本發(fā)明涉及水環(huán)境中痕(微)量有機(jī)污染物檢測(cè)分析技術(shù)，尤其是涉及一種同時(shí)富集檢測(cè)飲用水中酚類(lèi)、雌激素類(lèi)和雄激素類(lèi)內(nèi)分泌干擾物的方法。

背景技術(shù)：

內(nèi)分泌干擾物(endocrinedisruptingchemicals，即edcs)，也稱(chēng)為環(huán)境激素，是一種外源性干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的化學(xué)物質(zhì)，其在環(huán)境中的存在能干擾人類(lèi)或動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)諸環(huán)節(jié)并導(dǎo)致異常效應(yīng)。雖然edcs并不直接作為有毒物質(zhì)給生物體帶來(lái)異常影響，但可通過(guò)攝入、積累等各種途徑對(duì)生物體產(chǎn)生作用，即使數(shù)量極少，也能讓生物體的內(nèi)分泌失衡，出現(xiàn)種種異?，F(xiàn)象，包括致使動(dòng)物體和人體生殖器障礙、行為異常、生殖能力下降、幼體死亡，嚴(yán)重者甚至?xí)斐晌锓N滅絕。目前，有關(guān)檢測(cè)環(huán)境水體中內(nèi)分泌干擾物殘留的分析方法已經(jīng)引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注，并對(duì)此進(jìn)行了深入研究。

以下幾種edcs是目前最常見(jiàn)最受關(guān)注的edcs：雙酚a(bpa)、雙酚s(bps)、壬基酚(np)、雌酮(e1)、雌二醇(e2)、雌三醇(e3)、乙炔雌二醇(ee2)、己烯雌酚(des)、群勃龍(tren)、睪酮(tes)和甲基睪酮(me-tes)。其中部分edcs不僅在水源水中含量和檢出頻率都很高，而且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，常規(guī)水處理工藝難以有效去除，致使其在龍頭水中也被普遍檢出，如bpa和np等【benotti,m.j.,etal.pharmaceuticalsandendocrinedisruptingcompoundsinu.s.drinkingwater[j].environmentalscience&technology,2009,43,597-603】。因此，建立針對(duì)這些edcs的簡(jiǎn)便精確的檢測(cè)分析方法是對(duì)其開(kāi)展有效控制的基礎(chǔ)和前提。

雖然目前國(guó)內(nèi)外在edcs檢測(cè)分析方法上已開(kāi)展諸多研究，但多數(shù)檢測(cè)方法只能針對(duì)某一類(lèi)分子結(jié)構(gòu)相同的edcs，如酚類(lèi)或雌激素類(lèi)等，難以做到更大范圍的多類(lèi)型edcs同時(shí)檢測(cè)。如中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)cn104977382a公開(kāi)了同時(shí)測(cè)定水環(huán)境中6種痕量酚類(lèi)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的分析方法。所述方法采用sep-pak-c18固相萃取小柱富集酚類(lèi)edcs，并以甲醇-水溶液淋洗小柱，用二氯甲烷洗脫富集的酚類(lèi)edcs至試劑小瓶中，經(jīng)氮?dú)鉂饪s后，加入bstfa和吡啶進(jìn)行衍生化反應(yīng)，最后利用gc-ms測(cè)定環(huán)境水樣中的痕量酚類(lèi)edcs。雖然該方法通過(guò)衍生化反應(yīng)，能夠改善色譜峰型，降低檢測(cè)限，提高gc-ms分析的靈敏度和準(zhǔn)確度，但只能檢測(cè)酚類(lèi)edcs而不適用于其他類(lèi)型edcs，且衍生化反應(yīng)也增加了前處理的步驟和操作時(shí)間。

中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)cn102175792a公開(kāi)了一種水環(huán)境中雌激素及壬基酚、辛基酚(op)和雙酚a的共檢測(cè)方法。所述方法涉及一種水環(huán)境中edcs的檢測(cè)技術(shù)，特別是涉及一種采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)水環(huán)境樣品中e1、e2、e3、ee2、np、op和bpa等7種物質(zhì)的共檢測(cè)方法。該方法采用固相萃取柱濃縮富集水樣品中的雌激素、np、op和bpa，采用乙酸乙酯將雌激素、np、op和bpa從固相萃取柱上洗脫下來(lái)，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析雌激素、np、op和bpa的濃度。該方法較上一種方法擴(kuò)大了檢測(cè)范圍，能夠同時(shí)分析檢測(cè)水體樣品中酚類(lèi)和雌激素類(lèi)的濃度，但就水環(huán)境中存在的edcs種類(lèi)而言，其檢測(cè)范圍仍有待提高。

中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)cn102636611a公開(kāi)了一種復(fù)雜基質(zhì)水體樣品中雌激素及壬基酚、辛基酚、雙酚a的共檢測(cè)方法。所述方法涉及一種水環(huán)境中edcs的檢測(cè)技術(shù)，特別是涉及一種采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)復(fù)雜基質(zhì)水體樣品中e1、e2、e3、ee2、np、op和bpa定量分析的技術(shù)。該方法將采集好的水體樣品，采用hlb固相萃取小柱富集并用甲醇洗脫，再將洗脫液氮吹干，用florisil固相萃取柱凈化，最后利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析。該方法環(huán)境友好、易于操作、且回收率較高，能夠快速分析復(fù)雜基質(zhì)水體樣品中痕量存在的e1、e2、e3、ee2、np、op和bpa，較前一種方法抗背景基質(zhì)干擾能力有所提高。

但是，目前水環(huán)境中關(guān)注較多的除了酚類(lèi)和雌激素類(lèi)edcs，還有多種雄激素類(lèi)edcs，如tren、tes、me-tes等，而迄今為止尚未有一種可以同時(shí)檢測(cè)這三大類(lèi)edcs的分析檢測(cè)方法，本發(fā)明方法恰好填補(bǔ)了這一空白，可以實(shí)現(xiàn)一次性定量分析飲用水中酚類(lèi)、雌激素和雄激素三大類(lèi)共11種edcs的濃度，極大提高了檢測(cè)效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種同時(shí)富集檢測(cè)飲用水中酚類(lèi)、雌激素類(lèi)和雄激素類(lèi)內(nèi)分泌干擾物的方法。

本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

一種同時(shí)富集檢測(cè)飲用水中酚類(lèi)、雌激素類(lèi)和雄激素類(lèi)內(nèi)分泌干擾物的方法，包括以下步驟：

(1)樣品預(yù)處理：

取水樣過(guò)濾除去懸浮物，調(diào)ph并加入絡(luò)合劑，再加入內(nèi)標(biāo)物，完成預(yù)處理；

(2)目標(biāo)物edcs濃縮富集：

先對(duì)spe小柱進(jìn)行活化，將步驟(1)預(yù)處理后的水樣過(guò)柱萃取富集，然后取淋洗液淋洗小柱，并真空干燥除去水分，之后繼續(xù)用洗脫溶劑洗脫目標(biāo)物，收集洗脫液，在氮?dú)饬飨麓蹈?，并用有機(jī)溶液定容，最后，將其過(guò)濾轉(zhuǎn)移至棕色進(jìn)樣瓶中待測(cè)；

(3)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制作：

以每種edcs與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物濃度比值為橫坐標(biāo)，以每種edcs定量子離子與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，分別繪制三類(lèi)edcs的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；

(4)儀器分析檢測(cè)：

采用lc-ms/ms分析步驟(2)濃縮富集后的樣品，確定樣品中各目標(biāo)物edcs的定量子離子與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值，結(jié)合步驟(3)繪制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到樣品中各edcs與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物濃度比值，再乘以步驟(1)加入的各內(nèi)標(biāo)物的濃度，即可確定樣品中各edcs的含量。

作為優(yōu)選的實(shí)施方案，目標(biāo)物包括酚類(lèi)、雌激素和雄激素三類(lèi)edcs，其中，酚類(lèi)edcs包括雙酚a(bpa)、雙酚s(bps)和壬基酚(np)，雌激素類(lèi)edcs包括雌酮(e1)、雌二醇(e2)、雌三醇(e3)、乙炔雌二醇(ee2)和己烯雌酚(des)，雄激素類(lèi)edcs包括群勃龍(tren)、睪酮(tes)和甲基睪酮(me-tes)。

作為優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟(1)中的預(yù)處理過(guò)程中：

過(guò)濾采用孔徑為0.7μm的玻璃纖維膜作為濾膜，ph值調(diào)節(jié)為5.0，絡(luò)合劑選用na2edta，酚類(lèi)edcs的內(nèi)標(biāo)物選用200μg/l的雙酚a-d16(bpa-d16)，雌性激素edcs的內(nèi)標(biāo)物選用200μg/l的雌二醇-d2(e2-d2)，雄性激素edcs的內(nèi)標(biāo)物選用100μg/l的睪酮-d3(tes-d3)。

其中，優(yōu)選ph值可保證前處理中目標(biāo)edcs的高回收率，優(yōu)選絡(luò)合劑可保證掩蔽水中ca²⁺、mg²⁺等干擾，內(nèi)標(biāo)物的投加用于指示前處理操作過(guò)程中的回收率和排除儀器分析誤差，其種類(lèi)和投加量的優(yōu)選確保了內(nèi)標(biāo)物不干擾目標(biāo)edcs且出峰效果良好。

作為優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟(2)的目標(biāo)物濃縮富集過(guò)程中：

spe小柱選用oasishlb固相萃取小柱，并用5-10ml等體積的甲醇、超純水和稀鹽酸溶液依次通過(guò)spe小柱進(jìn)行活化，進(jìn)行富集濃縮的水樣體積為500ml，淋洗液選用5％的甲醇/水溶液(v/v)，真空干燥時(shí)間定為20min，溫度為25℃，洗脫溶劑選用10ml乙酸乙酯/甲醇溶液(85％/15％，v/v)，氮?dú)饬鞔蹈蓵r(shí)控制洗脫液的水浴溫度為35℃，有機(jī)溶液采用50％甲醇/水溶液(v/v)，定容后過(guò)濾轉(zhuǎn)移時(shí)采用0.22μmptfe針式過(guò)濾器過(guò)濾。

其中，優(yōu)選萃取柱類(lèi)型可保證目標(biāo)edcs的良好富集度和回收率，優(yōu)選活化方式可最大程度提高萃取柱內(nèi)填料對(duì)目標(biāo)edcs的吸附和洗脫效果、提高回收率，優(yōu)選淋洗方式可在最大限度減少目標(biāo)edcs流失的同時(shí)除去萃取柱填料內(nèi)的雜志、減少后續(xù)檢測(cè)的干擾，優(yōu)選洗脫方式可確保將萃取柱上富集的目標(biāo)edcs最大限度洗脫下來(lái)、提高目標(biāo)物的回收率，優(yōu)選氮吹方式可保證洗脫溶劑快速揮發(fā)的同時(shí)最大限度減少目標(biāo)edcs的損失，優(yōu)選有機(jī)溶液可保證氮?dú)獯蹈珊蟾街谌萜鞅谏系哪繕?biāo)edcs完全溶解混合、便于后續(xù)儀器進(jìn)樣分析。

作為優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟(3)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制包括以下具體步驟：

(a)配制混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：用50％甲醇/水溶液(v/v)將已知濃度的三類(lèi)edcs混合配制成單種edcs濃度分別相同的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于棕色試劑瓶中；

(b)用50％甲醇/水溶液(v/v)將步驟(a)中混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋為不同濃度梯度的樣品，同時(shí)向各濃度梯度樣品中加入200μg/lbpa-d16，200μg/le2-d2和100μg/ltes-d3三種內(nèi)標(biāo)物；

(c)采用lc-ms/ms對(duì)各濃度梯度樣品進(jìn)行分析，以每種edcs與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物濃度比值為橫坐標(biāo)，以每種edcs的定量子離子與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物峰定量子離子峰面積比值為縱坐標(biāo)，即可繪制三類(lèi)edcs的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

其中，定量子離子峰面積的確定方法為：1)用全掃描監(jiān)測(cè)模式(scan)確定目標(biāo)物母離子(m/z)；2)用選擇離子監(jiān)測(cè)模式(sim)確保目標(biāo)物母離子以最佳狀態(tài)進(jìn)入碰撞室；3)用子離子掃描模式(productscan)模式篩選母離子破裂后響應(yīng)度最大的特征子離子(m/z)；4)用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(mrm)記錄以母離子和特征子離子為離子對(duì)的目標(biāo)物峰面積。

作為上述優(yōu)選的實(shí)施方案的更優(yōu)選，步驟(b)中，不同濃度梯度的樣品包括1μg/l、5μg/l、10μg/l、20μg/l、50μg/l、100μg/l、200μg/l、500μg/l和1000μg/l的樣品。

作為優(yōu)選的實(shí)施方案，所述lc-ms/ms的運(yùn)行參數(shù)為：

液相色譜運(yùn)行參數(shù)為：

有機(jī)流動(dòng)相為含0-5mm乙酸銨的甲醇和乙腈混合溶液(甲醇/乙腈＝1：1，v/v)，水相為0-5mm的乙酸銨水溶液，梯度洗脫程序：0到6min，70％的水相流動(dòng)相線性降低到5％并保持6min，在13min時(shí)回到70％并保持5min，進(jìn)樣流速為0.25-0.45ml/min，進(jìn)樣體積為5-20μl；

質(zhì)譜的運(yùn)行參數(shù)為：

采用正電噴霧電離源(esi+)和負(fù)電噴霧電離源(esi-)，其中，bpa、bps、np、e1、e2、e3、ee2、des、bpa-d16和e2-d2采用esi-模式，tren、tes、me-tes和tes-d3采用esi+模式；干燥氣溫度為350℃；氣體流為11l/min；正電離模式毛細(xì)管電壓4000v；負(fù)電離模式毛細(xì)管電壓3000v；霧化器壓力為15psi；在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(mrm)模式下，通過(guò)母離子和子離子兩個(gè)特征離子，對(duì)目標(biāo)edcs進(jìn)行定量分析，其中，bpa、bps、np、e1、e2、e3、ee2、des、tren、tes、me-tes、bpa-d16、e2-d2和tes-d3的碎裂電壓(v)/碰撞能(ev)分別為120/30、153/33、111/30、161/37、192/59、138/62、169/69、134/31、137/25、135/27、135/28、125/30、169/56和152/27。

作為上述優(yōu)選實(shí)施方案的更優(yōu)選，所述的液相色譜運(yùn)行時(shí)，有機(jī)相與水相中乙酸銨濃度為2mm，進(jìn)樣流速為0.35ml/min，進(jìn)樣體積為10μl。所述的質(zhì)譜檢測(cè)運(yùn)行參數(shù)中，bpa、bps、np、e1、e2、e3、ee2、des八種edcs及bpa-d16、e2-d2兩種內(nèi)標(biāo)物采用esi-電離模式檢測(cè)，tren、tes、me-tes三種edcs及tes-d3內(nèi)標(biāo)物采用esi+電離模式檢測(cè)。

上述lc-ms/ms的檢測(cè)分析中，液相色譜有機(jī)流動(dòng)相通過(guò)對(duì)比甲醇、乙腈以及甲醇與乙腈的混合溶液(1：1，v/v)的色譜分離效果而確定，選取出峰分離度佳、峰形好、響應(yīng)度高的有機(jī)溶劑為最佳有機(jī)流動(dòng)相。液相色譜水相流動(dòng)相的選取，是在最佳有機(jī)流動(dòng)相基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)比不同濃度乙酸銨溶液的色譜分離效果而確定，選取出峰分離度佳、峰形好、響應(yīng)度高的乙酸銨濃度為最佳水相。進(jìn)樣流速的選擇通過(guò)對(duì)比0.25、0.35、0.45ml/min三種不同流速的出峰情況而確定，綜合考慮11種目標(biāo)edcs和3種內(nèi)標(biāo)物的出峰分離度、峰形、響應(yīng)度和保留時(shí)間來(lái)選取最佳流速。

本發(fā)明通過(guò)對(duì)樣品前處理濃縮富集和lc-ms/ms儀器檢測(cè)條件和參數(shù)的探索和優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了飲用水中痕(微)量典型酚類(lèi)、雌激素和雄激素三類(lèi)edcs的同時(shí)富集檢測(cè)，避免了不同類(lèi)型edcs單獨(dú)分析檢測(cè)的繁瑣，大大節(jié)省了測(cè)樣時(shí)間，降低了檢測(cè)成本。在前處理過(guò)程中，通過(guò)對(duì)內(nèi)標(biāo)物投加量、固相萃取柱填料、水樣ph、萃取體積和洗脫溶劑的選擇和優(yōu)化，綜合提高了三類(lèi)不同edcs的回收率，并改善了后續(xù)檢測(cè)中不同edcs和內(nèi)標(biāo)物的出峰情況；在儀器分析檢測(cè)過(guò)程中，通過(guò)對(duì)液相色譜進(jìn)樣條件及質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)的優(yōu)化，確保了三類(lèi)目標(biāo)edcs和三種內(nèi)標(biāo)物的峰形和分離度，從而獲得了較低的檢出限和較小的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)選擇oasishlb固相萃取柱對(duì)三大類(lèi)共11種edcs進(jìn)行富集純化，回收率高而穩(wěn)定，選擇性強(qiáng)，吸附容量大，達(dá)到了對(duì)目標(biāo)物有效分離富集的目的，實(shí)現(xiàn)了多類(lèi)型edcs的同時(shí)富集檢測(cè)。

(2)采用lc-ms/ms進(jìn)行定量分析檢測(cè)，靈敏度高，三類(lèi)edcs的檢出限均低于2ng/l，定量限均低于5ng/l，能夠滿(mǎn)足對(duì)飲用水中痕量?jī)?nèi)edcs的檢測(cè)要求。此外，串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀根據(jù)由對(duì)應(yīng)母離子碰撞產(chǎn)生的特征碎片離子進(jìn)行定量分析，選擇性強(qiáng)，排除了樣品中其他雜質(zhì)信號(hào)的干擾。

(3)采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定edcs的濃度，線性關(guān)系好，相對(duì)偏差小，提高了分析的精密度。

(4)前處理過(guò)程操作簡(jiǎn)單，環(huán)境友好。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的分析流程示意圖；

圖2為不同spe填料對(duì)目標(biāo)物回收率的影響；

圖3為不同水樣ph值對(duì)目標(biāo)物回收率的影響；

圖4為不同萃取體積對(duì)目標(biāo)物回收率的影響；

圖5為不同洗脫溶劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響；

圖6為三類(lèi)目標(biāo)物edcs的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/l)的總離子流圖

圖7為三類(lèi)目標(biāo)物edcs及相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的提取色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

采用如圖1所示的分析方法流程，對(duì)飲用水中酚類(lèi)、雌激素類(lèi)和雄激素類(lèi)內(nèi)分泌干擾物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，具體包括樣品前處理優(yōu)化、檢測(cè)方法優(yōu)化和運(yùn)行測(cè)定效果檢驗(yàn)三部分。

樣品前處理優(yōu)化包括spe填料、最佳ph、萃取體積和洗脫溶劑的確定。

檢測(cè)方法中各條件優(yōu)化包括液相色譜條件優(yōu)化和質(zhì)譜運(yùn)行參數(shù)優(yōu)化。

具體步驟如下：

1.樣品前處理

1.1spe填料的確定

固相萃取柱的選擇取決于柱填料與目標(biāo)物上官能團(tuán)的相互作用，由于本發(fā)明涉及物理化學(xué)性質(zhì)不同的三大類(lèi)edcs的分離富集與檢測(cè)，為實(shí)現(xiàn)每種edcs富集效率最大化，本發(fā)明根據(jù)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)選擇了四種不同柱填料(poly-serymcx、isolutec18、cleanertpep和oasishlb)的萃取效果，結(jié)果見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在四種spe柱中，經(jīng)過(guò)oasishlb固相萃取柱富集時(shí)，有更多的目標(biāo)edcs的萃取回收率位于或接近80％-120％范圍，可實(shí)現(xiàn)對(duì)三類(lèi)edcs的有效富集且滿(mǎn)足環(huán)境樣品加標(biāo)回收率的控制限要求。因此，可確定更佳的spe填料為oasishlb。

1.2最佳ph的確定

由于目標(biāo)edcs多為含酚羥基的弱酸性化合物，故本發(fā)明選擇水樣ph為3.0、5.0、7.0進(jìn)行優(yōu)化，分別代表強(qiáng)酸性條件，弱酸性條件，中性條件，結(jié)果見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：ph為5.0時(shí)，有更多的目標(biāo)內(nèi)分泌干擾物的萃取回收率在80％-120％范圍內(nèi)，因此本發(fā)明選擇ph值為5.0的水樣條件完成對(duì)目標(biāo)edcs的萃取和富集。

1.3萃取體積的確定

載樣量過(guò)大或目標(biāo)物濃度過(guò)高均可導(dǎo)致固相萃取過(guò)程中穿透現(xiàn)象的發(fā)生，萃取體積宜在保證固相萃取小柱不發(fā)生穿透的前提下盡量提高富集倍數(shù)。本發(fā)明選擇純水加標(biāo)濃度100ng/l(保守估計(jì)飲用水中可能存在的最大濃度)，分別采用水樣體積為250ml，500ml和1000ml進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，每個(gè)萃取體積條件均設(shè)置三個(gè)平行樣，不同萃取體積下的回收率見(jiàn)圖4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：目標(biāo)物回收率并未隨萃取體積的增加而增加，萃取體積為500ml時(shí)，更多目標(biāo)物萃取回收率位于或接近80％-120％范圍。此外，考慮到實(shí)際采樣時(shí)用玻璃瓶采樣，若是萃取體積大，則更會(huì)加大采樣難度，因此本發(fā)明選擇萃取體積為500ml。

1.4洗脫溶劑的確定

為了保證目標(biāo)物能最大程度的被洗脫下來(lái)，本發(fā)明考察了不同洗脫溶劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。洗脫溶劑分別有甲醇，乙腈，乙酸乙酯：甲醇(85％:15％,v/v)。乙酸乙酯的極性很弱，為了能洗脫下來(lái)目標(biāo)物，需要在乙酸乙酯中加入一定體積的醇，結(jié)果見(jiàn)圖5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)洗脫溶劑為乙腈時(shí)，洗脫時(shí)間最短，但目標(biāo)物的回收率最低；當(dāng)洗脫溶劑為乙酸乙酯：甲醇(85％:15％,v/v)混合溶劑時(shí)，洗脫時(shí)間最長(zhǎng)，目標(biāo)物的回收率最高，并且符合定量要求；當(dāng)洗脫溶劑為甲醇時(shí)，洗脫時(shí)間和目標(biāo)物的回收率位于前兩者之間。并且在之后的氮吹過(guò)程中，乙酸乙酯與甲醇的混合洗脫溶劑最快被吹干，比另外兩種洗脫液的氮吹時(shí)間都短，可加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。因此本發(fā)明選擇洗脫溶劑為乙酸乙酯：甲醇(85％:15％,v/v)混合溶劑。

2.檢測(cè)方法優(yōu)化

2.1液相色譜條件優(yōu)化

為了實(shí)現(xiàn)色譜峰分離并提高信號(hào)強(qiáng)度，本發(fā)明對(duì)流動(dòng)相、流速、進(jìn)樣量及梯度洗脫程序等影響液相分離的關(guān)鍵因素分別做了優(yōu)化。本發(fā)明采用的液相色譜檢測(cè)條件如下：

流動(dòng)相a：2mm乙酸銨溶液；流動(dòng)相b：含2mm乙酸銨的甲醇和乙腈混合溶液(甲醇/乙腈＝1：1，v/v)；流速：0.35ml/min；進(jìn)樣量：10μl；柱溫：35℃；梯度洗脫程序：0到6min，70％的a流動(dòng)相線性降低到5％并保持6min，在13min時(shí)回到70％并保持5min。

2.2質(zhì)譜運(yùn)行參數(shù)優(yōu)化

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀能夠利用特征碎片離子準(zhǔn)確定量，為此，需要優(yōu)化碎裂電壓和碰撞能，以獲得最佳分子離子-碎片離子對(duì)，使后續(xù)對(duì)實(shí)際水樣的檢測(cè)分析更加精確。本發(fā)明采用的質(zhì)譜運(yùn)行參數(shù)如下：

電離方式：esi+和esi-；干燥氣溫度：350℃；氣體流速：11l/min；毛細(xì)管電壓：4000v(esi+)、3000v(esi-)；霧化器壓力：15psi。

本發(fā)明選用bpa-d16,e2-d2和tes-d3分別作為酚類(lèi)、雌激素類(lèi)和雄激素類(lèi)edcs的內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法定量。內(nèi)標(biāo)物與目標(biāo)物在相同的色譜時(shí)間段被洗脫，且在電噴霧電離源模式下響應(yīng)良好無(wú)明顯基質(zhì)干擾。因此，上述內(nèi)標(biāo)物是本發(fā)明中十分理想的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。三類(lèi)edcs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的總離子流圖和提取色譜圖分別見(jiàn)圖6和圖7。此外，除了采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線外，串聯(lián)質(zhì)譜儀利用信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度最大的特征碎片離子作為定量離子，各物質(zhì)的定量離子見(jiàn)表1。

表1

實(shí)施例1

一種同時(shí)富集檢測(cè)飲用水中酚類(lèi)、雌激素類(lèi)和雄激素類(lèi)內(nèi)分泌干擾物的方法，其標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制作具體步驟如下：

(a)配制混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：用50％甲醇/水溶液(v/v)將已知濃度的三類(lèi)edcs混合配制成單種edcs濃度分別相同的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于棕色試劑瓶中；

(b)用50％甲醇/水溶液(v/v)將步驟(a)中混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋為不同濃度梯度：1μg/l、5μg/l、10μg/l、20μg/l、50μg/l、100μg/l、200μg/l、500μg/l和1000μg/l，同時(shí)向各濃度梯度樣品中加入200μg/lbpa-d16，200μg/le2-d2和100μg/ltes-d3三種內(nèi)標(biāo)物；

(c)采用lc-ms/ms對(duì)各濃度梯度樣品進(jìn)行分析，采用上述優(yōu)化后的液相色譜運(yùn)行參數(shù)和質(zhì)譜運(yùn)行參數(shù)運(yùn)行l(wèi)c-ms/ms，以每種edcs與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物濃度比值為橫坐標(biāo)，以分析得出的每種edcs定量子離子與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，分別繪制三類(lèi)edcs的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

方法檢出限與方法定量限通過(guò)信噪比(signal-to-noise，s/n)來(lái)計(jì)算，以3倍信噪比為方法檢出限(limitofdetection，lod)，10倍信噪比為方法定量限(limitofquantitation，loq)。本方法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限結(jié)果列于表2。

表2

結(jié)果表明目標(biāo)物質(zhì)在優(yōu)化的儀器條件下線性相關(guān)性良好，線性相關(guān)系數(shù)r²>0.98。目標(biāo)物質(zhì)的方法檢出限范圍為0.01-1.36ng/l，方法定量限范圍為0.03-4.53ng/l，低濃度水平的檢出限與定量限保證了該分析方法檢測(cè)水環(huán)境中痕量edcs的可能性。

實(shí)施例2

一種同時(shí)富集檢測(cè)飲用水中酚類(lèi)、雌激素類(lèi)和雄激素類(lèi)內(nèi)分泌干擾物的方法，包括以下步驟：

(1)樣品預(yù)處理：

選取華東地區(qū)某水源地水樣，采用0.7μm的玻璃纖維膜作為濾膜過(guò)濾除去懸浮物，調(diào)ph為5.0并加入絡(luò)合劑na2edta，再加入已知量的三類(lèi)內(nèi)標(biāo)物：200μg/l的bpa-d16、200μg/l的e2-d2和100μg/l的tes-d3，完成預(yù)處理；

(2)目標(biāo)物edcs濃縮富集：

先用5-10ml等體積的甲醇、超純水和稀鹽酸溶液依次通過(guò)spe小柱(oasishlb固相萃取小柱)進(jìn)行活化，再取500ml步驟(1)預(yù)處理后的水樣過(guò)柱萃取富集，然后取5％的甲醇/水溶液(v/v)作為淋洗液淋洗小柱，并真空干燥20min除去水分，之后繼續(xù)用10ml乙酸乙酯/甲醇溶液(85％/15％，v/v)作為洗脫溶劑洗脫目標(biāo)物，收集洗脫液，控制其水浴溫度為35℃，在氮?dú)饬飨麓蹈?，并?0％甲醇/水溶液(v/v)溶解殘留物并定容，最后，將其采用0.22μmptfe針式過(guò)濾器過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至棕色進(jìn)樣瓶中待測(cè)；

(3)儀器分析檢測(cè)：

采用lc-ms/ms分析步驟(2)濃縮富集后的樣品，設(shè)置液相色譜運(yùn)行參數(shù)為：有機(jī)流動(dòng)相為含2mm乙酸銨的甲醇和乙腈混合溶液(甲醇/乙腈＝1：1，v/v)，水相為2mm的乙酸銨水溶液，梯度洗脫程序：0到6min，70％的水相流動(dòng)相線性降低到5％并保持6min，在13min時(shí)回到70％并保持5min，進(jìn)樣流速為0.35ml/min，進(jìn)樣體積為10μl；質(zhì)譜的運(yùn)行參數(shù)為：采用正電噴霧電離源(esi+)和負(fù)電噴霧電離源(esi-)，干燥氣溫度為350℃；氣體流為11l/min；正電離模式毛細(xì)管電壓4000v；負(fù)電離模式毛細(xì)管電壓3000v；霧化器壓力為15psi；同時(shí)采用全掃描scan、選擇離子監(jiān)測(cè)(sim)模式、子離子掃描production和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)mrm模式記錄。

根據(jù)lc-ms/ms分析結(jié)果確定樣品中各目標(biāo)物edcs的定量子離子與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值，結(jié)合實(shí)施例1所繪制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到樣品中各edcs與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物濃度比值，再結(jié)合步驟(1)加入的已知的各內(nèi)標(biāo)物的濃度，即可確定樣品中各edcs的含量。

最后，所得飲用水樣品在本實(shí)施例檢測(cè)操作條件下的分析檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：所建方法已成功應(yīng)用于華東地區(qū)某水源水中edcs殘留的分析檢測(cè)，在所有三類(lèi)edcs中，除了bps、des和tren，其他edcs均被檢出(e1濃度低于定量限)，其中np在該水源地的濃度高達(dá)μg/l數(shù)量級(jí)。bpa、e2和ee2也是該水源地主要edcs殘留種類(lèi)。

實(shí)施例3

一種同時(shí)富集檢測(cè)飲用水中酚類(lèi)、雌激素類(lèi)和雄激素類(lèi)內(nèi)分泌干擾物的方法，包括以下步驟：

(1)樣品預(yù)處理：

選取華東地區(qū)某水源地水樣，采用0.7μm的玻璃纖維膜作為濾膜過(guò)濾除去懸浮物，調(diào)ph為5.0并加入絡(luò)合劑na2edta，再加入已知量的三類(lèi)內(nèi)標(biāo)物：200μg/l的bpa-d16、200μg/l的e2-d2和100μg/l的tes-d3，完成預(yù)處理；

(2)目標(biāo)物edcs濃縮富集：

先用5-10ml等體積的甲醇、超純水和稀鹽酸溶液依次通過(guò)spe小柱(oasishlb固相萃取小柱)進(jìn)行活化，再取500ml步驟(1)預(yù)處理后的水樣過(guò)柱萃取富集，然后取5％的甲醇/水溶液(v/v)作為淋洗液淋洗小柱，并真空干燥20min除去水分，之后繼續(xù)用10ml乙酸乙酯/甲醇溶液(85％/15％，v/v)作為洗脫溶劑洗脫目標(biāo)物，收集洗脫液，控制其水浴溫度為35℃，在氮?dú)饬飨麓蹈?，并?0％甲醇/水溶液(v/v)溶解殘留物并定容，最后，將其采用0.22μmptfe針式過(guò)濾器過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至棕色進(jìn)樣瓶中待測(cè)；

(3)儀器分析檢測(cè)：

采用lc-ms/ms分析步驟(2)濃縮富集后的樣品，設(shè)置液相色譜運(yùn)行參數(shù)為：有機(jī)流動(dòng)相為含5mm乙酸銨的甲醇和乙腈混合溶液(甲醇/乙腈＝1：1，v/v)，水相為5mm的乙酸銨水溶液，梯度洗脫程序：0到6min，70％的水相流動(dòng)相線性降低到5％并保持6min，在13min時(shí)回到70％并保持5min，進(jìn)樣流速為0.25ml/min，進(jìn)樣體積為20μl；質(zhì)譜的運(yùn)行參數(shù)為：采用正電噴霧電離源(esi+)和負(fù)電噴霧電離源(esi-)，干燥氣溫度為350℃；氣體流為11l/min；正電離模式毛細(xì)管電壓4000v；負(fù)電離模式毛細(xì)管電壓3000v；霧化器壓力為15psi；同時(shí)采用全掃描scan、選擇離子監(jiān)測(cè)(sim)模式、子離子掃描production和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)mrm模式記錄。

根據(jù)lc-ms/ms分析結(jié)果確定樣品中各目標(biāo)物edcs的定量子離子與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值，結(jié)合實(shí)施例1所繪制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到樣品中各edcs與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物濃度比值，再結(jié)合步驟(1)加入的已知的各內(nèi)標(biāo)物的濃度，即可確定樣品中各edcs的含量。

實(shí)施例4

一種同時(shí)富集檢測(cè)飲用水中酚類(lèi)、雌激素類(lèi)和雄激素類(lèi)內(nèi)分泌干擾物的方法，包括以下步驟：

(1)樣品預(yù)處理：

選取華東地區(qū)某水源地水樣，采用0.7μm的玻璃纖維膜作為濾膜過(guò)濾除去懸浮物，調(diào)ph為5.0并加入絡(luò)合劑na2edta，再加入已知量的三類(lèi)內(nèi)標(biāo)物：200μg/l的bpa-d16、200μg/l的e2-d2和100μg/l的tes-d3，完成預(yù)處理；

(2)目標(biāo)物edcs濃縮富集：

先用5-10ml等體積的甲醇、超純水和稀鹽酸溶液依次通過(guò)spe小柱(oasishlb固相萃取小柱)進(jìn)行活化，再取500ml步驟(1)預(yù)處理后的水樣過(guò)柱萃取富集，然后取5％的甲醇/水溶液(v/v)作為淋洗液淋洗小柱，并真空干燥20min除去水分，之后繼續(xù)用10ml乙酸乙酯/甲醇溶液(85％/15％，v/v)作為洗脫溶劑洗脫目標(biāo)物，收集洗脫液，控制其水浴溫度為35℃，在氮?dú)饬飨麓蹈?，并?0％甲醇/水溶液(v/v)溶解殘留物并定容，最后，將其采用0.22μmptfe針式過(guò)濾器過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至棕色進(jìn)樣瓶中待測(cè)；

(3)儀器分析檢測(cè)：

采用lc-ms/ms分析步驟(2)濃縮富集后的樣品，設(shè)置液相色譜運(yùn)行參數(shù)為：有機(jī)流動(dòng)相為含1mm乙酸銨的甲醇和乙腈混合溶液(甲醇/乙腈＝1：1，v/v)，水相為1mm的乙酸銨水溶液，梯度洗脫程序：0到6min，70％的水相流動(dòng)相線性降低到5％并保持6min，在13min時(shí)回到70％并保持5min，進(jìn)樣流速為0.45ml/min，進(jìn)樣體積為5μl；質(zhì)譜的運(yùn)行參數(shù)為：采用正電噴霧電離源(esi+)和負(fù)電噴霧電離源(esi-)，干燥氣溫度為350℃；氣體流為11l/min；正電離模式毛細(xì)管電壓4000v；負(fù)電離模式毛細(xì)管電壓3000v；霧化器壓力為15psi；同時(shí)采用全掃描scan、選擇離子監(jiān)測(cè)(sim)模式、子離子掃描production和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)mrm模式記錄。

根據(jù)lc-ms/ms分析結(jié)果確定樣品中各目標(biāo)物edcs的定量子離子與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值，結(jié)合實(shí)施例1所繪制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到樣品中各edcs與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物濃度比值，再結(jié)合步驟(1)加入的已知的各內(nèi)標(biāo)物的濃度，即可確定樣品中各edcs的含量。

實(shí)施例5

一種同時(shí)富集檢測(cè)飲用水中酚類(lèi)、雌激素類(lèi)和雄激素類(lèi)內(nèi)分泌干擾物的方法，包括以下步驟：

(1)樣品預(yù)處理：

選取華東地區(qū)某水源地水樣，采用0.7μm的玻璃纖維膜作為濾膜過(guò)濾除去懸浮物，調(diào)ph為5.0并加入絡(luò)合劑na2edta，再加入已知量的三類(lèi)內(nèi)標(biāo)物：200μg/l的bpa-d16、200μg/l的e2-d2和100μg/l的tes-d3，完成預(yù)處理；

(2)目標(biāo)物edcs濃縮富集：

先用5-10ml等體積的甲醇、超純水和稀鹽酸溶液依次通過(guò)spe小柱(oasishlb固相萃取小柱)進(jìn)行活化，再取500ml步驟(1)預(yù)處理后的水樣過(guò)柱萃取富集，然后取5％的甲醇/水溶液(v/v)作為淋洗液淋洗小柱，并真空干燥20min除去水分，之后繼續(xù)用10ml乙酸乙酯/甲醇溶液(85％/15％，v/v)作為洗脫溶劑洗脫目標(biāo)物，收集洗脫液，控制其水浴溫度為35℃，在氮?dú)饬飨麓蹈?，并?0％甲醇/水溶液(v/v)溶解殘留物并定容，最后，將其采用0.22μmptfe針式過(guò)濾器過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至棕色進(jìn)樣瓶中待測(cè)；

(3)儀器分析檢測(cè)：

采用lc-ms/ms分析步驟(2)濃縮富集后的樣品，設(shè)置液相色譜運(yùn)行參數(shù)為：有機(jī)流動(dòng)相為甲醇和乙腈混合溶液(甲醇/乙腈＝1：1，v/v)，水相為水，梯度洗脫程序：0到6min，70％的水相流動(dòng)相線性降低到5％并保持6min，在13min時(shí)回到70％并保持5min，進(jìn)樣流速為0.3ml/min，進(jìn)樣體積為8μl；質(zhì)譜的運(yùn)行參數(shù)為：采用正電噴霧電離源(esi+)和負(fù)電噴霧電離源(esi-)，干燥氣溫度為350℃；氣體流為11l/min；正電離模式毛細(xì)管電壓4000v；負(fù)電離模式毛細(xì)管電壓3000v；霧化器壓力為15psi；同時(shí)采用全掃描scan、選擇離子監(jiān)測(cè)(sim)模式、子離子掃描production和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)mrm模式記錄。

根據(jù)lc-ms/ms分析結(jié)果確定樣品中各目標(biāo)物edcs的定量子離子與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值，結(jié)合實(shí)施例1所繪制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到樣品中各edcs與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物濃度比值，再結(jié)合步驟(1)加入的已知的各內(nèi)標(biāo)物的濃度，即可確定樣品中各edcs的含量。

上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說(shuō)明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。