本發(fā)明涉及醫(yī)學檢測及體外診斷領域，具體涉及一種膠乳定向偶聯(lián)技術(shù)檢測脂蛋白(a)的試劑盒。
背景技術(shù)：
：：脂蛋白(a)是一種特殊獨立的血漿脂蛋白，類似低密度脂蛋白(LDL)的脂質(zhì)，是1963年挪威遺傳學家Berg在研究低密度脂蛋白的遺傳學變異時發(fā)現(xiàn)的，主要在肝臟合成后分泌入血，其含量的變化在血栓性疾病，腎臟疾病，糖尿病等疾病中具有非常重要的臨床意義。目前市場上脂蛋白(a)檢測技術(shù)常用的方法有如下幾種：單向免疫擴散(SRID)、放射免疫測定法(RIA)、熒光免疫測定發(fā)(FIA)、時間分辨熒光免疫測定法(TRFIA)、酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)、膠乳顆粒法、顆粒增強透射、免疫比濁法(PETIA)、顆粒增強散射免疫比濁法(PENIA)、膠乳增強免疫透射比濁法等，以膠乳增強免疫比濁法居多。膠乳增強免疫比濁法屬于普通免疫比濁技術(shù)的衍生技術(shù)，克服了普通免疫比濁技術(shù)信號量非常有限的缺點，使抗體體積有了數(shù)量級上的增長，大幅提升了可檢測性，成為一種簡便快速，靈敏度高的檢測方法，但該方法也存在巨大的技術(shù)難點，即抗體連接到膠乳微球上的方向無法控制，使得其活性及穩(wěn)定性(包括不隨時間的改變而發(fā)生變化及批間一致性)不能保證。因此，找到一種抗體與膠乳微球間定向偶聯(lián)的方法，將兩者連接的方向可控，是本領域亟需解決的技術(shù)問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：：鑒于以上技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提出一種膠乳定向偶聯(lián)技術(shù)檢測脂蛋白(a)的試劑盒，以膠乳增強免疫比濁法為基礎，運用抗體定向偶聯(lián)技術(shù)，通過N-羥基琥珀酰亞胺/馬來酰亞胺異雙功能交聯(lián)劑分別活化兩種粒徑的氨基聚苯乙烯膠乳微球，還原法還原抗人脂蛋白(a)單克隆抗體，使活化后的兩種粒徑的膠乳微球分別與還原后的抗人脂蛋白(a)單克隆抗體定向偶聯(lián)，形成抗人脂蛋白(a)膠乳顆粒，使抗體以Fc區(qū)連接微球，F(xiàn)ab區(qū)向外伸展，實現(xiàn)與樣本抗原高效結(jié)合。本發(fā)明的技術(shù)方案為：以N-羥基琥珀酰亞胺/馬來酰亞胺異雙功能交聯(lián)劑作為兩種粒徑的氨基聚苯乙烯膠乳微球的活化劑，形成活化態(tài)膠乳微球；還原法還原抗人脂蛋白(a)單克隆抗體，使抗體二硫鍵打開形成游離巰基，與活化態(tài)膠乳微球進行偶聯(lián)，形成穩(wěn)定的硫醚鍵，從而實現(xiàn)定向偶聯(lián)。以此方法為基礎制備檢測試劑盒，試劑1包括緩沖液、穩(wěn)定劑和防腐劑，試劑2包括抗人脂蛋白(a)膠乳微球、緩沖液、保護劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。本發(fā)明試劑盒所述試劑1與試劑2中的緩沖液包括但不限于Tris-HCL緩沖液，PBS緩沖液，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液中的一種或幾種，更優(yōu)選PBS緩沖液。PH范圍為6.5-8.5，更優(yōu)選PH6.5-7.5。本發(fā)明試劑盒所述試劑1中的穩(wěn)定劑包括但不限于聚乙二醇8000，蔗糖，甘油，葡萄糖，明膠，氯化鈉，氯化鉀，碳酸鈉，硫酸鈉，硫酸鉀中的一種或幾種，更優(yōu)選聚乙二醇8000。本發(fā)明試劑盒所述試劑1與試劑2中的防腐劑包括但不限于疊氮鈉，proclin300，硫柳汞中的一種或幾種。本發(fā)明試劑盒所述試劑2中的保護劑為EDTA。本發(fā)明試劑盒所述試劑2中的穩(wěn)定劑包括但不限于聚乙二醇8000，蔗糖，甘油，葡萄糖，明膠，氯化鈉，氯化鉀，碳酸鈉，硫酸鈉，硫酸鉀中的一種或幾種，更優(yōu)選蔗糖。進一步地，以上述優(yōu)選材料配制試劑盒(液體雙試劑，R1∶R2為4∶1)，濃度分別為本發(fā)明試劑盒所述試劑2中的抗人脂蛋白(a)膠乳微球具體制備如下：1)氨基聚苯乙烯膠乳微球的活化分別取濃度均為2.5％(w/v)的兩種粒徑的氨基聚苯乙烯膠乳微球與N-羥基琥珀酰亞胺/馬來酰亞胺異雙功能交聯(lián)劑，按投料比為1∶5(重量比)混合于PBS緩沖液(20mmol/L，PH7.0)中，25℃活化30-60min，高速離心(10000rpm，30min)，去除上清液，用PBS緩沖液(20mmol/L，PH7.0)洗滌兩次去除多余交聯(lián)劑，洗滌后用PBS緩沖液(20mmol/L，PH7.0)配成1％(w/v)混合液，25℃震蕩10-20min重懸，獲得活化膠乳微球。所述的氨基聚苯乙烯膠乳微球粒徑分別選擇100-200nm，200-300nm兩種規(guī)格，更優(yōu)選粒徑分別為110nm和200m。顆粒比例為20∶80-80∶20，更優(yōu)選60∶40。所述的N-羥基琥珀酰亞胺/馬來酰亞胺異雙功能交聯(lián)劑包括但不限于4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(Sulfo-SMCC)，4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯(SMCC)，硫代琥珀酰亞胺基4-(p-馬來酰亞胺苯基)丁酯(Sulfo-SMPB)，琥珀酰亞胺基4-(p-馬來酰亞胺苯基)丁酸鹽(SMPB)，琥珀酰亞胺基-6-[(β-馬來酰亞胺丙酰胺基)]己酯(SMPH)，m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基硫代琥珀酰亞胺酯(Sulfo-MBS)，N-[κ-馬來酰亞胺十一酰氧]-硫代琥珀酰亞胺酯(Sulfo-KMUS)，N-[γ-馬來酰亞胺丁酰氧]琥珀酰亞胺酯(Sulfo-GMBS)，N-[ε-馬來酰亞胺乙?；鮙硫代琥珀酰亞胺酯(Sulfo-EMCS)中的一種或幾種，更優(yōu)選4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(Sulfo-SMCC)。2)抗人脂蛋白(a)單克隆抗體還原取抗人脂蛋白(a)單克隆抗體與還原劑(1-10mM)，按投料比為1∶800(重量比)混合于PBS緩沖液(20mmol/L，PH7.0)中，25℃還原30min，通過superdex200層析分離去除多余還原劑，加入碘乙酰胺0.5mg，37℃封閉巰基30-45min。所述為鼠抗人脂蛋白(a)單克隆抗體或羊抗人脂蛋白(a)單克隆抗體中的任意一種。所述的還原劑包括但不限于二硫蘇糖醇(DTT)，β-巰基乙醇(ME)，三(2-羧乙基)膦(TCEP)中的一種或幾種，更優(yōu)選三(2-羧乙基)膦(TCEP)。3)活化膠乳微球與還原后的抗體于PBS緩沖液(20mmol/L，PH7.0)中，25℃定向偶聯(lián)60min，巰基乙醇(10mmol/L)淬滅30min后，高速離心(10000rpm，30min)，去除上清液，用PBS緩沖液(20mmol/L，PH7.0)洗滌三次，用PBS緩沖液(20mmol/L，PH7.0)配成1％(w/v)混合液，25℃震蕩30min重懸，獲得抗人脂蛋白(a)膠乳顆粒。本發(fā)明試劑盒的檢測方法為膠乳增強免疫比濁法，測試條件及參數(shù)如下：1)檢測儀器：具有600nm波長、37℃恒溫裝置的生化分析儀。2)待測樣本：新鮮不溶血血清，可2-8℃保存。3)具體檢測程序：4)校準程序：多點定標，采用非線性校準模式。5)計算結(jié)果：以測定管ΔA，根據(jù)校準曲線可求得脂蛋白(a)含量。本發(fā)明的優(yōu)勢在于：利用兩種不同粒徑聚苯乙烯膠乳微球，在提升靈敏度的同時，具有較好的線性，提高了產(chǎn)品性能。利用定向偶聯(lián)方法使抗體連接方向可控，提高了抗體利用率，并實現(xiàn)與樣本抗原高效結(jié)合。降低抗體偶聯(lián)的隨機性后，大大降低了對批間差異控制的難度。本方法可以通用于各種不同抗體或蛋白質(zhì)與膠乳微球偶聯(lián)，易于形成規(guī)模化的工藝。附圖說明：圖1為實施例1中的本發(fā)明線性相關曲線圖，采用AU480全自動生化分析儀，對5個梯度濃度的試劑進行測定，并對測定值進行相關分析。其中X軸表示的是稀釋濃度，Y軸表示的是測定值均值。相關系數(shù)：r2＝0.9940，線性方程為：y＝1.0394x-24.5796。圖2為實施例2中的本發(fā)明線性相關曲線圖，采用AU480全自動生化分析儀，對5個梯度濃度的試劑進行測定，并對測定值進行相關分析。其中X軸表示的是稀釋濃度，Y軸表示的是測定值均值。相關系數(shù)：r2＝0.9956，線性方程為：y＝1.0170x-8.9948。圖3為實施例3中的本發(fā)明與市售試劑盒A線性相關圖，分別采用本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒A，采用AU480全自動生化分析儀，對50份樣本(包含正常和異常樣本)，按各自參數(shù)進行測定。其中X軸表示的是本發(fā)明試劑盒的測定值，Y軸表示的是市售試劑盒A的測定值。相關系數(shù)：r2＝0.9971，線性方程為：y＝1.000x+2.016。圖4為實施例4中的本發(fā)明與市售試劑盒B線性相關圖，分別采用本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒B，采用AU480全自動生化分析儀，對50份樣本(包含正常和異常樣本)，按各自參數(shù)進行測定。其中X軸表示的是本發(fā)明試劑盒的測定值，Y軸表示的是市售試劑盒B的測定值。相關系數(shù)：r2＝0.9948，線性方程為：y＝1.001x+1.374。具體實施方式：以下通過實施例具體闡明本發(fā)明，僅作為說明本發(fā)明具體內(nèi)容而不用于限制本發(fā)明范圍。實施例1.脂蛋白(a)檢測試劑盒的配制(1)抗人脂蛋白(a)膠乳微球的配制與技術(shù)方案中的所提到的過程相同。脂蛋白(a)檢測試劑盒具體成分配制如下：1)精密度測定：同一樣品中連續(xù)抽取20次進行測定，計算測定值的均數(shù)、標準差和變異系數(shù)，表1精密度檢測結(jié)果變異系數(shù)CV通常用于衡量一項測定方法的精密度，CV值越小，表示該測定方法的結(jié)果精密度越好。對于臨床化學檢驗項目而言，CV小于5％的方法精密度公認是可以接受的。表1中CV值小于3％，表明本發(fā)明試劑盒具有優(yōu)良的精密度。2)準確度測定：用同一質(zhì)控品，重復測定3次，取平均值，與質(zhì)控品靶值相對偏差應在±15％范圍內(nèi)。表2準確度檢測結(jié)果表2中相對偏差CB＝5.31％，處于±15％范圍內(nèi)，表明本發(fā)明試劑盒具有優(yōu)良的準確度。3)線性測定：使用去離子水將試劑稀釋成5個梯度濃度，每個梯度濃度檢測3次，取平均值，對測定值與預期值作回歸分析，計算r值和相對偏差(結(jié)果見圖1，單位mg/L)。表3線性相關檢測結(jié)果通過表3得到相關系數(shù)：r2＝0.9940，線性方程為：y＝1.0394x-24.5796，結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒相關性良好，具有很好的特異性和準確性。4)穩(wěn)定性測定：將本發(fā)明試劑盒分別放置在室溫和4℃冰箱，以新鮮配制的900mg/L人脂蛋白(a)標準品替代樣品，每隔1個月測定1次，記錄出現(xiàn)凝集所需時間，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，試劑盒在4℃冰箱放置至少6個月以上不會有明顯活性喪失，但不宜在室溫存放。表4穩(wěn)定性檢測結(jié)果5)特異性測定：選取進行干擾實驗測定，分別取4份質(zhì)控，其中一份做為對照，其他三份分別加入3種潛在干擾物：膽紅素、甘油三酯、血紅蛋白，用本發(fā)明試劑盒進行測定，均無抑制效果，表明該試劑盒有良好特異性，結(jié)果如表5所示：表5特異性檢測結(jié)果模擬干擾物加入濃度測定值對照組測定值準確(CB％)膽紅素1.03mg/dl246mg/L250mg/L-1.6％三酰甘油11.3mg/dl257mg/L250mg/L2.8％血紅蛋白5.0g/L258mg/L250mg/L3.2％實施例2.脂蛋白(a)檢測試劑盒的配制(2)抗人脂蛋白(a)膠乳微球的配制與技術(shù)方案中的所提到的過程相同。脂蛋白(a)檢測試劑盒具體成分配制如下：1)精密度測定：同一樣品中連續(xù)抽取20次進行測定，計算測定值的均數(shù)、標準差和變異系數(shù)，表6精密度檢測結(jié)果變異系數(shù)CV通常用于衡量一項測定方法的精密度，CV值越小，表示該測定方法的結(jié)果精密度越好。對于臨床化學檢驗項目而言，CV小于5％的方法精密度公認是可以接受的。表6中CV值小于3％，表明本發(fā)明試劑盒具有優(yōu)良的精密度。2)準確度測定：用同一質(zhì)控品，重復測定3次，取平均值，與質(zhì)控品靶值相對偏差應在±15％范圍內(nèi)。表7準確度檢測結(jié)果表7中相對偏差CB＝8.65％，處于±15％范圍內(nèi)，表明本發(fā)明試劑盒具有優(yōu)良的準確度。3)線性測定：使用去離子水將試劑稀釋成5個梯度濃度，每個梯度濃度檢測3次，取平均值，對測定值與預期值作回歸分析，計算r值和相對偏差(結(jié)果見圖2，單位mg/L)。表8線性相關檢測結(jié)果稀釋濃度150.00250.00500.00750.001000.00測定值151.35256.71480.58721.691039.35144.33260.08500.29721.621032.58141.77268.52482.01717.361031.84均值1462624887201035絕對偏差2.2616.5211.8733.5226.61相對偏差-1.58％-6.74％2.38％4.45％-2.64％通過表8得到相關系數(shù)：r2＝0.9956，線性方程為：y＝1.0170x-8.9948，結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒相關性良好，具有很好的特異性和準確性。4)穩(wěn)定性測定：將本發(fā)明試劑盒分別放置在室溫和4℃冰箱，以新鮮配制的900mg/L人脂蛋白(a)標準品替代樣品，每隔1個月測定1次，記錄出現(xiàn)凝集所需時間，結(jié)果見表9。結(jié)果表明，試劑盒在4℃冰箱放置至少6個月以上不會有明顯活性喪失，但不宜在室溫存放。表9穩(wěn)定性檢測結(jié)果室溫下出現(xiàn)凝集的時間(min)4℃下出現(xiàn)凝集的時間(min)新配制1新配制1存放1個月1存放1個月1存放2個月2存放2個月1存放3個月不凝集存放3個月1存放4個月不凝集存放4個月2存放5個月不凝集存放5個月2存放6個月不凝集存放6個月35)特異性測定：選取進行干擾實驗測定，分別取4份質(zhì)控，其中一份做為對照，其他三份分別加入3種潛在干擾物：膽紅素、甘油三酯、血紅蛋白，用本發(fā)明試劑盒進行測定，均無抑制效果，表明該試劑盒有良好特異性，結(jié)果如表10所示：表10特異性檢測結(jié)果實施例3.本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒A的性能指標比較：本發(fā)明脂蛋白(a)檢測試劑盒的配制：抗人脂蛋白(a)膠乳微球的配制與技術(shù)方案中的所提到的過程相同。脂蛋白(a)檢測試劑盒具體成分配制如下：對照的市售試劑盒A，其信息如下：產(chǎn)品名稱：脂蛋白a(Lpa)測定試劑盒(上海聚創(chuàng)醫(yī)藥科技有限公司)方法：乳膠增強比濁法劑型：液體雙試劑(4∶1)試劑成份：分析方法：6點標準曲線定標法，即試劑R1，試劑R2用量分別為240μl和60μl，樣本用量4μl。240μl試劑R1加入4μl樣本，于37℃反應5min后加入60μl試劑R2，在測定波長600nm下，立即讀取各管吸光度A1讀數(shù)，37℃反應5min后讀取讀取各管吸光度A2讀數(shù)，ΔA＝A2-A1。檢測儀器：AU480市售試劑盒A按說明書操作。1)精密度測定：同一樣品中連續(xù)抽取20次進行測定，計算測定值的均數(shù)、標準差和變異系數(shù)，表11精密度檢測結(jié)果變異系數(shù)CV通常用于衡量一項測定方法的精密度，CV值越小，表示該測定方法的結(jié)果精密度越好。對于臨床化學檢驗項目而言，CV小于5％的方法精密度公認是可以接受的。表11中CV值小于5％，表明本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒A同樣具有較好的精密度。2)準確度測定：用同一質(zhì)控品，重復測定3次，取平均值，與質(zhì)控品靶值相對偏差應在±15％范圍內(nèi)。表12準確度檢測結(jié)果表12中本發(fā)明試劑盒相對偏差CB＝4.23％，處于±15％范圍內(nèi)，表明本發(fā)明試劑盒較市售試劑盒A具有更好的準確度。3)線性測定：分別采用本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒A，采用AU480全自動生化分析儀，對50份樣本(包含正常和異常樣本)，按各自參數(shù)進行測定，并對測定值進行相關分析(結(jié)果見圖3，X軸表示的是本發(fā)明試劑盒的測定值，Y軸表示的是市售試劑盒A的測定值)。相關系數(shù)：r2＝0.9971，線性方程為：y＝1.000x+2.016，結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒A相關性良好。表13線性相關檢測結(jié)果實施例4.本發(fā)明檢測試劑盒與市售試劑盒B的性能指標比較：本發(fā)明脂蛋白(a)檢測試劑盒的配制：抗人脂蛋白(a)膠乳微球的配制與技術(shù)方案中的所提到的過程相同。脂蛋白(a)檢測試劑盒具體成分配制如下：對照的市售試劑盒B，其信息如下：產(chǎn)品名稱：脂蛋白a檢測試劑盒(日本協(xié)和)方法：乳膠比濁法劑型：液體雙試劑(4∶1)試劑成份：試劑1：緩沖液試劑2：抗人Lp(a)(山羊)抗體耐受性乳膠分析方法：多點定標，即試劑R1，試劑R2用量分別為280μl和70μl，樣本用量3μl。280μl試劑R1加入3μl樣本，于37℃反應5min后加入70μl試劑R2，在測定波長600nm下，立即讀取各管吸光度A1讀數(shù)，37℃反應10min后讀取讀取各管吸光度A2讀數(shù)，ΔA＝A2-A1。檢測儀器：AU480市售試劑盒B按說明書操作。1)精密度測定：同一樣品中連續(xù)抽取20次進行測定，計算測定值的均數(shù)、標準差和變異系數(shù)，表14精密度檢測結(jié)果變異系數(shù)CV通常用于衡量一項測定方法的精密度，CV值越小，表示該測定方法的結(jié)果精密度越好。對于臨床化學檢驗項目而言，CV小于5％的方法精密度公認是可以接受的。表14中CV值小于5％，表明本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒B同樣具有較好的精密度。2)準確度測定：用同一質(zhì)控品，重復測定3次，取平均值，與質(zhì)控品靶值相對偏差應在±15％范圍內(nèi)。表15準確度檢測結(jié)果表15中本發(fā)明試劑盒相對偏差CB＝3.56％，處于±15％范圍內(nèi)，表明本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒B同樣具有較好的準確度。3)線性測定：分別采用本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒B，采用AU480全自動生化分析儀，對50份樣本(包含正常和異常樣本)，按各自參數(shù)進行測定，并對測定值進行相關分析(結(jié)果見圖4，X軸表示的是本發(fā)明試劑盒的測定值，Y軸表示的是市售試劑盒B的測定值)。相關系數(shù)：r2＝0.9948，線性方程為：y＝1.001x+1.374，結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒與市售試劑盒B相關性良好。表16線性相關檢測結(jié)果當前第1頁1 2 3