本發(fā)明屬于檢測分析，具體涉及一種基于化學(xué)衍生檢測甘油二酯類化合物的方法。

背景技術(shù)：

1、甘油二酯(diacylglcerol，dag)是一類甘油三酯中一個脂肪酸被羥基取代的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，廣泛存在于食用植物油中，含量不超過10％。甘油二酯主要是1,3-甘油二酯(1,3-dag)和1,2-甘油二酯(1,2-dag)兩種同分異構(gòu)體，其中1,3-甘油二酯的化學(xué)性質(zhì)更加穩(wěn)定，在天然植物油中兩種異構(gòu)體比例大概為7:3。甘油二酯的安全性已經(jīng)在世界范圍內(nèi)進行了廣泛的科學(xué)評估，美國食品藥品監(jiān)督管理局(fda)將其列為一般性安全成分(generallyrecognized?as?safe，gars)，我國于2009年將甘油二酯油列為新資源食品，2021年修訂甘油二酯油產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，以大豆油、菜籽油等為原料，以脂肪酶制劑、水、甘油等為主要輔料，且甘油二酯含量應(yīng)大于等于40％。甘油二酯油主要通過油脂化學(xué)法或酶法改性等方式合成，然后經(jīng)蒸餾分離、脫色、脫臭等工藝制成，是一個甘油三酯類化合物其中一個鍵斷裂水解或一分子丙三醇和兩分子脂肪酸酯化縮合反應(yīng)的產(chǎn)物。甘油二酯化合物具有不同于甘油三酯(tag)的代謝途徑，tag水解為2-甘油一酯，2-甘油一酯在小腸粘膜細胞上經(jīng)過胰脂肪酶的作用合成甘油三酯，到達人體肝臟和脂肪組織中蓄積，而1,3-甘油二酯水解為1-甘油一酯，由于小腸粘膜細胞上缺乏對1-甘油一酯直接作用的酯化合成酶，無法將其轉(zhuǎn)化為甘油三酯在體內(nèi)累積，最終經(jīng)β-氧化以能量形式轉(zhuǎn)化。甘油二酯是一類天然tag的低熱量替代脂質(zhì)，攝入等質(zhì)量的甘油二酯與tag能給人體提供相當(dāng)?shù)哪芰?，維持正常生命活動，但甘油二酯熱量比tag低30％，甘油二酯因代謝途徑與tag具有顯著差異能夠調(diào)控脂肪酶氧化相關(guān)基因的表達，具有廣泛的生理活性和營養(yǎng)功能，能夠減少體脂，降低血脂，抑制體重，減少糖尿病、脂肪肝、心血管疾病等慢性綜合癥發(fā)病率。因此，研究食用植物油中甘油二酯的組成及含量分布，對評價甘油二酯對人體健康的重要作用具有重要意義。

2、目前甘油二酯檢測方法主要是薄層色譜法、核磁共振法、近紅外光譜法、高效液相色譜法等。薄層色譜法根據(jù)分析物極性的差異，利用硅膠板從實際樣品中分離甘油二酯，適用于定性分析。核磁共振法是基于原子核對射頻輻射所產(chǎn)生吸收的一種波譜技術(shù)，通過比對山茶油甘油二酯的特征指標(biāo)，建立了其特征指標(biāo)與含量的定量關(guān)系，從而實現(xiàn)了甘油二酯成分的監(jiān)控。近紅外光譜是一種簡單、快速和無損的檢測技術(shù)，通過檢測甘油二酯的紅外吸收譜建立模型對植物油中的甘油二酯成分及總量進行分析。高效液相色譜-紫外光譜法首先將待測液霧化形成氣溶膠，在加熱的漂移管中蒸發(fā)溶劑，然后分析甘油二酯的含量，該技術(shù)重復(fù)性穩(wěn)定，準(zhǔn)確度高。近年來，超高效液相色譜質(zhì)譜法(uhplc-ms/ms)因具有液相色譜優(yōu)異的分離性能和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度等優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于小分子化合物的定量檢測。

3、前期研究表明，化學(xué)衍生常被用以提高氣相色譜分析物的揮發(fā)性，或被用于液相色譜分析信號增強，引入發(fā)色團便于紫外或熒光檢測。隨著液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速發(fā)展，常用的電噴霧離子源(esi)適用于絕大多數(shù)化合物的檢測。但仍有部分化合物難以實現(xiàn)分離檢測，主要原因：(1)分子結(jié)構(gòu)中缺乏離子化的基團，難以實現(xiàn)高效電離；(2)化學(xué)性質(zhì)活潑，具有不穩(wěn)定的官能團；(3)相同種類不同物質(zhì)之間離子化效率差異大，質(zhì)譜分析相互造成干擾；(4)化合物含量低，前處理步驟繁瑣，靈敏度差，采用常規(guī)液質(zhì)檢測技術(shù)難以進行定量分析。對于這類物質(zhì)的質(zhì)譜分析除依賴接口技術(shù)發(fā)展和突破外，通過化學(xué)衍生化引入易電離基團，改變其理化性質(zhì)是高效的增敏技術(shù)手段。衍生化反應(yīng)是基于目標(biāo)化合物中的反應(yīng)基團和衍生化試劑發(fā)生的一種特定的化學(xué)反應(yīng)，將目標(biāo)化合物轉(zhuǎn)化成化學(xué)結(jié)構(gòu)類似物質(zhì)，衍生化試劑中的修飾基團可以增強目標(biāo)化合物的特異性，已應(yīng)用于游離脂肪酸、酚酸、甾醇等小分子化合物的精準(zhǔn)定量分析。

4、針對甘油二酯液相色譜質(zhì)譜檢測離子化效率低、分離度差的瓶頸難題，開發(fā)一種檢測甘油二酯的化學(xué)衍生分析方法具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的發(fā)明目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中甘油二酯檢測技術(shù)的瓶頸難題，提供一種甘油二酯類物質(zhì)檢測用化學(xué)衍生劑，及基于前述化學(xué)衍生劑的化學(xué)衍生檢測甘油二酯的方法。其能夠用于甘油二酯類物質(zhì)的檢測分析，解決了甘油二酯類物質(zhì)質(zhì)譜響應(yīng)差、色譜分離度低和靈敏度低的難題。

2、為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

3、如結(jié)構(gòu)式1所述的化學(xué)衍生劑在甘油二酯類物質(zhì)衍生化處理進行質(zhì)譜分析或液相色譜-質(zhì)譜分析中的應(yīng)用，所述的化學(xué)衍生劑一端為一個羧基，另外一端是nr2的化合物，結(jié)構(gòu)式1為：nr2-ph-cooh或nr2-ph-ch2-cooh，其中，r基團選自h，-ch3，-ch2ch3，-ch2ch2ch3，-ch(ch3)2等碳鏈長度少于3的烷烴取代基團，ph為苯環(huán)。

4、按上述方案，所述的化學(xué)衍生劑為4-二乙基氨基苯甲酸、4-二甲基氨基苯乙酸、4-氨基苯甲酸、4-二甲基氨基苯甲酸或3-二甲基氨基苯甲酸等。

5、按上述方案，所述的化學(xué)衍生試劑優(yōu)選為3-二甲基氨基苯甲酸或4-二甲基氨基苯甲酸。更佳地，優(yōu)選為3-二甲基氨基苯甲酸。3-二甲基氨基苯甲酸或4-二甲基氨基苯甲酸不僅引入易電離的叔胺基團，而且增加疏水基團苯環(huán)，使n，n-二甲基苯甲酸衍生的1,3-甘油二酯類化合物的質(zhì)譜靈敏度提高、液相分離度改善、分離時間縮短。與未衍生的1,3-甘油二酯相比，化學(xué)衍生后甘油二酯的定量或定性母離子為[m+h]+或[m+nh4]+，離子易帶電荷、裂解效率高。進而基于n，n-二甲基苯甲酸甘油二酯衍生物離子裂解規(guī)律的解析，利用n，n-二甲基苯甲酸基團的裂解碎片能夠作為定性和/或定量離子，即化學(xué)衍生劑在裂解過程中產(chǎn)品的取代氨基苯基甲酸基團碎片離子，化學(xué)衍生劑為3-二甲基氨基苯甲酸或4-二甲基氨基苯甲酸時，通常是取代氨基苯甲酰基離子[c9h10no]·或取代氨基苯基離子[c8h13n]·，取代氨基苯基酸甘油酯衍生物定性和/或定量離子碎片取代氨基苯甲酰基離子[c9h10no]·或取代氨基苯基離子[c8h13n]·的強度明顯高于未衍生的甘油二酯及芳香酸的衍生物。

6、按上述方案，所述質(zhì)譜分析或液相色譜-質(zhì)譜分析使用正離子模式，定量或定性母離子為[m+h]+或[m+nh4]+，子離子為化學(xué)衍生劑衍生后的甘油二酯類衍生物在裂解過程中產(chǎn)生的碎片離子。如化學(xué)衍生劑為3-二甲基氨基苯甲酸或4-二甲基氨基苯甲酸時，對應(yīng)的子離子為[c9h10no]·或[c8h13n]·。

7、本發(fā)明的化學(xué)衍生劑在溫和衍生條件下酯化活性強，能夠用于甘油二酯類化合物液相色譜質(zhì)譜檢測前的衍生化處理(甘油二酯的羥基與化學(xué)衍生劑中的羧基進行偶聯(lián)酯化，脫一分子水并形成酯鍵)，可提升特異性離子碎裂的質(zhì)譜響應(yīng)豐度，配合甘油二酯類物質(zhì)衍生物在正離子模式下易帶電荷，質(zhì)譜響應(yīng)的信號明顯高于負離子模式，基于衍生劑衍生后的甘油二酯類衍生化合物[m+h]+或[m+nh4]+為母離子，甘油二酯類物質(zhì)衍生物在裂解過程中產(chǎn)品的碎片離子為子離子，實現(xiàn)甘油二酯化合物的定量和/或定向分析檢測，操作簡便。

8、在此基礎(chǔ)上本發(fā)明進一步提供了一種樣品中甘油二酯類物質(zhì)的檢測方法，樣品經(jīng)本發(fā)明的化學(xué)衍生劑通過化學(xué)衍生如通過將植物油樣品中的甘油二酯類物質(zhì)等摩爾比轉(zhuǎn)化為n,n-取代苯甲酸甘油二酯類化合物，經(jīng)uhplc-ms/ms上機檢測，選擇n,n-取代苯甲酸甘油二酯類化合物[m+h]+或[m+nh4]+作為母離子，其特異性離子作為定量離子對甘油二酯含量進行分析，所述特異性離子是指被3-二甲基氨基苯甲酸衍生的甘油二酯在質(zhì)譜裂解時產(chǎn)生的3-二甲基氨基苯甲酸的碎片離子，具有操作簡便、靈敏度高、檢測通量大、適用于基質(zhì)類型多等優(yōu)點，實現(xiàn)了復(fù)雜油脂樣品中甘油二酯類分析物同步定量檢測。

9、本發(fā)明進一步提供一種植物油樣品中甘油二酯類物質(zhì)的檢測方法，主要步驟包括：(1)植物油樣品前處理，(2)使用上述結(jié)構(gòu)式1所述的化學(xué)衍生劑對樣品進行化學(xué)衍生處理，(3)化學(xué)衍生處理后基于質(zhì)譜分析或液相色譜-質(zhì)譜分析進行甘油二酯類物質(zhì)的分析。

10、按上述方案，所述的化學(xué)衍生為甘油二酯的羥基與結(jié)構(gòu)式1所述的化學(xué)衍生劑進行偶聯(lián)酯化，化學(xué)衍生條件為小分子化合物偶聯(lián)酯化條件，衍生化學(xué)官能團是甘油二酯的羥基，偶聯(lián)酯化用催化劑可選擇4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine，dmap)，酯化偶聯(lián)劑可選擇1-乙基-(3-二氨基丙基)碳酰二亞胺(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide?hydrochloride，edc)。

11、按上述方案，上述偶聯(lián)酯化的反應(yīng)溶劑為乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、異丙醇或二氯甲烷等，反應(yīng)溫度為70～80℃。

12、按上述方案，上述檢測分析過程為選擇n,n-取代苯甲酸甘油二酯類化合物[m+h]+或[m+nh4]+作為母離子，其特異性離子作為定量離子對甘油二酯含量進行分析，所述特異性離子是指被3-二甲基氨基苯甲酸衍生的甘油二酯在質(zhì)譜裂解時產(chǎn)生的3-二甲基氨基苯甲酸的碎片離子。

13、按上述方案，所述的植物油樣品為菜籽油、大豆油、花生油、玉米油、亞麻籽油、橄欖油等植物油及以上述植物油為原料制成的甘油二酯油。

14、按上述方案，所述的甘油二酯類化合物包括1,3-甘油二酯及1,2-甘油二酯；所述1,3-甘油二酯包括1-棕櫚酸-3-硬脂酸甘油二酯、1-棕櫚酸-3-油酸甘油二酯、1-棕櫚酸-3-亞油酸甘油二酯、1-棕櫚酸-3-亞麻酸甘油二酯、1-硬脂酸-3-油酸甘油二酯、1-亞油酸-3-亞麻酸甘油二酯、1,3-二棕櫚酸甘油二酯、1,3-二硬脂酸甘油二酯、1,3-二油酸甘油二酯、1,3-二亞油酸甘油二酯、1,3-二亞麻酸甘油二酯、1,3-十一碳烯酸甘油二酯、1,3-十二碳烯酸甘油二酯、1,3-十三烷酸甘油二酯、1,3-十四烷酸甘油二酯、1,3-十四碳烯酸甘油二酯、1,3-十五烷酸甘油二酯、1,3-十七烷酸甘油二酯、1,3-十七碳烯酸甘油二酯、1,3-二十烷酸甘油二酯、1,3-二十一烷酸甘油二酯、1-肉豆蔻酸-3-月桂酸甘油二酯、1-肉豆蔻酸-3-二十二烷酸甘油二酯、1-肉豆蔻酸-3-油酸甘油二酯、1-棕櫚酸-3-二十烷酸甘油二酯、1-硬脂酸-3-二十烷酸甘油二酯、1-油酸-3-二十烷酸甘油二酯；所述1,2-甘油二酯包括1-肉豆蔻酸-2-月桂酸甘油二酯、1-棕櫚酸-2-月桂酸甘油二酯、1,2-棕櫚酸甘油二酯、1-棕櫚酸-2-硬脂酸甘油二酯、1-油酸-2-棕櫚酸甘油二酯、1,2-二油酸甘油二酯、1-油酸-2-棕櫚酸甘油二酯、1-硬脂酸-2-月桂酸甘油二酯、1,2-硬脂酸甘油二酯、1,2-十七烷酸甘油二酯。

15、按上述方案，步驟(3)為uhplc-ms/ms定量檢測甘油二酯的方法。本發(fā)明使用uhplc-ms/ms分析時，分析條件具體可為：流動相為0.1％甲酸乙腈和0.1％甲酸溶液，梯度程序洗脫，色譜分離柱為c18(100×2.1mm，3.0μm)，流速：250μl/min；質(zhì)譜分析條件：三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀，esi離子源，正離子模式，定量母離子為[m+h]+或[m+nh4]+，子離子為化學(xué)衍生劑衍生后的甘油二酯類衍生物在裂解過程中產(chǎn)生的碎片離子。

16、本發(fā)明的有益效果：

17、本發(fā)明中使用氨基苯基酸化合物作化學(xué)衍生試劑在溫和衍生條件下酯化活性強，用于甘油二酯類物質(zhì)衍生，經(jīng)衍生化處理，將樣品中的甘油二酯類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為n,n-取代苯基酸甘油二酯類化合物，可用于甘油二酯類物質(zhì)的檢測，檢測靈敏度高、檢測通量大；適用于基質(zhì)類型多等優(yōu)點。

18、本發(fā)明中氨基苯基酸化合物與甘油二酯的羥基發(fā)生酯化反應(yīng)，特異性強、條件溫和、衍生化效率高，收率高，有利于減少樣品中的脂質(zhì)成分對質(zhì)譜檢測造成的基質(zhì)干擾。

19、本發(fā)明采用化學(xué)衍生增敏，提高質(zhì)譜響應(yīng)，改善分離度，建立了甘油二酯檢測分析方法，由此建立的甘油二酯uhplc-ms/ms檢測方法，能適用于復(fù)雜油脂基質(zhì)樣品甘油二酯的定性和/或定量檢測，對于明確食用植物油甘油二酯組成及含量分布，精準(zhǔn)評價甘油二酯的營養(yǎng)功能具有重要意義。

20、本發(fā)明提供的植物油樣品中甘油二酯類化合物的檢測分析方法，經(jīng)化學(xué)衍生將甘油二酯類物質(zhì)等摩爾比轉(zhuǎn)化為n,n-取代苯基酸甘油二酯類化合物，可實現(xiàn)基線分離、無雜質(zhì)峰干擾。不僅能夠提高質(zhì)譜離子化效率，實現(xiàn)甘油二酯類化合物的檢測，提高甘油二酯類化合物的檢測靈敏度，同時還提高了甘油二酯類化合物的檢測通量。由此結(jié)合uhplc-ms/ms技術(shù)能夠快速精準(zhǔn)定量分析樣品中甘油二酯類化合物的含量，包括菜籽油、大豆油、花生油、玉米油、亞麻籽油、橄欖油等植物油及以上述植物油為原料制成的甘油二酯油，具有操作簡便、靈敏度高、檢測通量大，適用于油脂基質(zhì)類型多等優(yōu)點。