背景技術(shù)：
：奧貝膽酸(obeticholicacid，OCA)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：化學(xué)名為：6α-ethyl-3α,7α-dihydroxy-5β-cholan-24-oicacid，屬法尼醇X受體激動(dòng)劑。2014年5月，美國(guó)FDA授予Intercept制藥公司的奧貝膽酸快速審批通道認(rèn)定。奧貝膽酸通過(guò)活化法尼醇X受體，間接抑制細(xì)胞色素7A1(CYP7A1)的基因表達(dá)。由于CYP7A1是膽酸生物合成的限速酶，因此奧貝膽酸可以抑制膽酸合成，用于治療原發(fā)性膽汁性肝硬化和非酒精性脂肪性肝病。在過(guò)去的數(shù)年里，經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，奧貝膽酸在原料合成、制劑生產(chǎn)和存放等過(guò)程中，都有可能引入殘留原料及其他有關(guān)物質(zhì)，在儲(chǔ)存過(guò)程中還有可能產(chǎn)生一些降解產(chǎn)物。因此，要嚴(yán)格控制產(chǎn)品質(zhì)量。目前國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)有奧貝膽酸分析方法的文獻(xiàn)報(bào)道，該藥物也沒(méi)有統(tǒng)一的藥物標(biāo)準(zhǔn)，因此，為了更好地控制奧貝膽酸產(chǎn)品的質(zhì)量，需要建立一套簡(jiǎn)單可靠并穩(wěn)定有效的方法來(lái)進(jìn)行本品的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，解決合成工藝引入的或者降解及制劑加工過(guò)程產(chǎn)生的各類(lèi)已知或未知雜質(zhì)對(duì)產(chǎn)品純度測(cè)定的干擾。本發(fā)明采用普通的色譜柱(C18色譜柱)，檢測(cè)波長(zhǎng)240nm，柱溫22℃，流速1.0ml/min，色譜條件的流動(dòng)相由0.01mol/LNaH2PO4溶液(pH值＝3.8)-乙腈-甲醇組成，其配比為：25:35:40，等度洗脫方式，有效地對(duì)奧貝膽酸及其相關(guān)制劑進(jìn)行含量和有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)，可快速準(zhǔn)確的檢測(cè)出奧貝膽酸的雜質(zhì)及其降解產(chǎn)物，操作簡(jiǎn)介，靈敏度高，可較好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。實(shí)現(xiàn)了奧貝膽酸有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定，保證了奧貝膽酸的質(zhì)量控制，在合成和制劑過(guò)程的質(zhì)量控制方面具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種奧貝膽酸及其制劑中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法。本發(fā)明有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法的實(shí)現(xiàn)包括以下步驟：(1)色譜條件：普通C18柱，檢測(cè)器采用二極管陣列檢測(cè)器，柱溫22℃，流速1.0ml/min，色譜條件的流動(dòng)相由0.01mol/LNaH2PO4溶液-乙腈-甲醇組成，其配比為：25:35:40。理論踏板上按奧貝膽酸峰計(jì)算不低于3000。(2)供試品溶液的配置；取奧貝膽酸或其制劑、中間體和各個(gè)雜質(zhì)適量，加流動(dòng)相配置成0.2mg/ml的溶液，作為供試品溶液。(3)對(duì)照品溶液的制備：量取(2)供試品溶液適量，加流動(dòng)相稀釋成每1ml中約含2ug的溶液，作為對(duì)照溶液。(4)測(cè)定方法：取對(duì)照溶液10ul，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰高約為滿量程的10％，再取供試品溶液10ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖至奧貝膽酸保留時(shí)間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積的和，不得大于對(duì)照溶液中主峰的峰面積。本發(fā)明上述(2)中供試品溶液的制備：取奧貝膽酸對(duì)照品適量，用流動(dòng)相配置成濃度為每1ml含0.2mg的溶液，再分別用流動(dòng)相稀釋成一系列不同濃度的溶液，分別進(jìn)樣10μl，使之產(chǎn)生主峰為基線噪音三倍的信號(hào)。經(jīng)試驗(yàn)，最小檢知量為0.2ng(S/N≥3)，若以有關(guān)物質(zhì)檢查時(shí)的濃度0.2mg.ml計(jì)算，期檢出限度為0.1％。本發(fā)明上述(3)中對(duì)照品溶液的指標(biāo)：精密量取上述供試品溶液1ml，置100ml容量瓶中，加流動(dòng)相溶劑并稀釋至可得，作為對(duì)照溶液。當(dāng)該對(duì)照溶液濃度范圍在1～10μg/ml內(nèi)時(shí)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，其線性相關(guān)系數(shù)為0.9998(見(jiàn)附圖1)。本發(fā)明奧貝膽酸及其制劑中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，經(jīng)多次試驗(yàn)證實(shí)，其有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的高效液相色譜圖中，主峰及個(gè)雜質(zhì)峰，峰形對(duì)稱，分離效果好(R＞1.5)，適用于各種需要進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的奧貝膽酸及含奧貝膽酸的相關(guān)制劑，如奧貝膽酸片。本發(fā)明與已有技術(shù)相比的積極效果在于：1、本發(fā)明中液相色譜條件的優(yōu)越性更強(qiáng)，適用于原料藥及其各種劑型有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)，可快速準(zhǔn)確的檢測(cè)出奧貝膽酸的雜質(zhì)和降解產(chǎn)物情況。在奧貝膽酸及其制劑的有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)中，各峰形對(duì)稱，分離度高，避免了出現(xiàn)前沿峰、個(gè)別峰分離度不夠等問(wèn)題。2、本發(fā)明使用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)，建立了一種快速直觀的評(píng)價(jià)色譜峰純度的有效防范?？芍庇^的判斷色譜峰的純度，并判斷存在干擾費(fèi)的位置，能夠獲得“在流”的全部光譜信息，快速得到色譜組分的吸收光譜，二極管陣列檢測(cè)器叫一般紫外檢測(cè)器，優(yōu)點(diǎn)在于不僅能依靠色譜的保留時(shí)間進(jìn)行定性，而且能夠根據(jù)其提供的光譜信息進(jìn)行定性，大大提高了定性的可信度和檢測(cè)靈敏度。3、本發(fā)明檢測(cè)方法準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)捷，重現(xiàn)性好，靈敏度高，可以充分滿足有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)和分解產(chǎn)物測(cè)定的要求，比較好地控制樣品中的特殊雜質(zhì)，保證產(chǎn)品質(zhì)量，在工作中實(shí)用性強(qiáng)。有利于工業(yè)化生產(chǎn)中，奧貝膽酸有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)，能更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證藥品安全性。具體實(shí)施方式：實(shí)施例一1、色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)：1.1色譜條件的選擇：儀器：島津：LC-20AT，SPD-M20A，SIL-20A，DGU-20A5，其最佳柱溫22℃，流速1.0ml/min。液相色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(250mm×4.6mm，5μm)，參照相關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合實(shí)驗(yàn)具體情況，先后選用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水-乙腈、甲醇-水-冰醋酸、甲醇-水-磷酸鹽緩沖液等多種條件，最終確定0.01mol/LNaH2PO4溶液(pH3.8)-乙腈-甲醇組成，其最佳配比為：25:35:40。進(jìn)樣量10μl。在該色譜條件下，奧貝膽酸主峰保留時(shí)間適中，峰形較好。1.2靈敏度測(cè)定取奧貝膽酸對(duì)照品適量，用流動(dòng)相配置成濃度為每1ml含0.2mg的溶液，再分別用流動(dòng)相稀釋成一系列不同濃度的溶液，分別進(jìn)樣10μl，使之產(chǎn)生主峰為基線噪音三倍的信號(hào)。經(jīng)試驗(yàn)，最小檢知量為0.2ng(S/N≥3)，若以有關(guān)物質(zhì)檢查時(shí)的濃度0.2mg.ml計(jì)算，期檢出限度為0.1％。結(jié)果證明，該方法靈敏度高，可以充分滿足有關(guān)物質(zhì)檢查測(cè)定的要求。1.3溶液穩(wěn)定性去同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、10小時(shí)分別進(jìn)樣測(cè)定，其主峰峰面積及有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果在10小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此方法簡(jiǎn)便靈敏，重現(xiàn)性好，可較好地對(duì)樣品中奧貝膽酸的質(zhì)量進(jìn)行較好的檢測(cè)。1.4供試品溶液的配置；取奧貝膽酸或其制劑、中間體和各個(gè)雜質(zhì)適量，加流動(dòng)相配置成0.2mg/ml的溶液，作為供試品溶液。1.5對(duì)照品溶液的制備：量取上述1.4供試品溶液適量，加流動(dòng)相稀釋成每1ml中約含2μg的溶液，作為對(duì)照溶液。1.6奧貝膽酸及其制劑有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)：取對(duì)照溶液10ul，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰高約為滿量程的10％，再取供試品溶液10ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖至奧貝膽酸保留時(shí)間的2倍，供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積的和，不得大于對(duì)照溶液中主峰的峰面積。奧貝膽酸原料藥有關(guān)物質(zhì)的定性測(cè)定結(jié)果如圖2。實(shí)施例二：奧貝膽酸片有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密量取適量(約相當(dāng)于奧貝膽酸2mg)。加流動(dòng)相配置成每1ml中含0.2mg的溶液，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。精密量取適量，加流動(dòng)相稀釋成每1ml中約含2μg的溶液，作為對(duì)照溶液。在下列選的的色譜條件下：二極管陣列檢測(cè)器(島津：LC-20AT，SPD-M20A，SIL-20A，DGU-20A5)，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，0.01mol/LNaH2PO4溶液(pH3.8)-乙腈-甲醇組成，其最佳配比為：25:35:40，色譜柱柱溫22℃，流速1.0ml/min。理論踏板上按奧貝膽酸峰計(jì)算不低于3000。測(cè)定結(jié)果如圖3。批號(hào)第一批第二批第三批有關(guān)物質(zhì)0.120.150.17附圖說(shuō)明圖1.奧貝膽酸雜質(zhì)限度線性關(guān)系圖圖2.實(shí)施例一奧貝膽酸所得的定性液相色譜圖圖3.實(shí)施例二奧貝膽酸片所得的定性液相色譜圖。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3