本發(fā)明涉及到一種紅參中人參皂苷類成分的含量測(cè)定方法，屬中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體的，涉及一種紅參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1和人參皂苷Ro五種成分同時(shí)測(cè)定的含量測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

紅參為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根及根莖，秋季采挖，洗凈，蒸制后，干燥，是藥用歷史悠久的傳統(tǒng)名貴中藥。人參被列為《神農(nóng)本草經(jīng)》三十六種上品之一，在歷代中醫(yī)藥典籍中也均有記載。本經(jīng)中稱，人參：“主補(bǔ)五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智，久服輕身延年”，是滋補(bǔ)養(yǎng)生保健的必備圣藥，其功效長(zhǎng)期以來被中醫(yī)推崇備至。自古代起就有把采集到的野生人參，用煮、蒸、焯等方法進(jìn)行加工處理，得到熟人參，這種加工方式逐漸演變成以后的紅參。紅參作為我國傳統(tǒng)名貴中藥，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、益氣攝血的功效，長(zhǎng)期以來深受廣大人民群眾的喜愛。人參皂苷類成分是紅參的主要有效活性成分，是衡量紅參內(nèi)在質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要標(biāo)準(zhǔn)，目前尚無紅參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1及人參皂苷Ro五種人參皂苷類成分同時(shí)測(cè)定的含量測(cè)定方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種紅參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1及人參皂苷Ro五種人參皂苷類成分同時(shí)測(cè)定的含量測(cè)定方法。

本發(fā)明含量測(cè)定方法采用超高效液相色譜法，該方法如下：

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱采用BEH C₁₈色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相A，0.05％～0.10％磷酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～9分鐘，流動(dòng)相A：18％→20％；9～11分鐘，流動(dòng)相A：20％→28％；11～40分鐘，流動(dòng)相A保持28％；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm；流速0.4ml/min；

混合對(duì)照品溶液的制備

取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、人參皂苷Rf對(duì)照品、人參皂苷Rb1對(duì)照品、人參皂苷Ro對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含人參皂苷Rg1對(duì)照品80μg、人參皂苷Re對(duì)照品60μg、人參皂苷Rf對(duì)照品50μg、人參皂苷Rb1對(duì)照品150μg、人參皂苷Ro對(duì)照品100μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備取紅參粉末，過四號(hào)篩，0.8～1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流提取1～2小時(shí)，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；

測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各1～2μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，即得。

本發(fā)明含量測(cè)定方法中，流動(dòng)相B優(yōu)選為0.05％磷酸；取樣量?jī)?yōu)選為1.0g；測(cè)定法中分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液的量?jī)?yōu)選為1μl，注入液相色譜儀。

本發(fā)明含量測(cè)定方法最優(yōu)的技術(shù)方案為：

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱采用BEH C₁₈色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相A，0.05％磷酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～9分鐘，流動(dòng)相A：18％→20％；9～11分鐘，流動(dòng)相A：20％→28％；11～40分鐘，流動(dòng)相A保持28％；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm；流速0.4ml/min；

混合對(duì)照品溶液的制備

取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、人參皂苷Rf對(duì)照品、人參皂苷Rb1對(duì)照品、人參皂苷Ro對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含人參皂苷Rg1對(duì)照品80μg、人參皂苷Re對(duì)照品60μg、人參皂苷Rf對(duì)照品50μg、人參皂苷Rb1對(duì)照品150μg、人參皂苷Ro對(duì)照品100μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備取紅參粉末，過四號(hào)篩，1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流提取1.5小時(shí)，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；

測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，即得。

為了驗(yàn)證測(cè)定含量方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、專屬性及系統(tǒng)適應(yīng)性，對(duì)方法進(jìn)行了以下方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以確保該含量測(cè)定方法可以用于紅參的質(zhì)量控制。

1、儀器與材料

儀器：Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀(雙三元泵，DAD檢測(cè)器)，METTLER AE240電子天平，METTLER AE163電子天平。

對(duì)照品：人參皂苷Rg1(中檢院，批號(hào)：110703～201529)、人參皂苷Re(中檢院，批號(hào)：110754～201525)、人參皂苷Rf(中檢院，批號(hào)：111719～201505)、人參皂苷Rb1(中檢院，批號(hào)：110704～201424)、人參皂苷Ro(中檢院，批號(hào)：111903～201102)購自中國食品藥品檢定研究院。

試劑：乙腈為色譜純(Merck)，水為超純水(由MILLIPORE超純水制水機(jī)自制)，其它試劑均為分析純。

2、方法與結(jié)果

2.1混合對(duì)照品溶液的制備

取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、人參皂苷Rf對(duì)照品、人參皂苷Rb1對(duì)照品、人參皂苷Ro對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含人參皂苷Rg1對(duì)照品80μg、人參皂苷Re對(duì)照品60μg、人參皂苷Rf對(duì)照品50μg、人參皂苷Rb1對(duì)照品150μg、人參皂苷Ro對(duì)照品100μg的混合溶液，即得。

2.2供試品溶液的制備

取本品粉末(過四號(hào)篩)約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流提取1.5小時(shí)，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3色譜條件

色譜柱：WATERS ACQUITY UPLC BEH C₁₈(2.1×100mm，1.7μm)

流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，0.05％磷酸水溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序詳見表1；流速0.4ml·min^-1，柱溫為40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm，對(duì)照品溶液與供試品溶液進(jìn)樣量各1μl。

表1流動(dòng)相梯度洗脫表

含量測(cè)定的色譜圖見圖1，可見各人參皂苷類成分分離良好，待測(cè)成分峰附近沒有干擾峰，專屬性較好。

2.4流動(dòng)相選擇

皂苷類物質(zhì)紫外吸收非常弱，紫外檢測(cè)器通常采用203nm波長(zhǎng)檢測(cè)，由于有機(jī)羧酸存在末端吸收現(xiàn)象，在203nm波長(zhǎng)下基線噪音很大，干擾皂苷類含量測(cè)定，所以不選擇甲酸、乙酸水溶液或甲酸鹽、乙酸鹽緩沖鹽溶液作為流動(dòng)相水相。實(shí)驗(yàn)摸索過程中考察了乙腈～水、乙腈～0.1％磷酸溶液、乙腈～0.05％磷酸溶液、乙腈～磷酸緩沖鹽溶液等不同梯度的洗脫系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)用乙腈～水作為流動(dòng)相時(shí)，人參皂苷Ro不能被洗脫分離；選用乙腈～磷酸緩沖鹽溶液作為流動(dòng)相時(shí)，人參皂苷Rb1與其他未知色譜峰不易分離，干擾準(zhǔn)確測(cè)定含量。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，當(dāng)采用乙腈～0.05％磷酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，基線平穩(wěn)，5種人參皂苷分離度良好且峰形較佳。

2.5提取方式的選擇

取同一批樣品適量，選取80％甲醇作為提取溶劑，分別采用超聲、回流兩種提取方式進(jìn)行試驗(yàn)，按擬定色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明采用超聲與回流兩種提取方式，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Ro的測(cè)定結(jié)果沒有差別，而人參皂苷Rb1的測(cè)定結(jié)果回流明顯高于超聲，因此，選用回流作為本實(shí)驗(yàn)的提取方式(結(jié)果見表2)。

表2不同提取方式五種成分的含量測(cè)定結(jié)果

2.6提取溶劑的選擇

取同一批樣品適量，分別以甲醇、80％甲醇、60％甲醇、40％甲醇作為提取溶劑，回流處理1h。結(jié)果表明采用80％的甲醇作為提取溶劑五種成分的含量測(cè)定結(jié)果均較高，因此，選用80％的甲醇作為提取溶劑(結(jié)果見表3)。

表3不同提取溶劑五種成分的含量測(cè)定結(jié)果

2.7提取時(shí)間的選擇

取同一批樣品適量，回流提取時(shí)間分別為0.5、1、1.5、2h，按擬定色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明回流1.5h能保證所有成分提取完全，故選擇回流提取1.5h(結(jié)果見表4)。

表4不同提取時(shí)間四種成分的含量測(cè)定結(jié)果

2.8線性關(guān)系考察

精密量取人參皂苷Rg1(濃度依次為：0.01650mg/ml、0.06602mg/ml、0.082520mg/ml、0.1650mg/ml、0.3301mg/ml、0.8252mg/ml)、人參皂苷Re(濃度依次為：0.01323mg/ml、0.02646mg/ml、0.05293mg/ml、0.06616mg/ml、0.1323mg/ml、0.6616mg/ml)、人參皂苷Rf(濃度依次為：0.009568mg/ml、0.01914mg/ml、0.04784mg/ml、0.09568mg/ml、0.1914mg/ml、0.4784mg/ml)、人參皂苷Rb1(濃度依次為：0.02261mg/ml、0.09045mg/ml、0.1809mg/ml、0.4522mg/ml、0.9045mg/ml、2.261mg/ml)、人參皂苷Ro(濃度依次為：0.01202mg/ml、0.04809mg/ml、0.09619mg/ml、0.2405mg/ml、0.4809mg/ml、1.202mg/ml)1μl分別注入液相色譜儀，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1在0.01650～0.8252μg之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y＝644011x-593.85(r＝0.9999)；人參皂苷Re在0.01323～0.6616μg之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y＝488436x+413.18(r＝0.9999)；人參皂苷Rf在0.009568～0.4784μg之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y＝779269x～2959.3(r＝0.9999)，人參皂苷Rb1在0.02261～2.2612μg之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y＝586991x+1538.7(r＝0.9999)，人參皂苷Ro在0.01202～1.202μg之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y＝722156x～955.27(r＝0.9999)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5紅參五成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.9精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積。結(jié)果顯示各人參皂苷色譜峰面積R SD(n＝6)均不大于2.0％。表明本方法的儀器精密度良好(結(jié)果見表6)。

表6精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.10穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，考察0、2、4、6、9、12、24h，結(jié)果顯示各人參皂苷峰面積R SD(n＝7)均不大于2.0％。結(jié)果表明，供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定(結(jié)果見表7)。

表7穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.11重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品，研細(xì)，取0.5g、1.0g、1.5g各三份，精密稱定，平行制成供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好(結(jié)果見表8)。

表8重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.12回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品粉末9份，每份約0.5g，精密稱定，每三份為一組，分別加入用80％甲醇溶液配制的低、中、高三個(gè)濃度的上述5種人參皂苷對(duì)照品溶液25ml，按供試品溶液制備項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表9～13。表明本方法回收率較好。

表9人參皂苷Rg1回收率試驗(yàn)結(jié)果

表10人參皂苷Re回收率試驗(yàn)結(jié)果

表11人參皂苷Rf回收率試驗(yàn)結(jié)果

表12人參皂苷Rb1回收率試驗(yàn)結(jié)果

表13人參皂苷Ro回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.13樣品測(cè)定

取收集到的紅參藥材、飲片共15批，按“2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表14。

表14紅參樣品含量測(cè)定結(jié)果

附圖說明

圖1紅參中五種人參皂苷類成分含量測(cè)定色譜圖；

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱采用BEH C₁₈色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相A，0.05％磷酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～9分鐘，流動(dòng)相A：18％→20％；9～11分鐘，流動(dòng)相A：20％→28％；11～40分鐘，流動(dòng)相A保持28％；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm；流速0.4ml/min；

混合對(duì)照品溶液的制備

取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、人參皂苷Rf對(duì)照品、人參皂苷Rb1對(duì)照品、人參皂苷Ro對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含人參皂苷Rg1對(duì)照品80μg、人參皂苷Re對(duì)照品60μg、人參皂苷Rf對(duì)照品50μg、人參皂苷Rb1對(duì)照品150μg、人參皂苷Ro對(duì)照品100μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備取紅參粉末，過四號(hào)篩，1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流提取1.5小時(shí)，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；

測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，即得。

實(shí)施例2

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱采用BEH C₁₈色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相A，0.10％磷酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～9分鐘，流動(dòng)相A：18％→20％；9～11分鐘，流動(dòng)相A：20％→28％；11～40分鐘，流動(dòng)相A保持28％；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm；流速0.4ml/min；

混合對(duì)照品溶液的制備

取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、人參皂苷Rf對(duì)照品、人參皂苷Rb1對(duì)照品、人參皂苷Ro對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含人參皂苷Rg1對(duì)照品80μg、人參皂苷Re對(duì)照品60μg、人參皂苷Rf對(duì)照品50μg、人參皂苷Rb1對(duì)照品150μg、人參皂苷Ro對(duì)照品100μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備取紅參粉末，過四號(hào)篩，0.8g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流提取1小時(shí)，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；

測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，即得。

實(shí)施例3

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱采用BEH C₁₈色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相A，0.05％磷酸為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～9分鐘，流動(dòng)相A：18％→20％；9～11分鐘，流動(dòng)相A：20％→28％；11～40分鐘，流動(dòng)相A保持28％；檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm；流速0.4ml/min；

混合對(duì)照品溶液的制備

取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品、人參皂苷Rf對(duì)照品、人參皂苷Rb1對(duì)照品、人參皂苷Ro對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含人參皂苷Rg1對(duì)照品80μg、人參皂苷Re對(duì)照品60μg、人參皂苷Rf對(duì)照品50μg、人參皂苷Rb1對(duì)照品150μg、人參皂苷Ro對(duì)照品100μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備取紅參粉末，過四號(hào)篩，1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，加熱回流提取2小時(shí)，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；

測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，即得。

上述實(shí)施例均按照藥典進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果顯示方法準(zhǔn)確可靠、靈敏、專屬，各項(xiàng)指標(biāo)均符合質(zhì)量控制的要求。