本發(fā)明屬于小分子結(jié)合酶位點(diǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及了一種用于快速判斷小分子結(jié)合人體肝臟果糖1,6-二磷酸酶底物位點(diǎn)或變構(gòu)位點(diǎn)的方法。

背景技術(shù)：

二型糖尿病正在成為世界范圍性的疾病，預(yù)計(jì)到2030年，全球?qū)⒂?.66億人得糖尿病。糖尿病患者長期存在的高血糖，會(huì)損害人體內(nèi)的各種器官組織，例如眼睛、腎、神經(jīng)、心臟、還有血管。糖尿病的發(fā)病機(jī)理主要為胰島素分泌不足，胰島素抵抗和肝葡萄糖生成增加。此外，內(nèi)源性的葡萄糖生成增加是造成糖尿病患者空腹血糖升高的主要原因。內(nèi)源性的葡萄糖主要來源于肝臟。肝臟內(nèi)葡萄糖代謝主要為兩個(gè)途徑，一個(gè)是糖異生過程，另一個(gè)是肝糖原分解。因此通過調(diào)節(jié)糖異生途徑，減少肝臟葡萄糖的生成，成為開發(fā)新作用機(jī)制抗糖尿病藥物的新策略。

糖異生作用是將乳酸，丙三醇等三碳前體，在多種酶的催化下轉(zhuǎn)化為葡萄糖的過程。在糖異生過程中，果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)催化果糖1,6-二磷酸生成果糖-6-磷酸和一分子磷酸。該催化反應(yīng)是糖異生過程中的一個(gè)控速步驟，抑制果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)的活性，可以減少肝臟葡萄糖的生成，降低血糖水平，達(dá)到治療糖尿病的目的。

果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)是一個(gè)同源四聚體，由四個(gè)結(jié)構(gòu)相同的單位組成。每個(gè)單體結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)：底物位點(diǎn)和AMP變構(gòu)位點(diǎn)。目前已經(jīng)報(bào)道了許多化合物對果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)有抑制作用。而清楚明確的知曉小分子和果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)的結(jié)合位點(diǎn)對于小分子的設(shè)計(jì)改造至關(guān)重要。而目前判斷小分子和果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)結(jié)合位點(diǎn)主要有：1.X-Ray晶體體衍射法；2.表面等離子共振；3.同位素標(biāo)記法。但是這些方法實(shí)際操作起來卻常常存在較大難度。因此，尋找一種快速簡便判斷小分子的在果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)結(jié)合位點(diǎn)的方法是急需解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，目的在于提供一種用于快速判斷小分子結(jié)合人體肝臟果糖1,6-二磷酸酶底物位點(diǎn)或變構(gòu)位點(diǎn)的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

一種用于快速判斷小分子結(jié)合人體肝臟果糖1,6-二磷酸酶底物位點(diǎn)或變構(gòu)位點(diǎn)的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)采用氨基酸定點(diǎn)突變技術(shù)將果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列262位(底物位點(diǎn))的苯丙氨酸(Phe)突變?yōu)樯彼?Trp)，記為蛋白F262W；同理，采用氨基酸定點(diǎn)突變技術(shù)將果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列89位(變構(gòu)位點(diǎn))的苯丙氨酸(Phe)突變?yōu)樯彼?Trp)，記為蛋白F89W；(2)將小分子與蛋白F262W結(jié)合，在不同溫度下，利用熒光分光光度計(jì)檢測小分子和蛋白F262W結(jié)合時(shí)的熒光猝滅過程，經(jīng)數(shù)據(jù)處理后得到不同溫度下小分子和蛋白F262W結(jié)合時(shí)的熒光猝滅常數(shù)，記為K_SV；同理，將小分子與蛋白F89W結(jié)合，在不同溫度下，利用熒光分光光度計(jì)檢測小分子和蛋白F89W結(jié)合時(shí)的熒光猝滅過程，經(jīng)數(shù)據(jù)處理后得到不同溫度下小分子與蛋白F89W結(jié)合時(shí)的熒光猝滅常數(shù)，記為K’_SV；

(3)利用熒光猝滅常數(shù)K_SV和K’_SV進(jìn)行結(jié)果判定：

a.若蛋白F262W熒光猝滅且Ksv隨著溫度的升高而降低，則表明小分子結(jié)合在果糖1,6-二磷酸酶的底物位點(diǎn)上；反之，若蛋白F262W未熒光猝滅或Ksv隨著溫度的升高而升高，則表明小分子未結(jié)合在果糖1,6-二磷酸酶的底物位點(diǎn)上；

b.若蛋白F89W熒光猝滅且K’_SV隨著溫度的升高而降低，則表明小分子結(jié)合在果糖1,6-二磷酸酶的變構(gòu)位點(diǎn)上；反之，若蛋白F89W未熒光猝滅或K’_SV隨著溫度的升高而升高，則表明小分子未結(jié)合在果糖1,6-二磷酸酶的變構(gòu)位點(diǎn)上。

上述方案中，所述熒光分光光度計(jì)檢測熒光猝滅過程的測試體系為：0.8mM Mg²⁺，50mM Tris-HCl，0.15mg/mL蛋白F262W或蛋白F89W，pH 7.4，總體系為1mL。

上述方案中，所述熒光分光光度計(jì)的設(shè)置為：激發(fā)波長為280nm，發(fā)射波長設(shè)為285～400nm，狹縫長度為5，平滑因子為7，電壓為710V。

上述方案中，利用Stern-Vlomer方程對熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行處理得到熒光猝滅常數(shù)，所述Stern-Vlomer方程為其中F₀為不加小分子時(shí)波峰最高點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入小分子后波峰最高點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，Q為小分子濃度。

上述方案中，通過檢測301K～310K溫度下的熒光猝滅常數(shù)用于判定熒光猝滅常數(shù)隨溫度的變化情況。

人體肝臟果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列如下所示(見SEQ ID NO.1)：

ADQAPFDTDVNTLTRFVMEEGRKARGTGELTQLLNSLCTAVKAISSAVRKAGIAHLYGIAGSTNVTGDQVKKLDVLSNDLVMNMLKSSFATCVLVSEEDKHAIIVEPEKRGKYVVCFDPLDGSSNIDCLVSVGTIFGIYRKKSTDEPSEKDALQPGRNLVAAGYALYGSATMLVLAMDCGVNCFMLDPAIGEFILVDKDVKIKKKGKIYSLNEGYAKDFDPAVTEYIQRKKFPPDNSAPYGARYVGSMVADVHRTLVYGGIFLYPANKKSPNGKLRLLYECNPMAYVMEKAGGMATTGKEAVLDVIPTDIHQRAPVILGSPDDVLEFLKVYEKHSAQ

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明分別在底物位點(diǎn)和變構(gòu)位點(diǎn)附近引入帶有熒光基團(tuán)的色氨酸，利用小分子與蛋白底物位點(diǎn)或變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合，引起蛋白周圍環(huán)境發(fā)生變化，使得熒光發(fā)生猝滅，通過判斷熒光猝滅的情況實(shí)現(xiàn)快速簡便的判斷小分子結(jié)合果糖1,6-二磷酸酶的底物位點(diǎn)或變構(gòu)位點(diǎn)，本發(fā)明方法具有特異性好，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為底物果糖1,6二磷酸(FBP)與果糖1,6-二磷酸酶的底物位點(diǎn)的結(jié)合方式。

圖2為單磷酸腺苷(AMP)與果糖1,6-二磷酸酶的變構(gòu)位點(diǎn)的結(jié)合方式。

圖3為底物果糖1,6二磷酸(FBP)(0～222μM)在301K時(shí)對F262W熒光光譜影響。

圖4為單磷酸腺苷(AMP)(0～282μM)在301K時(shí)對F89W熒光光譜影響。

圖5為化合物HS36(0～131μM)在301K時(shí)對F262W熒光光譜影響。

圖6為化合物HS36(0～56μM)在301K時(shí)對F89W熒光光譜影響。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。

實(shí)施例1蛋白F262W和F89W的制備、表達(dá)及純化

采用氨基酸定點(diǎn)突變技術(shù)將果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列262位(底物位點(diǎn))的苯丙氨酸(Phe)突變?yōu)樯彼?Trp)，記為蛋白F262W；采用氨基酸定點(diǎn)突變技術(shù)將果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列89位(變構(gòu)位點(diǎn))的苯丙氨酸(Phe)突變?yōu)樯彼?Trp)，記為蛋白F89W；

經(jīng)過驗(yàn)證正確的F262W和F89W的重組質(zhì)粒pPeceiver-B01(金唯智公司提供)被熱激活轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21(DE3)中，挑取BL21-pPeceiverB01-FBPase重組單菌落接種到20mL LB液體培養(yǎng)基中(含有50μg/mL氨芐青霉素)，37℃，220rpm過夜培養(yǎng)12–16h。然后將上一步過夜培養(yǎng)的菌液按照1％的量接種到500mL 2×YT液體培養(yǎng)基中37℃，220rpm擴(kuò)大培養(yǎng)，待OD600值為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG使其終濃度為0.1mM，改變溫度到16℃誘導(dǎo)表達(dá)Hu-FBPase；24h后，4℃，8000rpm高速離心10min收集菌體，之后用5×裂解緩沖液洗菌1次后棄上清；收集后的菌體放入-20℃冰箱中冷凍備用。

1)HisTrap_FF 5mL親和層析柱的再：設(shè)置AKTA Purifier 10流速2.0mL/min，設(shè)置壓力報(bào)警為0.25MPa，沖洗順序?yàn)镋DTA洗脫液2CV，ddH₂O 2CV，0.5M NaOH 2CV浸泡30min，ddH₂O 5CV，0.1M NiSO₄ 2CV，ddH₂O 2CV；當(dāng)天使用直接平衡上樣，若當(dāng)天不用，20％乙醇2CV，保存；

2)將冰箱中凍藏的菌體細(xì)胞放在冰上慢慢融化，稍后用30mL冷處理的5×裂解緩沖液慢慢重懸；

3)冰水浴情況下，細(xì)胞超聲破碎儀破碎，探頭與離心管底部保持1cm的距離，設(shè)置工作條件為：電壓為220W，(3，5，90)；

4)將破碎后的菌液10000rpm，4℃，離心30min，分離上清和沉淀，0.22μM濾膜過濾上清兩次；

5)使用AKTA Purifier 10純化目的蛋白：

I平衡：設(shè)置A泵為5×裂解緩沖液，B泵為50×沖洗緩沖液，使用A泵，流速2.0mL/min，壓力報(bào)警0.25MPa，3CV平衡第1)步中再生的HisTrap_FF 5mL親和層析柱，A280紫外值歸零；

II上樣：使用A泵(5×裂解緩沖液)，流速0.5mL/min，壓力報(bào)警0.25MPa，將過濾后的上清上樣到HisTrap_FF 5mL親和層析柱上。上樣完畢后，流速設(shè)置為2.0mL/min，依然使用A泵將未結(jié)合到層析柱的雜蛋白沖洗下來，一直到A280紫外值不發(fā)生變化；

III洗雜蛋白：待未結(jié)合的雜蛋白沖洗完畢后，使用B泵(50×沖洗緩沖液)流速2.0mL/min，壓力報(bào)警0.25MPa，沖洗結(jié)合在層析柱上的非目的蛋白，一直沖洗到A280紫外值<30mA；

IV沖洗目的蛋白：待結(jié)合到層析柱上的雜蛋白沖洗完畢后，將A泵溶液換為ETDA洗脫緩沖液，洗泵后，設(shè)置A泵流速2.0mL/min，壓力報(bào)警0.25MPa，沖洗目的蛋白，(EDTA競爭目的蛋白與層析柱上的Ni結(jié)合，EDTA與Ni結(jié)合能力更強(qiáng)，EDTA與Ni結(jié)合后將Ni從層析柱上洗脫下來，而原先與Ni結(jié)合的目的蛋白則仍然大量殘留在層析上，繼續(xù)沖洗殘留目的蛋白就會(huì)大量被從層析柱上洗脫下來。)使用超濾管將目的蛋白濃縮到體積<1.5mL；

V脫鹽：使用脫鹽緩沖液將HiTrap Desalting脫鹽柱平衡5CV，脫鹽層析的原則是高濃度上樣、快速上樣、快速洗脫，故整脫鹽過程均設(shè)流速2.0mL/min，壓力報(bào)警0.25MPa，將IV步驟中濃縮后的目的蛋白(<1.5mL，原因是每個(gè)HiTrap Desalting脫鹽柱能分離的最大體積為1.5mL，若>1.5mL的上樣溶液，則需要多個(gè)HiTrap Desalting脫鹽柱串聯(lián)或分多部進(jìn)行。)快速上樣到HiTrap Desalting脫鹽柱上，快速洗脫收集到EP管中，脫鹽后的目的蛋白會(huì)被稀釋，脫鹽過后需要重新濃縮目的蛋白；

6)將純化后得到的目的蛋白與甘油1:1混合均勻，放置于-20℃冰箱備用。

實(shí)施例2利用蛋白F262W判斷小分子與果糖1,6-二磷酸酶的底物結(jié)合位點(diǎn)

采用晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)報(bào)道結(jié)合于果糖1,6-二磷酸酶底物位點(diǎn)的果糖1,6二磷酸(FBP)對F262W進(jìn)行測試，主要使用的儀器是熒光分光光度計(jì)，熒光分光光度計(jì)比色皿中的測試體系為：0.8mM Mg²⁺，50mM Tris-HCl，0.15mg/mL F262W蛋白，pH 7.4，總體系為1mL。熒光分光光度計(jì)的設(shè)置為激發(fā)波長為280nm，發(fā)射波長設(shè)為285～400nm，狹縫長度為5，平滑因子為7，電壓為710V。記錄301K時(shí)不加小分子時(shí)波峰最高點(diǎn)的熒光強(qiáng)度F₀，記錄每次加入合適量的小分子后波峰最高點(diǎn)的熒光強(qiáng)度F，小分子的濃度是[Q]，圖3為FBP濃度為0～222μM、在301K時(shí)對F262W熒光光譜影響。用Stern-Vlomer方程對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到301K時(shí)猝滅常數(shù)K_sv。同樣地，在310K時(shí)也要做相同的實(shí)驗(yàn)，得到310K時(shí)的猝滅常數(shù)K_sv。若K_sv隨著溫度的升高而升高，表明是動(dòng)態(tài)猝滅，說明小分子和蛋白是碰撞導(dǎo)致猝滅的，進(jìn)一步用公式對數(shù)據(jù)進(jìn)一步處理，得出猝滅常數(shù)K。若K_sv隨著溫度的升高而降低則表明是靜態(tài)猝滅，說明小分子是和蛋白結(jié)合才導(dǎo)致猝滅的。

表1 FBP猝滅F262W的猝滅常數(shù)

測試結(jié)果如表1所示，從結(jié)果可以看出：FBP的猝滅常數(shù)K_sv隨著溫度的升高而降低，說明它是靜態(tài)猝滅，F(xiàn)BP是和蛋白F262W結(jié)合而不是碰撞導(dǎo)致熒光猝滅，由此說明：利用蛋白F262W的熒光猝滅情況，能夠特異性、快速準(zhǔn)備地判斷FBP結(jié)合于果糖1,6-二磷酸酶的底物位點(diǎn)上。

實(shí)施例3利用蛋白F89W判斷小分子與果糖1,6-二磷酸酶的變構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)

采用晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)報(bào)道只結(jié)合于果糖1,6-二磷酸酶的結(jié)合于果糖1,6-二磷酸酶的變構(gòu)位點(diǎn)的單磷酸腺苷(AMP)對蛋白F89W進(jìn)行測試，主要使用的儀器是熒光分光光度計(jì)，熒光分光光度計(jì)比色皿中的測試體系為：0.8mM Mg²⁺，50mM Tris-HCl，0.15mg/mL F262W蛋白，pH 7.4，總體系為1mL。熒光分光光度計(jì)的設(shè)置為激發(fā)波長為280nm，發(fā)射波長設(shè)為285～400nm，狹縫長度為5，平滑因子為7，電壓為710V。記錄301K時(shí)不加小分子時(shí)波峰最高點(diǎn)的熒光強(qiáng)度F₀，記錄每次加入合適量的小分子后波峰最高點(diǎn)的熒光強(qiáng)度F，小分子的濃度是[Q]，圖4為AMP濃度為0～282μM、在301K時(shí)對F89W熒光光譜影響。用Stern-Vlomer方程對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到301K時(shí)猝滅常數(shù)K_sv。同樣地，在310K時(shí)也要做相同的實(shí)驗(yàn)，得到310K時(shí)的猝滅常數(shù)K_sv。若K_sv隨著溫度的升高而升高，表明是動(dòng)態(tài)猝滅，說明小分子和蛋白是碰撞導(dǎo)致猝滅的，進(jìn)一步用公式對數(shù)據(jù)進(jìn)一步處理，得出猝滅常數(shù)K。若K_sv隨著溫度的升高而降低則是靜態(tài)猝滅，說明小分子是和蛋白結(jié)合才導(dǎo)致猝滅的。

表2 AMP猝滅F89W的猝滅常數(shù)

測試結(jié)果如表2所示，從結(jié)果可以看出：AMP的猝滅常數(shù)K_sv隨著溫度的升高而降低，說明它是靜態(tài)猝滅，AMP是和蛋白F89W結(jié)合而不是碰撞導(dǎo)致熒光猝滅。由此說明：利用蛋白F89W的熒光猝滅情況，能夠特異性、快速準(zhǔn)備地判斷AMP結(jié)合于果糖1,6-二磷酸酶的變構(gòu)位點(diǎn)上。

實(shí)施例4利用蛋白F262W和蛋白F89W判斷HS36與果糖1,6-二磷酸酶的結(jié)合位點(diǎn)

HS36是本課題組針對Hu-FBPase設(shè)計(jì)合成的抑制劑，其抑制Hu-FBPase的IC₅₀為0.35μM,利用F262W和F89W兩個(gè)蛋白判斷其在Hu-FBPase上的作用位點(diǎn)。

主要使用的儀器是熒光分光光度計(jì)，熒光分光光度計(jì)比色皿中的測試體系為：0.8mM Mg²⁺，50mM Tris-HCl，0.15mg/mL F262W蛋白，PH 7.4，總體系為1mL。熒光分光光度計(jì)的設(shè)置為激發(fā)波長為280nm，發(fā)射波長設(shè)為285～400nm，狹縫長度為5，平滑因子為7，電壓為710V。記錄301K時(shí)不加小分子時(shí)波峰最高點(diǎn)的熒光強(qiáng)度F₀，記錄每次加入合適量的小分子后波峰最高點(diǎn)的熒光強(qiáng)度F，小分子的濃度是[Q]，圖5為HS36濃度為0～131μM、在301K時(shí)對F262W熒光光譜影響，圖6為HS36濃度為0～56μM、在301K時(shí)對F89W熒光光譜影響，用Stern-Vlomer方程對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到301K時(shí)猝滅常數(shù)K_sv。同樣地，在310K時(shí)也要做相同的實(shí)驗(yàn)，得到310K時(shí)的猝滅常數(shù)K_sv。若K_sv隨著溫度的升高而升高，表明是動(dòng)態(tài)猝滅，說明小分子和蛋白是碰撞導(dǎo)致猝滅的，進(jìn)一步用公式對數(shù)據(jù)進(jìn)一步處理，得出猝滅常數(shù)K。若K_sv隨著溫度的升高而降低則是靜態(tài)猝滅，說明小分子是和蛋白結(jié)合才導(dǎo)致猝滅的。

表3 HS36猝滅F262W的猝滅常數(shù)

表4 HS36猝滅F89W的猝滅常數(shù)

測試結(jié)果如表3，4，從結(jié)果可以看出：HS36在F262W和F89W的猝滅常數(shù)K_sv均隨著溫度的升高而降低，說明它們是靜態(tài)猝滅，HS36與蛋白F89W、蛋白F262W結(jié)合導(dǎo)致了熒光猝滅。由此說明：利用蛋白F89W和F262W的熒光猝滅情況，能夠特異性、快速準(zhǔn)確地判斷HS36結(jié)合于果糖1,6-二磷酸酶的變構(gòu)位點(diǎn)以及果糖1,6-二磷酸酶的底物位點(diǎn)上。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的實(shí)例，而并非對實(shí)施方式的限制。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之內(nèi)。