōu)選地被認(rèn)為對(duì)其樣品類(lèi)型是最佳的凝膠。對(duì)同胞集合的綜合的合成畫(huà)面的每個(gè)特征(分子簇)產(chǎn)生了分子簇表中的新條目，其中此代表性凝膠是該同胞集合的一員。當(dāng)另外的分子簇在其它的凝膠中被觀察到但在主凝膠中不具有代表性時(shí)，可加到表上。這樣的其它凝膠被認(rèn)為是“二級(jí)主凝膠”。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)pI/MW空間分層的象限樹(shù)(quadtree)分解，從特征的pI和MW計(jì)算MCI。首先，計(jì)算包含整個(gè)pI/MW空間的2D坐標(biāo)方格。作為例子但不限于此，pI可以取0到14的任意值，而MW可以取1000到1000000之間的任意值。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的行位置(代表其凝膠上的位移)與其分子量的對(duì)數(shù)是大約成比例的，就分子量的自然對(duì)數(shù)即ln(MW)計(jì)算坐標(biāo)方格的位置。2D pI/ln(MW)空間可被接連的水平及垂直對(duì)分分為連續(xù)的較小象限，每個(gè)象限包括比其母體較少的特征，直到分辨率達(dá)到在2D空間的每個(gè)單元中特征的數(shù)目不太可能大于1。
在詳細(xì)的實(shí)施方案中，生成9個(gè)連續(xù)的部分，所以全部的pI/ln(MW)空間被垂直和水平地分為512部分(RES＝512)?，F(xiàn)在從主坐標(biāo)系統(tǒng)中的pI和MW，通過(guò)下面的公式計(jì)算主凝膠中特征的MCIMCI＝((int)((ln(MWmax)-ln(MW))/dM)*8192+(int)(pI/dI))*8192/RES
其中l(wèi)n(MWmax)＝14；ln(MWmin)＝7；dM＝(ln(MWmax)-ln(MWmin))/RES＝0.013672；pImax＝14；pImin＝0；dI＝(pImax-pImin)/RES＝0.027344給定類(lèi)型的所有其它樣品的代表性凝膠現(xiàn)在可以與那種樣品類(lèi)型的主凝膠及次級(jí)主凝膠匹配(使用MELANIE)。然后對(duì)每一匹配的特征，通過(guò)加上主凝膠或次級(jí)主凝膠分布圖中特征的MCI注釋數(shù)字化分布圖。5.5.3.分布圖的差分分析一旦分布圖用MCI注釋?zhuān)涂蛇M(jìn)行計(jì)算機(jī)分析來(lái)選擇一個(gè)或多個(gè)代表目標(biāo)蛋白質(zhì)或其它生物分子的特征。優(yōu)選地，通過(guò)比較來(lái)自單個(gè)樣品的同胞凝膠復(fù)制品分析的綜合合成畫(huà)面分布圖進(jìn)行分析。
一個(gè)圖像集合是從數(shù)據(jù)庫(kù)中用戶(hù)可選擇的樣品列表中產(chǎn)生的。圖像集合的每個(gè)成員包含同胞集合的綜合合成畫(huà)面分布圖和用于匹配特征的主分子簇表。
然后定義特征集合，表示已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的在圖像集合中的特征集合。一個(gè)任意的閾值水平X被指定給一個(gè)特征集合；如果它出現(xiàn)在(即其中具有相同的MCI)圖像集合至少X％的成員，那么給定特征被定義為該集合的一部分。對(duì)特征集合的每一成員來(lái)說(shuō)，定義了下列的特性(1)MCI，(2)％Vol均值(特征出現(xiàn)的圖像集合中所有成員的平均％Vol)，(3)％Vol中值，以及(4)特征被鑒定的集合中的圖像數(shù)目。
現(xiàn)在可以進(jìn)行二元集合的運(yùn)算以比較兩圖像集合(指的是“背景”和“前景”集合)之間的特征集合?；径\(yùn)算是在兩特征集合中匹配特征間折疊變化(fold-change)的計(jì)算。折疊變化(G)通過(guò)下面的算法確定使V1和V2分別為背景特征集合F1和前景特征集合F2中特征的％Vol均值，(其中缺失的特征用V＝0表示)，然后G＝V2/V1(當(dāng)V2＞V1)G＝V1/V2(當(dāng)V1＞V2)G＝+MAX_G(當(dāng)V1＝0)
G＝-MAX_G(當(dāng)V2＝0)，其中MAX_G是一些合適的大數(shù)目。
在折疊變化計(jì)算中，這個(gè)算法可任選地使用％Vol中值代替％Vol均值進(jìn)行。結(jié)果可以以棒圖或其它任何方便的格式報(bào)告。
作為一些樣品記錄變量的一個(gè)函數(shù)，可以進(jìn)行一系列的集合運(yùn)算以確定特征集合中每一特征表達(dá)中的變動(dòng)。例如這種比較可以用于(a)在一樣品供體集合中表達(dá)變化的時(shí)間序列研究；(b)對(duì)患有不同疾病的個(gè)體集合的表達(dá)變化比較；或(c)對(duì)進(jìn)行不同治療個(gè)體集合的表達(dá)變化比較。一系列的集合運(yùn)算產(chǎn)生一個(gè)結(jié)果的矩陣，其中的行計(jì)數(shù)了特征集合的個(gè)體成員，列計(jì)數(shù)了矩陣中不同的圖像集合并且矩陣中的單元包含從上文描述的每一圖像集合中每一特征的％Vol均值中計(jì)算的數(shù)目。
例如，為了比較一個(gè)關(guān)于三個(gè)圖像集合(稱(chēng)為S1、S2和S3)的特征(稱(chēng)為MCI(F))，對(duì)每個(gè)樣品V1、V2和V3的MCI(F)的％Vol是作為相應(yīng)圖像集合中MCI(F)的％Vol均值計(jì)算的。其次，均值、中值和最大值V1、V2和V3是跨行計(jì)算的。而一個(gè)樣品集合不包括MCI(F)，相應(yīng)的％Vol取為零。使用者選擇一個(gè)參照列，Vref，它可以是任何一個(gè)圖像集合或均值或中值。然后每個(gè)單元如下計(jì)算P1＝(V1-Vref)/VmaxP2＝(V2-Vref)/VmaxP3＝(V3-Vref)/Vmax這些數(shù)值全部在-1.0到+1.0范圍內(nèi)。這個(gè)范圍可以分為期望的的亞區(qū)間數(shù)目(例如七個(gè)相等的亞區(qū)間)，結(jié)果以圖形顯示并且用每個(gè)亞區(qū)間的符號(hào)代表的單元中的數(shù)值。
計(jì)算機(jī)介導(dǎo)的根據(jù)操作者指定標(biāo)準(zhǔn)的比較促進(jìn)了大量分布圖快速有效的分析，并允許被比較的分布圖間較小差異的鑒定，即使每個(gè)分布圖可代表成百上千個(gè)檢測(cè)的生物分子。大量樣品集合的快速有效的處理能力提高了檢測(cè)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異的可能性。
同樣應(yīng)該理解，本發(fā)明的操作者可以將新產(chǎn)生的每一分布圖加到連續(xù)增長(zhǎng)的數(shù)據(jù)庫(kù)中，允許交叉試驗(yàn)比較，或者以原始研究者未想象到的組合進(jìn)行比較。分布圖數(shù)據(jù)庫(kù)可以允許進(jìn)行虛擬試驗(yàn)，其中來(lái)自任何研究的分布圖可以與來(lái)自任何其它研究的分布圖比較，而不必重新產(chǎn)生實(shí)際的臨床資料。例如，提供蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)的任何數(shù)據(jù)庫(kù)可以與本發(fā)明的來(lái)自蛋白質(zhì)分析的分布圖比較。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這種分析可采取多種形式，并且隨后的實(shí)施例通過(guò)舉例而非限制方式提供。
可比較患病以及正常個(gè)體的分布圖以鑒定兩人群間一貫不同的斑點(diǎn)模式。這些斑點(diǎn)可以包括有治療或診斷意義的蛋白質(zhì)。
可比較來(lái)自單個(gè)個(gè)體的患病和正常組織的分布圖以鑒定在患病與正常組織間一貫不同的斑點(diǎn)模式。這些斑點(diǎn)可以包括用于治療或診斷目的的感興趣的生物分子。因?yàn)楸容^是在取自單個(gè)個(gè)體的樣品之間進(jìn)行的，這對(duì)不同個(gè)體間變化的控制具有特殊優(yōu)勢(shì)。
可比較治療以及未治療個(gè)體的分布圖以鑒定與某些治療或藥物處理相關(guān)的斑點(diǎn)模式。這在研究抗藥性或藥物開(kāi)發(fā)中對(duì)闡明藥物的機(jī)理是有幫助的。
健康、患病和已治療的患病個(gè)體的三方比較可以鑒定哪種藥物能夠?qū)⒒疾〉姆植紙D恢復(fù)到更接近類(lèi)似正常的分布圖。無(wú)論在臨床試驗(yàn)還是在常規(guī)治療中這種方法均可用于篩選藥物、監(jiān)測(cè)治療效果及檢測(cè)或預(yù)測(cè)副作用的發(fā)生，并可用于鑒定哪些斑點(diǎn)對(duì)疾病的顯示及治療更重要。
未治療、用藥物A治療或用藥物B治療的患病個(gè)體的三方比較也可以鑒定感興趣的生物分子。例如，如果已知A是有效的而B(niǎo)是無(wú)效的，那么在治療組A(一方面)與未治療組及與治療組B(另一方面)之間不同的生物分子對(duì)預(yù)后有用，并且是用于治療目標(biāo)研究的任選物。
5.6.被支持凝膠的選擇部分的移出一旦被分離，生物學(xué)分子被約束于穩(wěn)定的陣列中，這是本發(fā)明的被支持的凝膠的一個(gè)特征。現(xiàn)在可以移出一部分包含單一被檢測(cè)特征的凝膠而不影響陣列中剩余部分的空間完整性。以舉例方式，通過(guò)切除部分凝膠、通過(guò)局部應(yīng)用液化凝膠的試劑以使期望的物質(zhì)可以通過(guò)吸出或溢出被轉(zhuǎn)移、或通過(guò)局部應(yīng)用電洗脫裝置可以完成轉(zhuǎn)移?；诜植紙D，包含需要分析物質(zhì)的部分凝膠的移出能夠準(zhǔn)確及重復(fù)地實(shí)施；這些部分可以從已經(jīng)成像的凝膠中或從復(fù)制品或其它成像凝膠的復(fù)制物中移出。很容易理解，這很適于計(jì)算機(jī)控制的分析及選擇。
優(yōu)選地，使用本發(fā)明的儀器切除選擇的凝膠部分。因此，提供了軟件控制的機(jī)器人裝置，它使用在生物分子分離之后獲得的生物學(xué)分子分布圖作參照。這種裝置可以有效地與計(jì)算機(jī)連接并通過(guò)機(jī)器可讀的指令驅(qū)動(dòng)，根據(jù)指令以不依賴(lài)操作者的方式在凝膠上進(jìn)行切除及操作，這些指令是通過(guò)計(jì)算機(jī)介導(dǎo)的對(duì)來(lái)自多種生物分子混合物分析的多種分布圖的分析產(chǎn)生的。計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)x，y運(yùn)動(dòng)并指引機(jī)器人裝置的切割頭采取單一切割或一系列重疊切割以分離并移走鑒定的特征。
這種裝置可以包括(1)與在成像中凝膠放于其中的框架相同或匹配的規(guī)定的一個(gè)框架。(2)一個(gè)用于控制帶有凝膠框架的位置的底板。(3)一個(gè)帶有附著到可變操作的驅(qū)動(dòng)的可移動(dòng)的x，y坐標(biāo)定位機(jī)械裝置，和用于定位操作者規(guī)定的感興趣的定位凝膠區(qū)域的由軟件指導(dǎo)的切除部件，并且能夠執(zhí)行要求的操作，輸運(yùn)凝膠或凝膠衍生物到接受盒中規(guī)定位置。這種裝置的一個(gè)實(shí)施方案在圖3中闡明。
這種設(shè)備能夠從背面為玻璃的凝膠中轉(zhuǎn)移凝膠片段并將轉(zhuǎn)移的凝膠片段轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)娜萜髦?。單?dú)的反應(yīng)管(例如Eppendorf管)可用于每一凝膠片段；更優(yōu)選地，凝膠片段轉(zhuǎn)移到試管架或盒子中的多容量容器例如96孔收集微量培養(yǎng)板上。將要操作的背面為玻璃的凝膠安裝在設(shè)備底板上的導(dǎo)軌上，因此用切割裝置對(duì)正玻璃和凝膠。根據(jù)機(jī)器可讀的指令，這個(gè)設(shè)備移出一個(gè)或多個(gè)選擇的凝膠部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)每個(gè)特征和用于打斷凝膠與玻璃的連接并移出凝膠片段的核心切割、剪切和抽吸的過(guò)程，均選擇新的尖頭。優(yōu)選地，剪切過(guò)程包括尖頭沿著第一軸從一邊到另一邊運(yùn)動(dòng)，接著尖頭以與第一軸成一定角度(最優(yōu)選地直角)沿著第二軸從一邊到另一邊運(yùn)動(dòng)。每一凝膠片段被轉(zhuǎn)移到收集板上并排出，優(yōu)選地投到液體中以幫助凝膠片段從尖頭移出。為了預(yù)防凝膠片段在切割過(guò)程中被抽吸進(jìn)真空泵并在排出過(guò)程將凝膠片段推出尖頭的雙重目的，優(yōu)選地在尖頭中包含一個(gè)可移動(dòng)的梭形閥。為了在不同特征之間將遺留減到最小，切割工具可以在整體的自動(dòng)清潔站中清潔。更優(yōu)選地，切割工具是可更換的，所以對(duì)每一特征使用一種新的切割工具，因此防止任何遺留。
大的特征通過(guò)制作多種相鄰或重疊切割被切除，相同特征的所有的部分在收集平板的同一孔中沉淀，或不同的特征部分在不同的孔中沉淀。另外，沿著大特征的周邊界切割分布圖；然后當(dāng)在凝膠下面進(jìn)行切割時(shí)，凝膠被提起以從支持物上分離，所有的特征被轉(zhuǎn)移到收集容器中。已經(jīng)設(shè)置這個(gè)系統(tǒng)以允許多個(gè)凝膠被切割進(jìn)一個(gè)收集板，并且同樣允許一個(gè)凝膠被切割進(jìn)任何數(shù)目的采集板中，因此允許所有特征被進(jìn)一步處理。一旦收集板充滿(mǎn)或完成，即可進(jìn)一步處理或保存。在選擇的凝膠片段已經(jīng)切除后，凝膠的剩余部分可以保存，例如在如上文描述的低溫條件下。5.7.處理凝膠轉(zhuǎn)移的部分凝膠的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)移部分被傳送至工作站，例如一個(gè)普通的模塊化化學(xué)單元，其完全可編程并設(shè)置用于蛋白質(zhì)水解。這個(gè)工作站允許任何規(guī)程的操作，包括試劑增加、用滴管吸取并轉(zhuǎn)移、孵育、混合、冷卻、真空干燥和固相提取技術(shù)、或模塊能夠開(kāi)發(fā)的任何其它技術(shù)。板被安裝到托架上，通過(guò)一個(gè)集成的托架操作器托架重新安裝在設(shè)備的底板上。這些板可以為任意形式，優(yōu)選地為一種孔的正交陣列，更優(yōu)選地采取9mm間距微量培養(yǎng)板形式。特別優(yōu)選地為在每孔的底部帶有允許液體流過(guò)的管口的微量培養(yǎng)板，如由英國(guó)，Shepperton的Porvair有限公司制造的板。在這樣的微量培養(yǎng)板中，液體和凝膠片段通過(guò)聚四氟乙烯板保留，依靠移液管組件以從上面施加的空氣壓力通過(guò)板提取液體。在提取過(guò)程中液體可以作為廢物扔掉或在肽洗脫過(guò)程中收集于位于管口下面的第二塊板中。
一種根據(jù)本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)可以如下面所述進(jìn)行分析，或用于產(chǎn)生針對(duì)分離蛋白質(zhì)的多克隆或單克隆抗體向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物如小鼠、大鼠或兔施用。這種抗體在診斷及預(yù)后試驗(yàn)中有用，并用于大量蛋白質(zhì)的純化，例如通過(guò)抗體親和層析。
5.8.蛋白質(zhì)分析工作站可以被設(shè)計(jì)用于化學(xué)法蛋白質(zhì)水解，或用于單獨(dú)或結(jié)合使用一種或多種適當(dāng)?shù)拿?例如胰蛋白酶或糜蛋白酶)的酶法蛋白質(zhì)水解。見(jiàn)如Shevchenko等人，1996，分析化學(xué)68850-858和Houthaeve等人，1995，F(xiàn)EBS Letters 37691-94(在此引用每篇的全部以供參考)。如需要，電洗脫可任選地用于從凝膠薄片中提取蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，工作站被編程，以使移出的凝膠片段中的蛋白質(zhì)被切割，產(chǎn)生適于進(jìn)一步表征的肽庫(kù)。因此，工作站接收在適當(dāng)托架中切割的凝膠塊的樣品，并且將這些凝膠塊經(jīng)歷洗滌、還原、烷化、洗滌以及胰蛋白酶水解步驟。所得的肽被提取到第二塊板中用于進(jìn)一步清洗或在分析之前額外制備。見(jiàn)例如Shevchenko，出處同前。孵育可以在高達(dá)100℃及以上的任意溫度進(jìn)行；工作站包括一個(gè)密封結(jié)構(gòu)，以便在高溫或延長(zhǎng)期間進(jìn)行孵育時(shí)防止或最小化液體損失。設(shè)備被設(shè)計(jì)成可無(wú)人操作，理想地為整夜，并有全面的檢測(cè)、監(jiān)視及自檢機(jī)制，以確保編程的規(guī)程正確地執(zhí)行、報(bào)告任何錯(cuò)誤、并在預(yù)先規(guī)定的偶然事故發(fā)生時(shí)中斷操作。多個(gè)平板可以并行處理，并且如需要可以根據(jù)不同的規(guī)程進(jìn)行處理。工作站也能進(jìn)行肽的提純以及其他處理例如肼解和標(biāo)記。
5.8.1.氨基酸序列的確定現(xiàn)在可以確定來(lái)自轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)肽之氨基酸序列，例如通過(guò)適當(dāng)?shù)馁|(zhì)譜技術(shù)，例如矩陣輔助的與飛行時(shí)間質(zhì)量分析(MALDI-TOF MS)或電噴離子化質(zhì)譜(ESI MS)結(jié)合的激光解吸附作用/離子化。見(jiàn)Jensen等人，1997，通過(guò)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)分析，Creighton編，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，實(shí)用方法(牛津大學(xué)出版社)，牛津，29-57頁(yè)；Patterson和Aebersold，1995，電泳161791-1841；Figeys等人，1996，分析化學(xué)(Analyt.Chem.)681822-1828(在此引入每篇的全部以供參考)。優(yōu)選地，一種分離技術(shù)例如HPIC或毛細(xì)管電泳被直接或間接地與質(zhì)譜儀結(jié)合。見(jiàn)Ducret等人，1996，電泳17866-876；Gevaert等人，1996，電泳，17918-924；Clauser等人，1995，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)925072-5076(在此引入每篇的全部以供參考)。特別優(yōu)選地是在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)08/877,605中描述的從頭測(cè)序技術(shù)(在此引入其全部以供參考)。在從頭測(cè)序中，肽的分子量通過(guò)適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，優(yōu)選地用質(zhì)譜儀被精確測(cè)定。考慮到形成肽鍵時(shí)的水丟失、質(zhì)子化、改變測(cè)量的氨基酸質(zhì)量的其它因素以及制約氨基酸的容許組合的實(shí)驗(yàn)因素，用計(jì)算機(jī)確定加入到測(cè)量的肽的分子量的氨基酸的所有可能的組合。然后計(jì)算機(jī)構(gòu)建在許可組合中氨基酸所有線性組合的容許文庫(kù)。然后對(duì)組合的容許文庫(kù)中每一成員計(jì)算理論上的片段質(zhì)譜，并與未知肽的通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定獲得的實(shí)驗(yàn)片段質(zhì)譜比較，以確定未知肽的氨基酸序列。最優(yōu)選地，使用串聯(lián)的質(zhì)譜儀以測(cè)定未知肽的氨基酸序列。
一旦分離的蛋白質(zhì)之全部或部分氨基酸序列已經(jīng)用實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定，可用計(jì)算機(jī)在可得到的數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋匹配的氨基酸序列或核苷酸序列，包括表達(dá)的序列標(biāo)記(EST)，其預(yù)測(cè)的氨基酸序列與實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定的氨基酸序列匹配。如果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)匹配的核苷酸序列，通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)熟知的技術(shù)反向構(gòu)建編碼實(shí)驗(yàn)測(cè)定的氨基酸序列的一組簡(jiǎn)并性核苷酸序列；這樣的一組簡(jiǎn)并性核苷酸序列可用于克隆編碼經(jīng)分離的蛋白質(zhì)的基因及用于表達(dá)測(cè)序的蛋白質(zhì)或肽片段的。另外，僅使用蛋白質(zhì)從其所獲得的物種中偏好的密碼子(例如在人類(lèi)中偏好的密碼子，其中蛋白質(zhì)為人類(lèi)蛋白質(zhì))，可以反向構(gòu)建簡(jiǎn)并性的核苷酸序列組的亞組；如需要，這個(gè)亞組可被限定為相關(guān)物種中最高度優(yōu)選的一個(gè)核苷酸序列。
一旦編碼分離蛋白質(zhì)的基因在公共或私人數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定，這個(gè)基因就可以克隆并轉(zhuǎn)入細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中。如果這種基因在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有被鑒定，那么可以使用簡(jiǎn)并性組探針克隆這個(gè)基因，這個(gè)探針編碼通過(guò)本發(fā)明的方法和儀器確定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。如果數(shù)據(jù)庫(kù)包含一個(gè)或多個(gè)編碼實(shí)驗(yàn)上確定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列之部分核苷酸序列，那么這樣的部分核苷酸序列(或其互補(bǔ)序列)可用作克隆基因的探針，從而避免了使用簡(jiǎn)并性組的需要。
表達(dá)這種重組蛋白質(zhì)的經(jīng)基因工程構(gòu)建的細(xì)胞可以在篩選程序中使用，從而鑒定與重組蛋白質(zhì)有特定相互作用的其它的蛋白質(zhì)或藥物，或生產(chǎn)大量的重組蛋白質(zhì)，用于如治療施用。擁有克隆的基因?qū)崿F(xiàn)了以替代或補(bǔ)充與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)缺失或減少的基因治療。擁有克隆的基因同樣實(shí)現(xiàn)了以抑制其存在或其增強(qiáng)表達(dá)與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)反義或三螺旋治療。5.8.2.翻譯后加工的分析許多蛋白質(zhì)用化學(xué)基團(tuán)而不是用氨基酸進(jìn)行翻譯后修飾，例如磷酸基團(tuán)及寡糖。這些基團(tuán)在蛋白質(zhì)中的存在、定位及化學(xué)特性可以通過(guò)使用本發(fā)明的儀器及方法獲得的蛋白質(zhì)特異性多肽之片段來(lái)分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，從凝膠片段中分離的蛋白質(zhì)中獲得的肽庫(kù)被分開(kāi)。如上面5.8.1.節(jié)中所描述，一部分用于蛋白質(zhì)的鑒定。其余一部分或多部分通過(guò)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法用于鑒定個(gè)體的翻譯后修飾。例如，磷酸化分析在Carr等人，1996，分析生物化學(xué)(Analyt.Biochem.)239180-192以及Townsend等人，1996，蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Science)51865-1873中有描述(在此引入每篇的全部以供參考)。聚糖分析在Dwek等人，1993，分析生物化學(xué)，6265-100中(在此引入其全部以供參考)以及上面5.3.節(jié)中的參考文獻(xiàn)中描述。
6.實(shí)施例來(lái)自風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清和滑液的蛋白質(zhì)風(fēng)溫性關(guān)節(jié)炎(RA)患者血清和滑液中的蛋白質(zhì)通過(guò)等電聚焦隨后SDS-PAGE被分離并比較。6.1.等電聚焦對(duì)于等電聚焦(IEF)，將每一樣品用于ImmobilineDryStrip試劑盒(Pharmacia Biotech)，隨后的步驟在制造商說(shuō)明書(shū)中描述，見(jiàn)ImmobilineDryStrip試劑盒說(shuō)明書(shū)，Pharmacia，#18-1038-63，AB版(在此引入其全部以供參考)，帶有可選擇的修飾，被Sanchez等人，1997，電泳18324-327描述(在此引入其全部以供參考)。
在某些事例中，為了增加在特定pH范圍內(nèi)的分辨率或加載大量目標(biāo)蛋白質(zhì)到凝膠上，根據(jù)Westermeier，1993，電泳實(shí)踐(Electrophorsis inPractice)，(VCH，Weinheim，德國(guó))，197-209頁(yè)(在此引入其全部作為參考)中所描述，使用了pH范圍為2pH單位或更小的窄范圍的“放大凝膠”(zoom gel)。6.2.凝膠平衡和SDS-PAGE如Sanchez等人，同上所描述，通過(guò)在SDS緩沖系統(tǒng)中平衡，制備用于SDS-PAGE的IEF凝膠，平衡根據(jù)一個(gè)兩步程序進(jìn)行，包括最初二硫鍵的還原，隨后烷化游離巰基團(tuán)。其后，根據(jù)Hochstrasser等人，1988，分析生物化學(xué)173412-423(在此引入其全部以供參考)的描述，如下面詳細(xì)說(shuō)明修改，進(jìn)行SDS-PAGE。6.3.被支持的凝膠的制備通過(guò)在凝膠附著的玻璃板上(“底板”)使用0.4％Y-異丁烯?；?氧基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液，SDS-PAGE凝膠共價(jià)粘附到玻璃支持物上。通過(guò)用水沖洗將過(guò)剩的試劑清除，并使底板干燥。在此階段，既作為凝膠的標(biāo)識(shí)，又作為鑒定平板涂層面的標(biāo)記，粘性的條形碼被粘到底板不會(huì)接觸凝膠基質(zhì)的位置。
用RepelSilane(pharmacia Biotech)處理相對(duì)的玻璃板(“頂板”)以最小化凝膠的粘附。應(yīng)用了試劑之后，通過(guò)將熱空氣流(如從熱空氣槍中)作用于板的表面加熱頂板。過(guò)量的試劑再次用水沖洗清除并使頂板干燥。
干燥的平板被裝配進(jìn)帶有13個(gè)凝膠夾層的澆注箱中。一些澆注箱可以平行地裝配以在相同的條件下澆注更多的凝膠。每個(gè)夾層的頂板和底板用1mm厚的隔板隔開(kāi)。夾層用醋酸層間隔以促進(jìn)在凝膠聚合后夾層的分離。然后根據(jù)Hochstrasser等人，出處同前進(jìn)行澆注。6.4.SDS-PAGE來(lái)自IEF步驟的凝膠條加于澆注的SDS-PAGE凝膠上部并開(kāi)始電泳。為了確保電泳進(jìn)行中凝膠平均冷卻，基本上如Amess等人，1995，電泳，161255-1267(再次引入其全部以供參考)所描述，設(shè)計(jì)了一個(gè)系統(tǒng)。甚至還需要更有效的冷卻，以便在凝膠電泳過(guò)程中最小化溫度的波動(dòng)并因此保持蛋白質(zhì)遷移的一致性。進(jìn)行電泳直到示蹤染料達(dá)到凝膠的底邊。然后將凝膠立即轉(zhuǎn)移進(jìn)行染色。6.5.染色小心移去凝膠盒子的頂板，剩下結(jié)合到底板的凝膠。然后將帶有結(jié)合凝膠的底板放進(jìn)能容納12片凝膠的染色設(shè)備中。凝膠完全浸入固定液中過(guò)夜，固定液包括40％(v/v)乙醇，10％(v/v)乙酸，50％(v/v)水。然后將固定液從箱中排出，并且將凝膠浸入7.5％(v/v)乙酸，0.05％(w/v)SDS中引發(fā)30分鐘。然后將引發(fā)液排出，將凝膠完全浸入染色液染色4小時(shí)。熒光染色儲(chǔ)存液根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，通過(guò)稀釋SyproRed(Molecular Bioprobes，Inc.，Eugene，俄勒岡州(Oregon))制備。稀釋的溶液通過(guò)0.4μm濾器真空過(guò)濾。
為了達(dá)到不同溶液連續(xù)地、甚至循環(huán)地經(jīng)過(guò)所有12片凝膠，溶液通過(guò)分配桿被引入箱中，沿著箱的底部擴(kuò)散跨過(guò)其全部寬度并提供使溶液均勻地流過(guò)每一凝膠的洞。6.6.凝膠成像根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，(見(jiàn)Storm使用指南，1995，版本4.0，號(hào)碼149-355，在此引入其全部以供參考)，如下文所述修改，通過(guò)使用Storm掃描儀(Molecular Dynamics，Sunnyvale，加利福尼亞)對(duì)熒光染色的凝膠成像生成計(jì)算機(jī)可讀的輸出信號(hào)。因?yàn)槟z堅(jiān)固地結(jié)合到玻璃板上，在成像過(guò)程中凝膠保持與掃描儀的接觸。為了避免由于凝膠與掃描儀工作臺(tái)不一致的接觸產(chǎn)生的干涉圖案，在凝膠下面導(dǎo)入水膜，小心避免氣泡。而且，將凝膠放于帶有兩個(gè)與凝膠共同成像的熒光按鈕的框架中，提供用于確定凝膠中檢測(cè)的其它特征的x，y坐標(biāo)的參照點(diǎn)(命名為M1和M2)。為了保持準(zhǔn)確的凝膠定位，在機(jī)器人凝膠切除器上提供了匹配的框架。在成像之后，凝膠密封于包含少量染色溶液的聚乙烯袋中，然后保存于4℃。
來(lái)自?huà)呙鑳x的輸出信號(hào)首先使用MELANIE處理以自動(dòng)檢測(cè)記錄的點(diǎn)，M1和M2；自動(dòng)修剪圖像(即除去源自凝膠邊界，如參考框架之外區(qū)域的掃描的圖像的信號(hào))；濾出由于灰塵的人為因素；檢測(cè)并定量特征；以及產(chǎn)生GIF格式的圖像文件。通過(guò)計(jì)算機(jī)介導(dǎo)的與背景比較潛在的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)以選擇與超過(guò)代表背景染色給定閾值的信號(hào)相關(guān)的凝膠區(qū)域進(jìn)行特征檢測(cè)。
使用第二個(gè)程序?qū)z測(cè)的特征進(jìn)行交互式編輯并對(duì)每一樣品匹配復(fù)制品凝膠。首先，要估計(jì)圖像以丟棄總體上不正常的或上樣量太低或全部圖像亮度太低，或分辨率太差，或復(fù)制品太不相似的圖像。如果一個(gè)復(fù)制品的圖像被丟棄，那么屬于這個(gè)復(fù)制品的其它圖像無(wú)論圖像的質(zhì)量如何也被丟棄。安排時(shí)間對(duì)丟棄的樣品進(jìn)行重復(fù)分析。
參照物的鑒定用于校正凝膠電泳中的任何變動(dòng)。這個(gè)方法包括鑒定期望在任何給定的生物學(xué)樣品中發(fā)現(xiàn)的某些蛋白質(zhì)。因?yàn)檫@些普通蛋白質(zhì)在不同的樣品中表現(xiàn)一致的等電點(diǎn)和分子量，它們可以用作校正任何可能的凝膠變異或變形的標(biāo)準(zhǔn)。在參照凝膠中參照物的pI和分子量值通過(guò)樣品與大腸桿菌蛋白質(zhì)共同電泳來(lái)確定，大腸桿菌蛋白質(zhì)先前已經(jīng)用人類(lèi)血清中的已知蛋白質(zhì)標(biāo)定。認(rèn)為是人為因素的特征(主要地在凝膠圖像的邊緣，特別是由于樣品上樣點(diǎn)及染料前沿的那些)被清除掉。然后復(fù)制的凝膠通過(guò)參照物排列，進(jìn)行匹配使得在復(fù)制的凝膠上有成對(duì)的一致斑點(diǎn)。因?yàn)槌蓪?duì)的斑點(diǎn)顯示了分離的可重復(fù)性，這為后來(lái)測(cè)定等電點(diǎn)及分子量是準(zhǔn)確的提供了更多保證。校正的凝膠，除了用于隨后的分析，也被打印出來(lái)進(jìn)行肉眼檢察。
圖像的產(chǎn)生繼之以計(jì)算機(jī)測(cè)量每一蛋白質(zhì)的x，y坐標(biāo)，它通過(guò)參考已知的參照物蛋白質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)與特定等電點(diǎn)和分子量相關(guān)聯(lián)。測(cè)量每一蛋白質(zhì)斑點(diǎn)強(qiáng)度并保存。每一蛋白質(zhì)斑點(diǎn)被分配一個(gè)識(shí)別代碼并與主凝膠(即在每型樣品中可見(jiàn)的包含的多數(shù)或全部蛋白質(zhì)斑點(diǎn)并且用作與其它樣品的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)匹配的模板的參考凝膠)上的一個(gè)斑點(diǎn)匹配。這一步驟允許橫跨許多不同凝膠的假設(shè)的相關(guān)斑點(diǎn)的鑒定。在原始生物學(xué)樣品的收集中收集的資料，如在5.1.節(jié)中所描述，與凝膠數(shù)據(jù)再結(jié)合，籍此實(shí)現(xiàn)了基于如年齡或臨床結(jié)果等信息的樣品之計(jì)算機(jī)選擇的橫斷面分析。
此方面分析的最終結(jié)果是數(shù)字化分布圖的生成，對(duì)每一鑒定的斑點(diǎn)，它包含1)唯一的隨機(jī)識(shí)別代碼，2)x，y坐標(biāo)，3)等電點(diǎn)，4)分子量，5)信號(hào)值，6)每一前述方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差，以及7)主凝膠上斑點(diǎn)的與其匹配的指向MCI的指針。依靠LIMS，對(duì)分布圖其所產(chǎn)生于的實(shí)際保存的凝膠是可追蹤的，所以，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析凝膠分布圖數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定的蛋白質(zhì)可以被檢索到。LIMS也可使分布圖被追溯到原始樣品或患者。6.7.凝膠的數(shù)字分析一旦生成分布圖，就針對(duì)于有興趣蛋白質(zhì)的選擇進(jìn)行分析。
來(lái)自成對(duì)血清和關(guān)節(jié)滑液樣品的個(gè)體圖像之蛋白質(zhì)特征被電子化比較。與在2-D分離中位置的特征性一樣，整個(gè)圖像集合的任一特征的分子特征性在此分析中被闡述。在個(gè)體圖像中個(gè)體特征豐度的定量測(cè)定是基于測(cè)定該圖像中特征的標(biāo)準(zhǔn)化熒光強(qiáng)度。在多個(gè)血清及關(guān)節(jié)滑液樣品集合之間豐度不同的那些蛋白質(zhì)通過(guò)在所有相關(guān)圖像中所有檢測(cè)特征的電子比較被揭示。6.8.選擇的蛋白質(zhì)的回收和分析差異地表達(dá)的蛋白質(zhì)被機(jī)器人切除并處理，產(chǎn)生胰蛋白酶肽；通過(guò)質(zhì)譜分析，使用從頭測(cè)序，確定這些肽的部分氨基酸序列。6.9.結(jié)果這些最初實(shí)驗(yàn)鑒定的12種蛋白質(zhì)在人類(lèi)RA關(guān)節(jié)滑液中水平高于匹配的血清樣品，而在人類(lèi)RA關(guān)節(jié)滑液中9種蛋白質(zhì)比匹配的血清樣品中存在的水平要低。對(duì)每一種差異地表達(dá)的蛋白質(zhì)，確定了部分氨基酸序列。公共數(shù)據(jù)庫(kù)的計(jì)算機(jī)分析揭示了這些部分測(cè)序蛋白質(zhì)中的16種在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，而5種在檢查的所有公共數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有描述。
權(quán)利要求
1.一種用于選擇和指導(dǎo)在經(jīng)如下方法制備的二維陣列中存在的一種或多種生物分子分離的計(jì)算機(jī)輔助方法，其中所述二維陣列的制備方法包括第一個(gè)分離步驟，其中多種生物分子根據(jù)第一種物理或化學(xué)特性被分離以形成生物分子的一維陣列；和第二個(gè)分離步驟，其中根據(jù)第二種物理或化學(xué)特性分離所述生物分子的一維陣列以形成所述二維陣列；所述計(jì)算機(jī)輔助方法包括對(duì)所述二維陣列或其復(fù)制品成像生成計(jì)算機(jī)可讀的輸出信號(hào)包括，對(duì)于所述二維陣列中檢測(cè)的多種生物分子的每一個(gè)而言，一對(duì)x，y坐標(biāo)和一個(gè)信號(hào)值；在至少一臺(tái)計(jì)算機(jī)中處理所述的輸出信號(hào)，以根據(jù)先前規(guī)定的或操作者制定的標(biāo)準(zhǔn)選擇一種或多種所述檢測(cè)的生物分子；并且生成機(jī)器可讀的指令，其指導(dǎo)機(jī)器人裝置從所述二維陣列中分離至少一種所選的生物分子；且根據(jù)所述機(jī)器可讀的指令由該機(jī)器人裝置從所述二維陣列中分離至少一種所選的生物分子。
2.權(quán)利要求
1的方法，其中通過(guò)第一種裝置對(duì)二維陣列成像，而與之物理上分離的第二種機(jī)器人裝置分離所選的生物分子。
3.權(quán)利要求
1的方法，其中計(jì)算機(jī)可讀的輸出信號(hào)包括，對(duì)于所述二維陣列中存在的多種生物分子的每一個(gè)而言，一對(duì)x，y坐標(biāo)，和指導(dǎo)機(jī)器人裝置x和y運(yùn)動(dòng)的機(jī)器可讀的指令。
4.權(quán)利要求
1的方法，其中二維陣列成像用熒光掃描儀進(jìn)行。
5.權(quán)利要求
1的方法，其中產(chǎn)生了指導(dǎo)機(jī)器人裝置從二維陣列中分離一種以上所選生物分子的機(jī)器可讀指令。
6.權(quán)利要求
1的方法，其中多種生物分子來(lái)自生物學(xué)樣品。
7.權(quán)利要求
1的方法，其中由生物學(xué)樣品產(chǎn)生復(fù)制的陣列，且由凝膠成像產(chǎn)生的計(jì)算機(jī)可讀信號(hào)與之相匹配。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所述生物分子為寡糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所述生物分子為蛋白質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9的方法，其中所述蛋白質(zhì)為糖蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所述二維陣列包含于凝膠中。
12.根據(jù)權(quán)利要求
11的方法，其中所述二維陣列包含于聚丙烯酰胺凝膠中。
13.根據(jù)權(quán)利要求
12的方法，其中所述二維陣列通過(guò)等電聚焦制備，隨后在十二烷基硫酸鈉存在下進(jìn)行電泳。
14.根據(jù)權(quán)利要求
11的方法，其中所述凝膠鍵合到一種普通平面固體支持物上，以使凝膠有二維空間穩(wěn)定性，而且支持物基本上不干擾生物分子攜帶的可檢測(cè)標(biāo)記的相關(guān)檢測(cè)。
15.根據(jù)權(quán)利要求
14的方法，其中所述聚丙烯酰胺凝膠共價(jià)鍵合到所述固體支持物上。
16.根據(jù)權(quán)利要求
14的方法，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記為一種熒光標(biāo)記。
17.根據(jù)權(quán)利要求
14的方法，其中所述固體支持物為玻璃。
18.根據(jù)權(quán)利要求
11的方法，其中所選生物分子的分離包括切割含有所選生物分子的凝膠部分。
19.根據(jù)權(quán)利要求
18的方法，其還包括分析含于切割的凝膠部分中的生物分子。
20.根據(jù)權(quán)利要求
19的方法，其中生物分子是蛋白質(zhì)，分析包括蛋白質(zhì)水解。
21.根據(jù)權(quán)利要求
20的方法，其還包括通過(guò)質(zhì)譜確定蛋白質(zhì)的肽序列。
22.用于對(duì)存在于二維陣列中的一種或多種選擇的生物分子進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助分離的儀器，其中所述二維陣列含于如下方法制備的聚丙烯酰胺凝膠中，其中所述二維陣列的制備方法包括第一個(gè)分離步驟，其中多種生物分子根據(jù)第一種物理或化學(xué)特性被分離以形成生物分子的一維陣列；和第二個(gè)分離步驟，其中根據(jù)第二種物理或化學(xué)特性分離所述生物分子的一維陣列以形成所述二維陣列；一種能夠?qū)λ龆S陣列成像生成一種計(jì)算機(jī)可讀的輸出信號(hào)的檢測(cè)器，對(duì)每一種在該二維陣列中的多種生物分子來(lái)說(shuō)，其包括一對(duì)x，y坐標(biāo)以及一個(gè)信號(hào)值；一臺(tái)或多臺(tái)編程的計(jì)算機(jī)，其根據(jù)先前規(guī)定的或操作者制定的標(biāo)準(zhǔn)，選擇在所述輸出信號(hào)中描述的一種或多種生物分子，并且生成機(jī)器可讀的指令來(lái)指導(dǎo)機(jī)器人裝置分離至少一種所選的生物分子；并且根據(jù)所述指令能夠通過(guò)移除含有所述生物分子的凝膠部分分離至少一種所選的生物分子的一種機(jī)器人裝置，其中所述檢測(cè)器有效地連接到一臺(tái)或多臺(tái)計(jì)算機(jī)中的至少一臺(tái)，并且所述的一臺(tái)或多臺(tái)計(jì)算機(jī)中的至少一臺(tái)有效地連接到所述機(jī)器人裝置。
23.根據(jù)權(quán)利要求
22的儀器，其中所述檢測(cè)器與機(jī)器人裝置物理上分離。
24.根據(jù)權(quán)利要求
22的儀器，其中機(jī)器人裝置經(jīng)調(diào)整適于依機(jī)器可讀指令進(jìn)行x和y運(yùn)動(dòng)。
25.根據(jù)權(quán)利要求
22的儀器，其中機(jī)器人裝置含有一切割頭，其中包括帶有移動(dòng)梭的尖頭。
26.根據(jù)權(quán)利要求
22的儀器，其中檢測(cè)器是熒光掃描儀。
27.根據(jù)權(quán)利要求
22的儀器，其中生物分子如權(quán)利要求
8所定義。
28.根據(jù)權(quán)利要求
22的儀器，其中所述聚丙烯酰胺凝膠鍵合到普通平面固體支持物上，以使凝膠具有二維空間穩(wěn)定性，并且支持物基本上不干擾生物分子攜帶的可檢測(cè)標(biāo)記的相關(guān)檢測(cè)。
29.根據(jù)權(quán)利要求
28的儀器，其中所述聚丙烯酰胺凝膠共價(jià)地鍵合到所述固體支持物。
30.根據(jù)權(quán)利要求
28的儀器，其中所述固體支持物為玻璃。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明提供了用于鑒定、選擇和表征生物學(xué)樣品中的分子的計(jì)算機(jī)輔助的方法和儀器。通過(guò)分離存在于復(fù)雜混合物中的生物分子產(chǎn)生一個(gè)二維陣列。構(gòu)建一種計(jì)算機(jī)可讀的分布圖，其表示通過(guò)對(duì)二維陣列成像檢測(cè)的多數(shù)生物分子的特征性及相對(duì)豐度。計(jì)算機(jī)介導(dǎo)的來(lái)自多重樣本分布圖的比較允許自動(dòng)鑒定滿(mǎn)足預(yù)先規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的生物分子子集。根據(jù)計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的指令，通過(guò)機(jī)器人裝置鑒定的生物分子可從二維陣列中被自動(dòng)分離。提供了一種適用于電泳的被支持的凝膠，它結(jié)合于固體支持物上以使凝膠具有二維空間穩(wěn)定性，并且固體支持物基本上不干擾與凝膠中的一個(gè)或多個(gè)生物分子結(jié)合的標(biāo)記如熒光標(biāo)記的有關(guān)檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N27/62GKCN1125981SQ97181104
公開(kāi)日2003年10月29日 申請(qǐng)日期1997年12月1日
發(fā)明者R·B·帕里克, R·阿麥斯, J·A·布魯斯, S·B·普瑞姆, A·E·普拉特, R·M·斯托尼 申請(qǐng)人:牛津糖科學(xué)(英國(guó))有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan