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基于功能化DNA立方體的電化學(xué)傳感器及其構(gòu)建方法和在外泌體miRNA檢測中的應(yīng)用

文檔序號:40605042發(fā)布日期:2025-01-07 20:45閱讀:7來源:國知局
基于功能化DNA立方體的電化學(xué)傳感器及其構(gòu)建方法和在外泌體miRNA檢測中的應(yīng)用

本發(fā)明屬于電化學(xué)傳感器檢測,特別涉及一種基于功能化dna立方體的電化學(xué)傳感器及其構(gòu)建方法和在外泌體mirna檢測中的應(yīng)用。


背景技術(shù):

1、宮頸癌(cervical?cancer,cc)是全球女性中第四常見的癌癥,晚期發(fā)現(xiàn)的宮頸癌是導(dǎo)致女性癌癥死亡的主要原因之一。cc的早期篩查對于鑒別宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervicalintraepithelial?neoplasias,cin)以防止其發(fā)展為侵襲性癌癥具有重要意義。巴氏涂片(papanicolaou?test)和新柏氏液基細(xì)胞學(xué)檢測(thinprep?cytologic?test,tct)、人乳頭瘤病毒(human?papillomavirus,hpv)感染篩查顯著降低了宮頸癌的發(fā)病率。近年來,外泌體mirna被發(fā)現(xiàn)在宮頸癌診斷、治療及預(yù)后監(jiān)測中具有重要意義,被認(rèn)為是潛在的生物標(biāo)志物。外泌體mirnas是外泌體主要成分之一,與長非編碼rna(long?non-coding?rna,lncrna)的復(fù)雜機(jī)制和mrna的不穩(wěn)定特征相比,外泌體中mirnas含量較高且相對穩(wěn)定,是宮頸癌診斷和監(jiān)測的理想生物標(biāo)志物。最新研究表明,外泌體mirna-30d-5p和let-7d-3p是宮頸癌及癌前病變方面很有價(jià)值的診斷生物標(biāo)記物,對這兩種外泌體mirnas的準(zhǔn)確快速檢測具有重要意義。但是由于mirnas序列短、同源性高、豐度低,準(zhǔn)確定量檢測mirnas仍存在一些挑戰(zhàn)。

2、目前,多種檢測方法已成功應(yīng)用于外泌體mirnas檢測,包括rt-qpcr、熒光傳感器、比色、sers等。rt-qpcr方法是mirnas檢測的金標(biāo)準(zhǔn),但需要繁瑣的引物設(shè)計(jì)和樣品處理程序、嚴(yán)格的環(huán)境和專業(yè)人員要求,使其可用性受到限制。熒光傳感器操作簡單,但額外的熒光標(biāo)記成本高且靈敏度低,難以檢測低水平的外泌體mirnas。sers容易產(chǎn)生信號之間的交互干擾,導(dǎo)致高背景信號。因此,開發(fā)一種簡便且具有高特異性和靈敏度的檢測策略以檢測外泌體mirnas具有重要的臨床意義。

3、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是繼pcr之后發(fā)展起來的一種新型核酸體外擴(kuò)增技術(shù),它可以在恒定的溫度、簡單的條件甚至復(fù)雜的生物環(huán)境下實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)的擴(kuò)增和檢測。得益于核酸的高度可編程性和堿基互補(bǔ)配對的高度特異性,研究者們設(shè)計(jì)了各種dna等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),包括cha、hcr、rca、sda、lamp等。近年來催化發(fā)夾自組裝(cha)由于含有懸掛游離單鏈部分的dsdna產(chǎn)物更容易捕獲并生成增強(qiáng)的電化學(xué)信號、成本低、特異性高和操作簡單而被廣泛研究。cha采用無酶等溫信號放大策略產(chǎn)生數(shù)百倍的擴(kuò)增產(chǎn)物,通過將分析物識別事件轉(zhuǎn)換為電化學(xué)信號檢測模式,建立了多種mirnas檢測策略。然而cha用于電化學(xué)檢測存在以下不足:(1)cha反應(yīng)依賴于游離發(fā)夾的隨機(jī)碰撞,反應(yīng)效率低,時(shí)間長,給檢測帶來一定難度;(2)以ssdna為捕獲探針的電極反應(yīng),核酸鏈之間相互糾纏、擁擠,反應(yīng)效率低。

4、將fnas的優(yōu)異性能與電化學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢相結(jié)合,為外泌體mirnas檢測開辟了一條新的途徑,基于界面上的fnas電化學(xué)探針開發(fā)了各種電化學(xué)生物傳感器,用于核酸、小分子、蛋白質(zhì)和細(xì)胞的高靈敏度和特異性檢測,使電化學(xué)生物傳感界面上的分子識別得到了顯著增強(qiáng)。dna四面體可以牢固地錨定在電極上避免探針之間的糾纏,且自組裝結(jié)構(gòu)的局部聚集可以抵抗非特異性吸附。結(jié)合電化學(xué)方法,dna四面體已被用于dna、mirnas、蛋白質(zhì)和ctc的檢測。最近,有研究者提出了一種局域化的dna四面體輔助cha策略,使用dna納米線將四面體-cha限制在緊湊的空間中,通過dna四面體加速cha,為每個(gè)dna四面體-cha創(chuàng)建精確的控制空間來減少局部反應(yīng)的泄漏,用于外泌體mirna檢測,顯示出優(yōu)異的靈敏度。也有研究者將dna立方體作為支架,將雙擺臂固定在其上作為引擎,軌道作為信號開關(guān),設(shè)計(jì)了一種雙引擎觸發(fā)的ecl檢測策略,有效提高了dna步行器的操作效率和可控性。盡管這些檢測策略實(shí)現(xiàn)了外泌體mirnas的高效檢測,但仍存在以下不足需要改進(jìn):(1)反應(yīng)步驟多,操作繁瑣;(2)還應(yīng)進(jìn)一步探索多重檢測的電化學(xué)生物傳感器;(3)多次亞穩(wěn)態(tài)發(fā)夾驅(qū)動(dòng)擴(kuò)增的耗時(shí)過程限制了它們的實(shí)際應(yīng)用。


技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明意在提供一種基于功能化dna立方體的電化學(xué)傳感器及其構(gòu)建方法,將所述電化學(xué)常感器用于外泌體mirna的檢測,以解決現(xiàn)有的外泌體mirna檢測技術(shù)普遍存在反應(yīng)步驟多,操作繁瑣,耗時(shí)長的問題。

2、第一方面,本技術(shù)中的一種電化學(xué)傳感器的構(gòu)建方法,包括以下步驟:

3、s1、制備信號探針pt@aunps@hrp@dna

4、s1-1、采用金納米粒子aunps和h2ptcl6為主要成分合成鉑金納米粒子pt@aunps;

5、s1-2、將所述的pt@aunps進(jìn)行sa功能化后,與bio-hrp、bio-dna混合在室溫下反應(yīng),洗滌反應(yīng)產(chǎn)物,用pbst緩沖液重懸得到所述信號探針pt@aunps@hrp@dna;

6、s2、制備cha功能化dna立方體

7、s2-1、采用4條ssdna為主體骨架自組裝成線框dna立方體;

8、s2-2、將線框dna立方體、捕獲探針cp、發(fā)夾探針h1和發(fā)夾探針h2混合后孵育,得到結(jié)合了捕獲探針cp的功能化dna立方體;

9、s3、構(gòu)建電化學(xué)傳感器

10、將s2-2中所述的功能化dna立方體溶液滴加到凈化處理后的玻碳電極ge上進(jìn)行孵育,沖洗后使用bsa緩沖液在室溫下反應(yīng),封閉ge表面的非特異性位點(diǎn),然后加入靶標(biāo)let-7d-3p或mirna-30d-5p反應(yīng)后,將所述信號探針pt@aunps@hrp@dna的溶液滴加到ge表面,反應(yīng)后干燥得到所述電化學(xué)傳感器;

11、其中,4條所述ssdna的核苷酸序列分別如seq?id?no.1~seq?id?no.4所示;所述cp的核苷酸序列如seq?id?no.5所示;所述let-7d-3p的核苷酸序列如seq?id?no.6所示;mirna-30d-5p的核苷酸序列如seq?id?no.7所示。

12、進(jìn)一步,所述bio-hrp、bio-dna的濃度分別是:bio-hrp?1mg/ml,bio-dna?100μm。

13、進(jìn)一步,所述捕獲探針cp先用三(2-羧基乙基)-膦鹽酸鹽活化巰基后再使用。

14、進(jìn)一步,所述s3中靶標(biāo)的反應(yīng)時(shí)間為60min,信號探針的反應(yīng)時(shí)間為30min。

15、第二方面,本技術(shù)還提供了一種提升電化學(xué)傳感器檢測靈敏度的材料,所述材料包括如第一方面所述的信號探針pt@aunps@hrp@dna或/和所述的功能化dna立方體。

16、第三方面,采用上述方法構(gòu)建獲得的電化學(xué)傳感器,用于外泌體mirna檢測顯示出優(yōu)異的靈敏度。

17、電化學(xué)生物傳感器由于其靈敏度高、檢測快速簡單、儀器小型化和成本低效益高等優(yōu)點(diǎn),已成為外泌體mirnas檢測很有前途的研究和開發(fā)領(lǐng)域。與其他方法相比,電化學(xué)方法集成系統(tǒng)更容易設(shè)置,從而更適合向poct轉(zhuǎn)化。

18、本發(fā)明的工作原理:本發(fā)明采用基于cha功能化dna立方體,結(jié)合pt@aunps@hrp納米酶標(biāo)簽,研究開發(fā)了一種具有高靈敏性的電化學(xué)傳感器用于外泌體mirna的檢測。cha功能化dna立方體組裝過程中,首先制備的線框dna立方體由4條ssdna單鏈一步法組裝而成,具有8個(gè)單鏈結(jié)構(gòu)域,可以特異性結(jié)合ssdna。線框dna立方體上表面單鏈結(jié)構(gòu)域與cha反應(yīng)元件h1和h2發(fā)夾探針結(jié)合組裝成功能化dna立方體。并通過底部節(jié)點(diǎn)修飾的巰基固定在金電極(gold?electrode,ge)表面。

19、電化學(xué)檢測原理:在aunps的基礎(chǔ)上合成pt@aunps,隨后通過sa功能化和生物素連接ssdna和hrp,形成pt@aunps@hrp@dna作為信號探針,該信號探針中的dna與功能化dna立方體上的cha反應(yīng)產(chǎn)物暴露出游離單鏈序列結(jié)合,pt@aunps@hrp具有高效的過氧化物酶活性,能還原h(huán)2o2產(chǎn)生強(qiáng)烈的電化學(xué)信號。將功能化的dna立方體通過金巰鍵固定在ge上,外泌體mirna的存在可以激活功能化dna立方體框架限域內(nèi)的高效cha反應(yīng),通過靶標(biāo)循環(huán)在立方體節(jié)點(diǎn)間快速轉(zhuǎn)移,形成大量的h1h2雙鏈結(jié)構(gòu),暴露出游離單鏈序列,并與信號探針pt@aunps@hrp@dna相結(jié)合,進(jìn)而催化h2o2產(chǎn)生顯著的電化學(xué)信號,用于外泌體mirna的快速穩(wěn)定檢測。

20、本發(fā)明的有益技術(shù)效果:

21、1、本發(fā)明在線框dna立方體框架的基礎(chǔ)上整合cha擴(kuò)增元件,結(jié)合pt@aunps@hrp@dna信號探針,構(gòu)建了用于外泌體mirna檢測的電化學(xué)生物傳感器。通過利用限域空間大幅提高cha的擴(kuò)增效率、合成具有高效催化性能的復(fù)雜納米酶探針,共同提升了該傳感器的檢測靈敏度。

22、2、dna立方體的存在一方面通過cha反應(yīng)底物的局域化提高了反應(yīng)速度,其次基于界面上的dna框架結(jié)構(gòu)提高了cha的操作效率和可控性,實(shí)現(xiàn)了外泌體mirna的高效檢測。

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