本發(fā)明涉及一種生化檢測、集成光子芯片，尤其涉及的是一種基于耦合光柵的熒光生物傳感器及檢測方法。

背景技術(shù)：

生物傳感器已經(jīng)成為分析化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域中一個非常重要的研究方向，人們對此做出了深入廣泛的研究。熒光生物傳感是依靠熒光信號為檢測手段，對熒光物質(zhì)的檢測通常借助于熒光的增強、淬滅或者發(fā)射波長的移動，從而能得出熒光信號的轉(zhuǎn)變，熒光傳感器是把和分析物質(zhì)濃度具有的信號轉(zhuǎn)換為熒光信號，實現(xiàn)對目標物的分析。由于熒光檢測方法操作簡單、方便、快捷、還能實現(xiàn)在線實時分析等特點，在日常的分析檢測中得到了普遍的應(yīng)用。同時由于它的高靈敏度以及許多重要的物質(zhì)的熒光性質(zhì)，使得該方法在藥物、臨床、環(huán)境、食品的微量、痕量分析以及生命科學(xué)研究領(lǐng)域具有重要意義。熒光物質(zhì)的熒光產(chǎn)生過程：當(dāng)物質(zhì)受到光照射時，基態(tài)分子吸收光能就會產(chǎn)生電子能級躍遷到激發(fā)態(tài)上，但是處于電子激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，很快它就會通過無輻射躍遷和輻射躍遷釋放能量而返回基態(tài)。輻射躍遷的過程會產(chǎn)生光子的發(fā)射，產(chǎn)生熒光。

但是目前商用的大多熒光生物傳感還無法實現(xiàn)多物質(zhì)、高通量的生物檢測，這對于低成本、低樣品量的旺盛需求不符。集成光學(xué)技術(shù)在過去十幾年中快速發(fā)展，基于成熟的cmos加工技術(shù)，可以完成各種微納光器件的制作，其中很多微納光器件可以作為生物檢測中的核心傳感器，如光子晶體、微環(huán)、馬赫曾德干涉儀等，由于器件尺寸很小，在同一芯片上可以實現(xiàn)很高的集成度，這就為傳感器陣列化提供了條件；另一方面，隨著微流控技術(shù)的快速發(fā)展，與集成光子芯片的鍵合技術(shù)也已成熟，這些為基于集成光子芯片的陣列化、高通量的傳感提供了強大的技術(shù)支撐。

目前集成光子學(xué)生物傳感方案，adaml.washburn.etc,“l(fā)abel-freequantitationofacancerbiomarkerincomplexmediausingsiliconphotonicmicroringresonators”，在復(fù)雜的媒介中使用硅光子微諧振器作為label-free定量的癌癥生物標志物，anal.chem.2009,81,9499-9506、enriquevalera.etc,“developmentandvalidationofanimmunosensorformonocytechemotacticprotein1usingasiliconphotonicmicroringresonatorbiosensingplatform”一種使用硅光子微諧振器來開發(fā)和驗證免疫傳感器的單核細胞趨化蛋白的平臺，clinicalbiochemistry,2015,49(1):121-126中，大多是基于倏逝波檢測原理，大致過程是首先在光器件傳感區(qū)波導(dǎo)表面運用化學(xué)的方法修飾上一層受體物質(zhì)，當(dāng)該波導(dǎo)處在具有相應(yīng)配體的樣品中時，配體與受體將會發(fā)生特異性結(jié)合，影響波導(dǎo)中傳輸光的倏逝波，從而引起傳輸信號相位的變化，相位的變化通過干涉原理實現(xiàn)強度的變化，從而被探測，但是對于小分子、超低濃度的檢測，這種傳感方式并不很好的奏效，除此之外，由于光子器件的物質(zhì)大多為無機材料(硅、氮化硅)，生物修飾過程較為復(fù)雜，穩(wěn)定性和重復(fù)性較差。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種基于耦合光柵的熒光生物傳感器及檢測方法，可以實現(xiàn)高通量、多物質(zhì)的檢測。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明的一種基于耦合光柵的熒光生物傳感器，包括硅基底、襯底、耦合光柵結(jié)構(gòu)、傳輸波導(dǎo)、上包層、微流通道和多模光纖；所述硅基底設(shè)置于襯底的底部，所述傳輸波導(dǎo)連接在耦合光柵結(jié)構(gòu)的一端，所述傳輸波導(dǎo)和耦合光柵結(jié)構(gòu)分別設(shè)置在襯底的頂部，所述上包層包覆在襯底的頂部，所述微流通道設(shè)置在上包層的頂部，所述微流通道和上包層之間具有用于檢測的傳感區(qū)域，所述傳感區(qū)域位于所述耦合光柵的發(fā)射部位置上，所述傳感區(qū)域內(nèi)設(shè)有修飾好的修飾配體層，所述多模光纖的端面傾斜設(shè)置在微流通道內(nèi)，所述多模光纖的端面位于耦合光柵結(jié)構(gòu)的正上方。

所述耦合光柵結(jié)構(gòu)的表面涂覆透明的聚合物薄膜層。便于傳感器件的表征修飾，提供表面物質(zhì)的生物相容性，從而可以提高生物修飾過程的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述耦合光柵結(jié)構(gòu)的高度與傳輸波導(dǎo)的高度一致。

所述微流通道為pdms通道，所述微流通道的正上方設(shè)有連接孔，所述多模光纖的端面傾斜探入在所述連接孔內(nèi)。使得多模光纖更接近于微流通道的傳感區(qū)域，最大化探測信號光，光纖探頭具有一定的傾斜角度，從而可以使得出射的平行激發(fā)光無法進入到多模光纖探頭中。

所述耦合光柵結(jié)構(gòu)發(fā)射的光位于傾斜多模光纖的數(shù)值孔徑內(nèi)。能夠確保傾斜激發(fā)光可以進入到多模光纖探頭內(nèi)。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述耦合光柵結(jié)構(gòu)和傳輸波導(dǎo)的材料相同，在可在光波段是透明的，同時折射率大于二氧化硅。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述耦合光柵結(jié)構(gòu)為氮化硅或五氧化二鉭制成，所述耦合光柵結(jié)構(gòu)的厚度小于或等于300nm。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一，所述上包層為二氧化硅上包層。

所述傳感區(qū)域的制備過程為：先在傳感區(qū)域的表面進行硅烷化處理，然后用偶聯(lián)劑將蛋白分子或核酸分子的氨基與表面進行了硅烷化的氨基連接起來，制得用于捕獲生物分子的傳感區(qū)域。

一種使用所述的基于耦合光柵的熒光生物傳感器進行快速檢測生物分子的方法，包括以下步驟：

(1)將激發(fā)光通過傳輸波導(dǎo)傳輸?shù)今詈瞎鈻沤Y(jié)構(gòu)上；

(2)將待測樣品流經(jīng)傳感區(qū)域，當(dāng)待測樣品中存在與修飾配體層可特異性結(jié)合的受體，受體會與修飾配體層結(jié)合，通入緩沖液沖洗；

(3)然后再通入帶有熒光標記物配體，帶有熒光標記物的配體與已經(jīng)結(jié)合的受體再次結(jié)合，再通入緩沖液沖洗；

(4)打開光源，激發(fā)光通過傳輸波導(dǎo)傳入耦合光柵結(jié)構(gòu)，然后斜向上發(fā)出，激發(fā)微流通道內(nèi)的熒光標記物，發(fā)出熒光，多模光纖接受熒光，根據(jù)熒光光強與受體濃度成正比的關(guān)系，得到待測樣品中的受體濃度。

本發(fā)明用于接收光的大數(shù)值孔徑的多模光纖，根據(jù)光柵方程，當(dāng)特定波長的光經(jīng)過微納的耦合光柵結(jié)構(gòu)斜向上的發(fā)出，能夠得到發(fā)散很小的平行光，并且光斑可根據(jù)耦合光柵結(jié)構(gòu)來調(diào)整，可以達到顯微鏡聚焦的效果，通過調(diào)整接收光的多模光纖的角度以及耦合光柵結(jié)構(gòu)的周期可以有效減少激發(fā)光的接收，從而可以減少背景光干擾，除此之外，由于微納的耦合光柵結(jié)構(gòu)很小(20umx10um)，并且制作工藝與cmos工藝兼容，可以很容易的實現(xiàn)多物質(zhì)高通量的檢測，芯片也可以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。

將待檢測液體通過微流通道流入修飾好特定配體分子的耦合光柵結(jié)構(gòu)中，如果該液體中存在與耦合光柵探針上捕獲生物分子同種的生物分子，由于生物分子的特異性結(jié)合而被捕獲形成復(fù)合分子。然后再將含有所述的生物識別分子液體通入耦合光柵結(jié)構(gòu)的探針上，該液體中的識別生物分子與耦合光柵結(jié)構(gòu)上的相應(yīng)的復(fù)合分子結(jié)合，則其標記的熒光物質(zhì)就會固定在光纖生物探針上，通過耦合光柵結(jié)構(gòu)斜向上發(fā)出的激發(fā)光激發(fā)熒光物質(zhì)，發(fā)出的熒光被多模光纖接收，從而傳輸?shù)焦怆娞綔y器中，通過檢測的功率大小的即可得知熒光物質(zhì)的多少，從而可以判斷出待檢測液體中所述的生物分子含量。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點：本發(fā)明利用耦合光柵結(jié)構(gòu)，可以實現(xiàn)很小的光斑，無需顯微鏡等的聚焦，大大減少了激發(fā)光源及其光路設(shè)計的復(fù)雜性，從而降低成本；

在耦合光柵結(jié)構(gòu)表面均勻涂一層透明的聚合物薄膜，可以有效的提高生物相容性，與傳統(tǒng)的利用倏逝波的集成光學(xué)傳感或光纖傳感，大大增加修飾的穩(wěn)定性和可靠性；由于耦合光柵結(jié)構(gòu)很小(20umx10um)，結(jié)合微流通道，在同一芯片上可以實現(xiàn)多物質(zhì)和高通量檢測；

在制作過程中，可以調(diào)整光柵的周期，使得發(fā)出光在一定的傾角范圍內(nèi)，再通過調(diào)整接收光的多模光纖的角度，大大減少激發(fā)光進入探測器，有效的減少背景光的干擾。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是耦合光柵結(jié)構(gòu)的俯視圖。

具體實施方式

下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。

如圖1和圖2所示，本實施例的一種基于耦合光柵的熒光生物傳感器，包括硅基底1、襯底2、耦合光柵結(jié)構(gòu)3、傳輸波導(dǎo)4、上包層5、微流通道6和多模光纖7；所述硅基底1設(shè)置于襯底2的底部，所述傳輸波導(dǎo)4連接在耦合光柵結(jié)構(gòu)3的一端，所述傳輸波導(dǎo)4和耦合光柵結(jié)構(gòu)3分別設(shè)置在襯底2的頂部，所述上包層5包覆在襯底2的頂部，所述微流通道6設(shè)置在上包層5的頂部，所述微流通道6和上包層5之間具有用于檢測的傳感區(qū)域10，所述傳感區(qū)域10位于所述耦合光柵的發(fā)射部位置上，所述傳感區(qū)域10內(nèi)設(shè)有修飾好的修飾配體層9，所述多模光纖7的端面傾斜設(shè)置在微流通道6內(nèi)，所述多模光纖7的端面位于耦合光柵結(jié)構(gòu)3的正上方。在上包層5的表面均勻抹上一層透明的聚合物薄膜，如聚苯乙烯，可有效的提高生物相容性，與傳統(tǒng)的利用倏逝波的集成光學(xué)傳感或光纖傳感，大大增加修飾的穩(wěn)定性和可靠性，便于傳感器件的表征修飾，從而可以提高生物修飾過程的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

本實施例的耦合光柵結(jié)構(gòu)3的高度與傳輸波導(dǎo)4的高度一致。

所述微流通道6為pdms通道，所述微流通道6的正上方設(shè)有連接孔，所述多模光纖7的端面傾斜探入在所述連接孔內(nèi)。使得多模光纖7更接近于微流通道6的傳感區(qū)域10，最大化探測信號光，光纖探頭具有一定的傾斜角度，從而可以使得出射的平行激發(fā)光無法進入到多模光纖7探頭中。

所述耦合光柵結(jié)構(gòu)3發(fā)射的光位于傾斜多模光纖7的數(shù)值孔徑內(nèi)。能夠確保傾斜激發(fā)光可以進入到多模光纖7探頭內(nèi)。

所述耦合光柵結(jié)構(gòu)3和傳輸波導(dǎo)4的材料相同，在可在光波段是透明的，同時折射率大于二氧化硅。

本實施例的耦合光柵結(jié)構(gòu)3的制作方法如下：

由于大多數(shù)熒光物質(zhì)都是可見光波段，本實施例選擇氮化硅作為耦合光柵結(jié)構(gòu)3的材料，其他實施例中也可以選擇折射率大于二氧化硅的材料，如ta2o5。由于需要制作耦合效率較高的垂直耦合光柵結(jié)構(gòu)3，氮化硅的厚度控制在300nm以下。根據(jù)激發(fā)光的波長以及發(fā)出光的角度，設(shè)計選擇合適的光柵周期。制作完波導(dǎo)結(jié)構(gòu)然后在氮化硅表面上生長一層二氧化硅上包層5。

本實施例的傳感區(qū)域10的制作方法如下：

采用的主流的生物修飾方式，首先對二氧化硅上包層5表面進行硅烷化，然后用偶聯(lián)劑將蛋白分子或者核酸分子的氨基與表面進行了硅烷化的氨基連接起來即可完成用于捕獲生物分子的傳感區(qū)域10制備。

本實施例的微流通道6的制作方法如下：

針對完成修飾的耦合光柵結(jié)構(gòu)3上方的上包層5的表面，采用pdms材料，使用標準的工藝，制作出一個微流通道6，便于進行微量樣品測試。在制作pdms過程中，利用3d打印技術(shù)制作模具，在微流通道6正上方制作一個孔形結(jié)構(gòu)，便于將多模光纖7探頭深入進孔中，從而使得探頭更接近于微流通道6的傳感區(qū)域10，最大化探測信號光，光纖探頭具有一定的傾斜角度，從而可以使得出射的平行激發(fā)光無法進入到多模光纖7探頭中。

使用本實施例的生物傳感器進行快速檢測生物分子的方法，包括以下步驟：

(1)調(diào)節(jié)光路，將激發(fā)光通過傳輸波導(dǎo)4傳輸?shù)今詈瞎鈻沤Y(jié)構(gòu)3上；

(2)使用微流泵將待測樣品流經(jīng)傳感區(qū)域10，當(dāng)待測樣品中存在與修飾配體層9可特異性結(jié)合的受體8，受體8會與修飾配體層9結(jié)合，通入緩沖液沖洗，將沉淀、物理吸附的物質(zhì)沖走，減少干擾；

(3)然后再通入帶有熒光標記物配體，帶有熒光標記物的配體與已經(jīng)結(jié)合的受體8再次結(jié)合，再通入緩沖液沖洗，將殘余的未結(jié)合的熒光標記物的配體；

(4)打開光源和探測器，激發(fā)光通過傳輸波導(dǎo)4傳入耦合光柵結(jié)構(gòu)3，然后斜向上發(fā)出，配體上標記的熒光標記分子在耦合光柵結(jié)構(gòu)3發(fā)出的光的激發(fā)下產(chǎn)生熒光，這些熒光部分正好處在多模光纖7的數(shù)值孔徑之內(nèi)，所以能夠被探頭收集，收集后的熒光信號經(jīng)過濾波片，濾除激發(fā)光，則光電探測器探測到的信號即為熒光強度，信號的強弱反應(yīng)出了配體分子的多少，從而可判斷出受體8分子的濃度。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。