本技術(shù)涉及生物檢測(cè)，尤其是涉及一種快速半定量檢測(cè)尿液外泌體可溶性fms樣酪氨酸激酶受體1的免疫層析檢測(cè)試紙及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、子癇和子癇前期(preeclampsia，pe)是產(chǎn)科急危重疾病，會(huì)導(dǎo)致孕婦出現(xiàn)不明原因的抽搐，是引起圍產(chǎn)兒以及孕婦死亡的原因之一。子癇前期是一種妊娠特異性多系統(tǒng)疾病，患者臨床主要表現(xiàn)為妊娠20周后突然出現(xiàn)血壓升高、蛋白尿和內(nèi)皮功能障礙，該病是引起孕婦死亡的主要病因，也極易造成孕婦早產(chǎn)。子癇前期的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前尚無有效的預(yù)防和治療手段，隨著對(duì)pe發(fā)病機(jī)制研究的深入，越來越多的研究開始探索新的治療措施。近年來，大量研究認(rèn)為可能與胎盤功能障礙及廣泛的血管內(nèi)皮損傷有關(guān)?？寡苌梢蜃印扇苄詅ms樣酪氨酸激酶受體1(sflt-1)可引起血管內(nèi)皮損傷及血管生成障礙，妊娠出現(xiàn)異常時(shí)血液中可溶性fms樣酪氨酸激酶受體1水平顯著升高，可反映血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷程度，可溶性fms樣酪氨酸激酶受體1有望作為在子癇前期的早期預(yù)測(cè)和評(píng)估指標(biāo)之一。

2、孕婦血液中的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1屬于ⅲ型受體酪氨酸激酶家族，分子量約為63.6kd；由細(xì)胞外區(qū)1～6個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，不含酪氨酸激酶域，編碼區(qū)與fms樣酪氨酸激酶-1的胞外區(qū)完全一致，能與膜表面受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。最初于類臍靜脈內(nèi)細(xì)胞上被發(fā)現(xiàn)可溶性fms樣酪氨酸激酶-1作為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和胎盤生長(zhǎng)因子的直接抑制物，血清水平升高則可導(dǎo)致胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞及血管生長(zhǎng)不良，從而導(dǎo)致內(nèi)細(xì)胞損傷?？扇苄詅ms樣酪氨酸激酶-1主要通過與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和胎盤生長(zhǎng)因子結(jié)合，影響血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和胎盤生長(zhǎng)因子的生物學(xué)功能，參與血管的形成、重塑和再植等作用，因而，可溶性fms樣酪氨酸激酶-1與子癇前期的預(yù)測(cè)已成為研究焦點(diǎn)。血循環(huán)中的胎盤生長(zhǎng)因子與可溶性fms樣酪氨酸激酶-1濃度水平的變化可先于臨床癥狀出現(xiàn)前鑒別正常妊娠和先兆子癇，可溶性fms樣酪氨酸激酶-1是首個(gè)經(jīng)過大規(guī)模臨床試驗(yàn)驗(yàn)證的、可用于孕婦子癇前期預(yù)測(cè)的生化標(biāo)志物。有研究證實(shí)：子癇前期孕婦血清及尿液中可溶性fms樣酪氨酸激酶-1和胎盤生長(zhǎng)因子水平高于正常孕婦。

3、外泌體(exosome)可以作為子癇前期和其它疾病的標(biāo)志物，直徑約為30-150nm，密度在1.13-1.21g/m1，是由細(xì)胞主動(dòng)分泌的膜性囊泡，經(jīng)過"內(nèi)吞-融合-外排"等一系列調(diào)控過程而形成。近年來大量國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道外泌體體現(xiàn)來源細(xì)胞的生理病理狀態(tài)，可作為早期預(yù)測(cè)疾病的生物標(biāo)記物。外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腹水和母乳。外泌體會(huì)攜帶源細(xì)胞獨(dú)特或關(guān)鍵的功能分子，導(dǎo)致不同來源的外泌體有不同的生物學(xué)功能。因此，根據(jù)檢測(cè)外泌體所含的物質(zhì)，去測(cè)定某些細(xì)胞內(nèi)的某些蛋白質(zhì)與核酸的變化具有可能性。目前，已經(jīng)有許多疾病，包括婦產(chǎn)科急重癥、心血管疾病、腫瘤等，可以對(duì)患者血清或血漿以及液體中的外泌體進(jìn)行檢測(cè)，通過一定實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析方法研究樣品中的蛋白質(zhì)含量，對(duì)比正常個(gè)體的樣品數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)早期預(yù)測(cè)，為療效判斷和預(yù)后提供重要依據(jù)。

4、外泌體在尿液中能穩(wěn)定存在，而且，尿液樣品容易大量獲得并能避免創(chuàng)傷性損傷，因此，如果能夠檢測(cè)尿液外泌體中的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1表達(dá)，則有望將其用于子癇前期的無創(chuàng)預(yù)測(cè)和評(píng)估等應(yīng)用。雖然，差速離心法被認(rèn)為是外泌體分離的金標(biāo)準(zhǔn)，但也存在一些缺點(diǎn)：即費(fèi)時(shí)費(fèi)力、高度依賴人工，回收率低，由于重復(fù)離心操作很有可能對(duì)外泌體的囊泡造成損害從而降低其質(zhì)量，并且易聚集成塊而產(chǎn)生污染，對(duì)下游分析不利。目前使用免疫磁珠、超濾、沉淀或試劑盒提取和富集外泌體的方法均有局限性，因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞分泌至少10種不同類型的納米囊泡，很難或不可能依據(jù)相似的大小、密度和表面標(biāo)記物來區(qū)分這些囊泡。因此，當(dāng)今國(guó)內(nèi)外學(xué)者積極探索一種能夠快速、高效分離外泌體的實(shí)驗(yàn)方法用于子癇前期的早期預(yù)測(cè)。

5、目前，有專利cn202210182153.7公開了一種可溶性fms樣酪氨酸激酶-1的測(cè)定試劑盒及其制備方法，是采用熒光免疫分析儀檢測(cè)血清和血漿樣本的可溶性fms樣酪氨酸激酶-濃度。基于外泌體的體外即時(shí)檢測(cè)平臺(tái)及其檢測(cè)方法，通過空濾膜分離和提取外泌體用于半定量檢測(cè)腫瘤的特異性標(biāo)志物。該專利卻沒有提出對(duì)所有的外泌體都能分離、純化和檢測(cè)思路和技術(shù)，更沒有提出尿液外泌體具體的分離、純化和檢測(cè)可溶性fms樣酪氨酸激酶-1的具體指標(biāo)和方法。

6、并且，目前現(xiàn)有的化學(xué)發(fā)光技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)檢測(cè)可溶性fms樣酪氨酸激酶-1均采集外周血樣本，還沒有快速分離提取和檢測(cè)尿液外泌體可溶性fms樣酪氨酸激酶-1的子癇前期特異性標(biāo)志物的相關(guān)報(bào)道。

7、考慮到子癇前期是產(chǎn)科急危重疾病，涉及孕婦和胎兒兩個(gè)生命，加上妊娠期高血壓疾病是臨床特殊類型，血壓迅速升高且難以控制，出現(xiàn)大量蛋白尿，同時(shí)合并靶器官損傷，嚴(yán)重危及母嬰健康。對(duì)子癇前期進(jìn)行早期預(yù)測(cè)和評(píng)估可減少不良母嬰事件，因此很有必要建立一種快速半定量檢測(cè)尿液外泌體可溶性fms樣酪氨酸激酶-1的試劑盒，快速預(yù)測(cè)孕婦和胎兒的患病程度和嚴(yán)重性，實(shí)現(xiàn)即時(shí)檢測(cè)、隨到隨檢，方便臨床應(yīng)用，預(yù)防不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種快速半定量檢測(cè)尿液外泌體可溶性fms樣酪氨酸激酶受體1的免疫層析檢測(cè)試紙及其應(yīng)用。本技術(shù)的免疫層析檢測(cè)試紙可以快速的檢測(cè)出尿液外泌中的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1，不依賴于儀器和設(shè)備，即可通過檢測(cè)試紙判定是否患有子癇前期。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本技術(shù)采取的技術(shù)方案為：

3、本技術(shù)提供了一種快速半定量檢測(cè)尿液外泌體可溶性fms樣酪氨酸激酶受體1的免疫層析檢測(cè)試紙，所述免疫層析檢測(cè)試紙包括依次連接的樣品墊區(qū)、抗體區(qū)、金標(biāo)墊區(qū)、硝酸纖維素膜區(qū)、吸水墊區(qū)；

4、所述樣品墊區(qū)滴加通過濾頭過濾后的尿液；所述尿液包含有外泌體；所述濾頭用于快速分離和提取尿液外泌體；所述抗體區(qū)上包被半乳糖凝聚素-1單克隆抗體；所述半乳糖凝聚素-1單克隆抗體用于通過濾頭快速分離和提取尿液外泌體(粗品)基礎(chǔ)上進(jìn)一步純化尿液外泌體(精品)；所述金標(biāo)墊區(qū)上包被有被膠體金顆粒標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1；所述硝酸纖維素膜區(qū)上設(shè)有檢測(cè)t線和質(zhì)控c線；

5、所述被膠體金顆粒標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1和尿液中的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1抗原結(jié)合。

6、所述被標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1為第一抗體，是鼠抗人可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體ab18a6抗體亞型，作為膠體金顆粒標(biāo)記抗體。

7、本技術(shù)發(fā)明人經(jīng)過大量研究及試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本技術(shù)將通過濾頭過濾后的尿液滴加至樣品墊區(qū)，然后通過層析作用尿液至抗體區(qū)，尿液中外泌體表面的糖蛋白(外泌體表面存在大量的糖蛋白，包括半乳糖凝聚素1抗原)和抗體區(qū)上包被的半乳糖凝聚素-1單克隆抗體結(jié)合，進(jìn)一步富集、提取和純化尿液中的外泌體，提高了被提取的外泌體質(zhì)量，同時(shí)，彌補(bǔ)過濾頭是根據(jù)體積大小來提取尿液的外泌體，難免混有同等體積的其它雜蛋白分子的不足，必須要加上半乳糖凝聚素-1單克隆抗體來純化外泌體，提高質(zhì)量。

8、采用該步驟具有成本低、操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)率和純度高且外泌體結(jié)構(gòu)完整等優(yōu)點(diǎn)；然后尿液經(jīng)過層析，尿液中的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1抗原與被標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1結(jié)合，在檢測(cè)卡的檢測(cè)t線上有包被在硝酸纖維素膜上的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體2(ab21d9抗體亞型)。當(dāng)測(cè)試尿液流到檢測(cè)t線時(shí)，待測(cè)抗原與被膠體金標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1結(jié)合，在層析作用下，與預(yù)先包被在硝酸纖維素膜上檢測(cè)區(qū)(t線)的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體2結(jié)合形成雙抗體夾心復(fù)合物(即被標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1-待測(cè)抗原-包被的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體2免疫復(fù)合物)，則滯留在t線處形成紅色線的t檢測(cè)線(此處顯示陽性結(jié)果)。檢測(cè)t線分別設(shè)有4ng/ml，10ng/ml的檢測(cè)濃度(也是分別設(shè)有檢測(cè)t線1組和檢測(cè)t線2組)。當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測(cè)t線10ng/ml的檢測(cè)濃度時(shí)，檢測(cè)t線2組會(huì)顯示紅色線；如果只是到達(dá)檢測(cè)t線4ng/ml的檢測(cè)濃度時(shí)，則檢測(cè)t線1組也會(huì)顯示紅色線。當(dāng)測(cè)試尿液流經(jīng)硝酸纖維素膜區(qū)上固定有羊抗鼠igg抗體的質(zhì)控c線時(shí)，多余(未被檢測(cè)t線截留)的被膠體金標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1會(huì)繼續(xù)流向質(zhì)控c線，與c線處預(yù)先包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠抗體結(jié)合，形成金標(biāo)抗體-c線抗體復(fù)合物。同樣由于膠體金在此處大量聚集，再次形成一條紅色線的對(duì)照線c，即出現(xiàn)質(zhì)控c線(此處顯示陰性結(jié)果)，說明實(shí)驗(yàn)是有效的。因此，可以觀察硝酸纖維素膜區(qū)上的檢測(cè)t線和質(zhì)控c線(硝酸纖維素膜區(qū)上的t線用于檢測(cè)尿液中外泌體上的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1抗原含量，c線作為控制線)的顏色變化，從而預(yù)測(cè)是否患有患子癇前期。

9、本技術(shù)的免疫層析檢測(cè)試紙可以快速的檢測(cè)出尿液外泌中的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1，不依賴于儀器和設(shè)備，即可通過檢測(cè)試紙預(yù)測(cè)是否患有患子癇前期。此外，本技術(shù)的免疫層析檢測(cè)試紙?jiān)谠u(píng)估同時(shí)還能對(duì)孕婦人群中可溶性fms樣酪氨酸激酶-1的含量4ng/ml，10ng/ml做出區(qū)分，能夠準(zhǔn)確判斷出高危人群，本技術(shù)不僅縮短了檢測(cè)時(shí)間，還提高檢測(cè)的精準(zhǔn)度，實(shí)現(xiàn)了即時(shí)檢測(cè)、移動(dòng)檢測(cè)和家庭自助式檢測(cè)，可以自行及時(shí)掌握可溶性fms樣酪氨酸激酶-1的含量及變化，提前預(yù)測(cè)子癇前期發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

10、本技術(shù)的免疫層析檢測(cè)試紙具有使用操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)方便、快速獲得結(jié)果、特異性強(qiáng)、靈敏度高、且成本低等優(yōu)點(diǎn)。

11、作為本技術(shù)所述免疫層析檢測(cè)試紙的優(yōu)選實(shí)施方式，所述樣品墊區(qū)滴加采用聚四氟乙烯、不飽和聚酯樹脂和環(huán)氧樹脂制成的濾頭過濾尿液，所述濾頭用于快速分離和提取尿液外泌體。

12、本技術(shù)采用特制濾頭可以快速分離和提取尿液中的外泌體(粗品)，然后過濾后的尿液通過層析作用至抗體區(qū)，尿液中的糖蛋白(半乳糖凝聚素1抗原)和抗體區(qū)上包被的半乳糖凝聚素-1單克隆抗體結(jié)合，進(jìn)一步純化尿液中的外泌體(精品)，提高被提取的外泌體質(zhì)量。同時(shí)，彌補(bǔ)因過濾頭是根據(jù)體積大小來提取尿液的外泌體，難免混有同等體積的其它雜蛋白分子的不足。

13、作為本技術(shù)所述免疫層析檢測(cè)試紙的優(yōu)選實(shí)施方式，所述濾頭包括以下重量份數(shù)的組分：

14、聚四氟乙烯10～40份、不飽和聚酯樹脂50～75份和環(huán)氧樹脂5～25份。

15、所述濾頭有6個(gè)圓形小孔，直徑均為小于300nm。

16、所述濾頭的制備方法，包括以下制備步驟：

17、將上述(聚四氟乙烯10～40份、不飽和聚酯樹脂50～75份和環(huán)氧樹脂5～25份)重量份數(shù)的組分配制混合液，用機(jī)械攪拌30～60min，放到真空烘箱中，通過抽真空的方法去除其中的氣泡，把通過抽真空去除氣泡的混合物倒入聚四氟乙烯模具中，在常溫下固化2～4小時(shí)，然后在150-300℃條件下固化6～10小時(shí)成型。

18、自制濾頭采用聚四氟乙烯復(fù)合材料，在現(xiàn)有技術(shù)中，制備聚四氟乙烯多孔材料的方法雖然很多，但是不合適應(yīng)用在本技術(shù)中使用，需要自制聚四氟乙烯多孔材料。

19、在制備聚四氟乙烯多孔材料中若要填充其他復(fù)合材料，通常會(huì)導(dǎo)致最終產(chǎn)品中的大量不均勻性，而且在面臨重大的外界環(huán)境的挑戰(zhàn)，承受各種環(huán)境應(yīng)力時(shí)，這些填充料有可能脫落或浸出。出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象很大程度上是由于填充物在聚四氟乙烯基體中分散性不佳以及填充物與惰性的聚四氟乙烯化學(xué)與物理層面的相容性比較差導(dǎo)致的。因此，本技術(shù)經(jīng)過測(cè)試，采用上述配方及其方法獲得的濾頭用于快速分離和提取外泌體(外泌體直徑為30～200nm)，分離大于300nm的蛋白及雜質(zhì)。

20、本技術(shù)在濾頭材料中添加不飽和聚酯樹脂和環(huán)氧樹脂，可以分離尿液中的蛋白，防止尿液因過多蛋白在過濾時(shí)發(fā)生凝固，導(dǎo)致濾頭孔堵塞。

21、作為本技術(shù)所述免疫層析檢測(cè)試紙的優(yōu)選實(shí)施方式，所述包被有膠體金顆粒標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1的fc端通過生物素連接酶催化修飾。

22、本技術(shù)的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1的fc端通過生物素連接酶催化修飾，可以實(shí)現(xiàn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶催化谷氨酰胺與賴氨酸、色氨酸和半胱氨酸這三種氨基酸連接，對(duì)可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1進(jìn)行顆粒標(biāo)記。

23、作為本技術(shù)所述免疫層析檢測(cè)試紙的優(yōu)選實(shí)施方式，所述硝酸纖維素膜區(qū)上t線的劃線抗體為預(yù)先包被在硝酸纖維素膜上檢測(cè)區(qū)(檢測(cè)t線)的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體2；質(zhì)控c線的劃線抗體為包被的羊抗鼠抗體。所述被包被的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體2為第二抗體，是鼠抗人可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體ab21d9抗體亞型，作為t線的劃線抗體。

24、即t線有兩組，可以檢測(cè)出尿液中外泌體上的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1含量為4～10ng/ml，其中一組t線檢測(cè)出尿液中外泌體上的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1含量為4ng/ml(檢測(cè)t線1組)；另外一組t線檢測(cè)出尿液中外泌體上的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1含量為10ng/ml(檢測(cè)t線2組)。當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測(cè)t線10ng/ml的檢測(cè)濃度時(shí)，檢測(cè)t線2組會(huì)顯示紅色線；如果只是到達(dá)檢測(cè)t線4ng/ml的檢測(cè)濃度時(shí)，則檢測(cè)t線1組也會(huì)顯示紅色線。

25、在檢測(cè)卡的檢測(cè)線(t)包被有標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體2，與金標(biāo)墊區(qū)上包被有被膠體金顆粒標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1結(jié)合，形成即被標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1-待測(cè)抗原-包被的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體2免疫復(fù)合物(即標(biāo)記抗體1-抗原-抗體2夾心復(fù)合物)。通過采用雙抗體夾心法半定量檢測(cè)尿液外泌體可溶性fms樣酪氨酸激酶-1抗原含量。

26、作為本技術(shù)所述免疫層析檢測(cè)試紙的優(yōu)選實(shí)施方式，所述抗體區(qū)上半乳糖凝聚素-1單克隆抗體進(jìn)行糖基化修飾，為o-糖基化(o-glcna)修飾。

27、所述抗體區(qū)上半乳糖凝聚素-1單克隆抗體具有單一的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)區(qū)：即o-糖基化基團(tuán)(o-glcna)，能與外泌體表面的糖鏈(o-糖鏈)牢固結(jié)合(外泌體表面存在大量的糖鏈)。

28、優(yōu)選地，半乳糖凝聚素-1單克隆抗體用于通過濾頭快速分離和提取尿液外泌體(粗品)基礎(chǔ)上進(jìn)一步純化尿液外泌體(精品)。

29、本技術(shù)采用在抗體區(qū)包被半乳糖凝聚素-1單克隆抗體(galectin-1)，有助于分離和純化尿液中的外泌體，且與磁珠免疫法提取尿液外泌體(即根據(jù)具有外泌體表面有其特異性標(biāo)記物(如cd9，cd81，cd63)提取尿液外泌體)相比，本技術(shù)采用自制濾頭聯(lián)合半乳糖凝聚素-1單克隆抗體可以更好地提取和純化尿液外泌體，采用半乳糖凝聚素-1單克隆抗體捕獲外泌體結(jié)合的特異性方法，大大提高分離、提取和純化外泌體，適合大樣本提取外泌體，同時(shí)不受到基質(zhì)非特異性吸附的影響，可以特異性檢測(cè)外泌體結(jié)果，精確度和準(zhǔn)確性高，有利于準(zhǔn)確檢測(cè)到子癇前期患者尿液外泌體的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1含量，而磁珠免疫法提取尿液外泌體量少，同時(shí)受到ph和鹽濃度的影響，檢測(cè)可溶性fms樣酪氨酸激酶-1含量受到干擾，容易出現(xiàn)漏診現(xiàn)象。

30、高效、完整的提取和純化的尿液外泌體是目前研究的難點(diǎn)。本技術(shù)通過半乳糖凝聚物-1抗體分離、提取和純化外泌體，是通過半乳糖凝聚物-1抗體糖基化囊泡外的糖鏈結(jié)合，能快速獲得的外泌體形態(tài)完整，純度較高。半乳糖凝聚素-1單克隆抗體用于通過濾頭快速分離和提取尿液外泌體(粗品)基礎(chǔ)上進(jìn)一步純化尿液外泌體(精品)。由于半乳糖凝聚物-1抗體分離、提取和純化外泌體，不需要洗滌即獲得完整的外泌體。比采用傳統(tǒng)方法分離、提取和純化外泌體明顯精確和簡(jiǎn)潔，并能為進(jìn)一步擴(kuò)展為下一步的其他檢查留有空間，而且運(yùn)營(yíng)成本大大降低和簡(jiǎn)化，符合國(guó)家產(chǎn)業(yè)政策，是重大進(jìn)步。

31、作為本技術(shù)所述免疫層析檢測(cè)試紙的優(yōu)選實(shí)施方式，所述金標(biāo)墊區(qū)的制備方法，包括以下步驟：

32、取直徑為45～55nm的膠體金顆粒溶液，用k2co3調(diào)節(jié)膠體金顆粒溶液的ph值為7.5～10.7，然后將可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1加入至膠體金顆粒溶液中混勻，再加入peg20000和bsa，離心取沉淀物，采用復(fù)溶液復(fù)溶沉淀物獲得混合液，再將混合液噴涂于聚酯膜上，反應(yīng)溫度為33～40℃，反應(yīng)時(shí)間為50～250min，形成金標(biāo)墊區(qū)。

33、優(yōu)選地，所述ph值為8.5，反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為100min。

34、常見的抗原標(biāo)記上膠體金比較容易，但是受抗原或抗體與膠體金結(jié)合方式的影響，膠體金標(biāo)記的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)是標(biāo)記時(shí)的ph和最佳蛋白質(zhì)標(biāo)記量的確定。本技術(shù)根據(jù)膠體金標(biāo)記的原理，摸索出并確定只有在ph為7.5至10.7時(shí)，可溶性fms樣酪氨酸激酶-1蛋白等電點(diǎn)(8.1至9.6)膠體金與可溶性fms樣酪氨酸激酶-1蛋白的吸附力最強(qiáng)。ph過高過低都不利于兩者的結(jié)合，例如，如果ph大于11時(shí)，即高于fms樣酪氨酸激酶-1等電點(diǎn)，出現(xiàn)標(biāo)記fms樣酪氨酸激酶-1抗體很容易與膠體金解離。隨著ph的提高，靜電排斥增加，疏水作用力由于蛋白與金顆粒在空間距離上的增大而變小，結(jié)合到膠體金上的蛋白也減少，標(biāo)記效率低。當(dāng)ph值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)(即ph小于6.5時(shí))，靜電作用為主要作用力，蛋白質(zhì)帶正電荷，膠體金帶負(fù)電荷，蛋白質(zhì)雖然容易與膠體金結(jié)合，形成的結(jié)合物相互之間容易聚集，出現(xiàn)死金的現(xiàn)象，即標(biāo)記效率高，但是形成的結(jié)合物穩(wěn)定性差，出現(xiàn)膠體金標(biāo)記抗體分離的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響到抗體含量的檢測(cè)。因此，標(biāo)記時(shí)選擇精密的酸堿度測(cè)定儀器或者試紙條，采用不同方法重復(fù)校正，并進(jìn)行梯度試驗(yàn)，找到最佳的標(biāo)記ph溶膠與被標(biāo)蛋白質(zhì)的用量比例，即是膠體金標(biāo)記通常將膠體金溶液ph值調(diào)節(jié)至比蛋白質(zhì)等電點(diǎn)高0.5～1.0左右，以保證標(biāo)記物狀態(tài)的穩(wěn)定，才是進(jìn)行成功標(biāo)記的重要因素，本技術(shù)克服了影響膠體金標(biāo)記抗體的兩大因素即：膠體金標(biāo)記效果和與標(biāo)記抗體結(jié)合的穩(wěn)定性。本技術(shù)還發(fā)現(xiàn)，過多蛋白質(zhì)標(biāo)記引起試紙的拖帶現(xiàn)象；過少蛋白質(zhì)標(biāo)記，導(dǎo)致膠體金標(biāo)記不完全，從而降低試紙的靈敏度及假陽性現(xiàn)象的出現(xiàn)。更需要本技術(shù)在試驗(yàn)中進(jìn)行梯度試驗(yàn)，反復(fù)比較不同標(biāo)記量的標(biāo)記物在試驗(yàn)中的穩(wěn)定性，從而確定最佳的標(biāo)記量。

35、經(jīng)過摸索本技術(shù)發(fā)現(xiàn)，膠體金的顆粒大小還是影響膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)是否成功的另一個(gè)重要因素。如果膠體金的顆粒大小不均勻(40至60nm)，容易造成膠體金制備過程中的誤差是膠體金顆粒的不均一性甚至?xí)绊懪c蛋白質(zhì)結(jié)合穩(wěn)定性，本技術(shù)在膠體金蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)，預(yù)測(cè)可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體的分子量為70至80kda，要求膠體金顆粒直徑45至55nm，還要求賴氨酸、色氨酸和半胱氨酸參與(提高標(biāo)記的效果)，而且在每次實(shí)驗(yàn)前都進(jìn)行可溶性fms樣酪氨酸激酶-1蛋白質(zhì)穩(wěn)定性測(cè)定(包括溫度、ph值、蛋白等電點(diǎn)、鹽濃度、糖基化修飾、二硫鍵等)，才能確保證能獲得最佳標(biāo)記效果。

36、作為本技術(shù)所述免疫層析檢測(cè)試紙的優(yōu)選實(shí)施方式，所述復(fù)溶液是由終濃度為0.01～0.2mol/l?tris緩沖液，1％～5％bsa緩沖液，1％～3％海藻糖，1％～5％蔗糖，0.1％～2％曲拉通x-100，0.1％～0.5％吐溫-20，0.1％～1％peg?20000，0.1％～2％氯化鈉或0.1％～2％氫氧化鈉，0.05％～0.1％疊氮鈉。

37、所述可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體的濃度未10～50u/g，優(yōu)選為20u/g。

38、本技術(shù)還提供了一種免疫層析檢測(cè)方法，包括以下步驟：

39、s1、尿液樣品通過濾頭，分離和收集尿液中的外泌體；

40、s2、將通過濾頭過濾的尿液滴加在樣品墊，再通過抗體區(qū)上的半乳糖凝聚素-1通過o-糖基化與尿液中外泌體糖鏈結(jié)合，得到純度更高的外泌體；

41、s3、經(jīng)過步驟s2的尿液通過層析作用到達(dá)金標(biāo)墊區(qū)，尿液中的待測(cè)抗原與被標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1結(jié)合，得到被標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1-待測(cè)抗原免疫復(fù)合物；

42、s4、測(cè)試尿液繼續(xù)前移，當(dāng)測(cè)試尿液流到檢測(cè)t線時(shí)，待測(cè)抗原與被膠體金標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1結(jié)合，在層析作用下，與預(yù)先包被在硝酸纖維素膜上檢測(cè)區(qū)t線的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體2結(jié)合形成被標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1-待測(cè)抗原-包被的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體2免疫復(fù)合物，則滯留在t線處形成紅色線的t檢測(cè)線，此處顯示陽性結(jié)果，檢測(cè)t線分別設(shè)有4ng/ml，10ng/ml的檢測(cè)濃度，分別設(shè)有檢測(cè)t線1組和檢測(cè)t線2組，當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測(cè)t線10ng/ml的檢測(cè)濃度時(shí)，檢測(cè)t線2組會(huì)顯示紅色線；如果只是到達(dá)檢測(cè)t線4ng/ml的檢測(cè)濃度時(shí)，則檢測(cè)t線1組也會(huì)顯示紅色線。

43、當(dāng)測(cè)試尿液流經(jīng)硝酸纖維素膜區(qū)上固定有羊抗鼠igg抗體的質(zhì)控c線時(shí)，未被檢測(cè)t線截留的被膠體金標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1會(huì)繼續(xù)流向質(zhì)控c線，與c線處預(yù)先包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠igg抗體結(jié)合，形成金標(biāo)抗體-c線抗體的復(fù)合物，同樣由于膠體金在此處大量聚集，再次形成一條紅色線的對(duì)照線c，即出現(xiàn)質(zhì)控c線，此處顯示陰性結(jié)果，由此，通過在質(zhì)控c線處或檢測(cè)t線處顯示紅顏色判斷檢測(cè)結(jié)果。

44、在本技術(shù)的技術(shù)方案中，測(cè)試尿液樣品滴入免疫層析檢測(cè)試紙的樣品墊區(qū)后，通過吸水纖維的毛細(xì)作用，到達(dá)半乳糖凝聚素-1單克隆抗體區(qū)，測(cè)試尿液樣品迅速濕透金標(biāo)墊，金標(biāo)墊區(qū)上的被標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1，并隨測(cè)試液一起沿層析材料向前移動(dòng)，若測(cè)試尿液樣品中存在待測(cè)抗原，它將與被標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，形成被膠體金標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1-待測(cè)抗原免疫復(fù)合物，與t線上的預(yù)先包被在硝酸纖維素膜上檢測(cè)區(qū)(t線)的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體2結(jié)合再形成雙抗體夾心復(fù)合物(被標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1-待測(cè)抗原-包被的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體2免疫復(fù)合物)，則滯留在t線處形成紅色線的t檢測(cè)線(此處顯示陽性結(jié)果)。當(dāng)測(cè)試尿液流經(jīng)硝酸纖維素膜區(qū)上固定有羊抗鼠igg抗體的質(zhì)控c線時(shí)，多余(未被檢測(cè)t線截留)的被膠體金標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1會(huì)繼續(xù)流向質(zhì)控c線，與c線處預(yù)先包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠抗體結(jié)合，形成金標(biāo)抗體-c線抗體復(fù)合物。同樣由于膠體金在此處大量聚集，再次形成一條紅色線的對(duì)照線c，即出現(xiàn)質(zhì)控線c線(此處顯示陰性結(jié)果)，說明實(shí)驗(yàn)是有效的。

45、此時(shí)t線處均有被標(biāo)記的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體1-待測(cè)抗原-包被的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1單克隆抗體2免疫復(fù)合物滯留，即t線處均能觀察到紅色，則表示檢測(cè)結(jié)果為陽性結(jié)果，即測(cè)試尿液中有待測(cè)抗原；若僅c線處觀察到顏色，而t線處未觀察到顏色，則表示檢測(cè)結(jié)果為陰性結(jié)果，即測(cè)試液中無待測(cè)抗原；待測(cè)尿液中可溶性fms樣酪氨酸激酶-1含量不同，檢測(cè)t線分別設(shè)有4ng/ml，10ng/ml的檢測(cè)濃度，也是分別設(shè)有檢測(cè)t線1組(t線6.1)和檢測(cè)t線2組(t線6.2)。當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測(cè)t線10ng/ml的檢測(cè)濃度時(shí)，檢測(cè)t線2組(t線6.2)會(huì)顯示紅色線；如果只是到達(dá)檢測(cè)t線4ng/ml的檢測(cè)濃度時(shí)，則檢測(cè)t線1組(t線6.1)也會(huì)顯示紅色線。當(dāng)測(cè)試尿液滴入試紙條的樣品墊5～10分鐘后，肉眼就能直接觀察c、t線的出現(xiàn)情況，即可判斷半定量檢測(cè)結(jié)果。

46、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)具有以下有益效果：

47、本技術(shù)提供了一種快速半定量檢測(cè)尿液外泌體可溶性fms樣酪氨酸激酶受體1的免疫層析檢測(cè)試紙及其檢測(cè)方法，本技術(shù)的免疫層析檢測(cè)試紙可以快速的檢測(cè)出尿液外泌中的可溶性fms樣酪氨酸激酶-1，不依賴于儀器和設(shè)備，即可通過檢測(cè)試紙預(yù)測(cè)是否患有患子癇前期。本技術(shù)的免疫層析檢測(cè)試紙?jiān)谠u(píng)估同時(shí)還能對(duì)孕婦樣本中可溶性fms樣酪氨酸激酶-1的含量4ng/ml和10ng/ml做出區(qū)分，能夠準(zhǔn)確判斷出高危人群。本技術(shù)不僅縮短了檢測(cè)時(shí)間，還提高檢測(cè)的精準(zhǔn)度，實(shí)現(xiàn)了即時(shí)檢測(cè)、移動(dòng)檢測(cè)和家庭自助式檢測(cè)，可以自行及時(shí)掌握可溶性fms樣酪氨酸激酶-1的含量及變化，提前預(yù)測(cè)子癇前期發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。