本發(fā)明涉及生物醫(yī)學檢測領域，具體而言，涉及一種基于抗原-適配體的競爭法檢測試紙條及其應用。
背景技術：
：核酸適配體(Aptamer)是一種單鏈的寡核苷酸，多為單鏈DNA，長度在10～100bp之間，通常是利用特異的靶標從隨機序列的寡核苷酸文庫中通過體外篩選獲得，作為一種新型生物識別分子，可以與靶標物質高親和力特異性結合。目前文獻報道的已經(jīng)篩選到適配體的靶標有幾百種，建立的基于適配體的檢測方法主要包括比色法、熒光法、電化學等上百種方法，但到目前為止基于適配體的商品化的檢測產品還幾乎沒有。膠體金免疫層析試紙條技術是目前最常見最成熟也最受歡迎的快速檢測產品形式之一，被廣泛應用與臨床診斷、食品安全以及環(huán)境分析等，比如著名的早孕試紙條、瘦肉精試紙條等。適配體作為一種特異性的識別分子，也可以被用來開發(fā)基于試紙條形式的快速檢測產品，但是目前有關適配體試紙條的文獻報道卻很少，僅有幾篇文獻。這些文獻一般采用的原理是在試紙條檢測線處固定適配體的互補鏈，樣品中含有靶標時，標記有熒光或膠體金的適配體和樣品中的靶標結合，則不能和試紙條檢測線處的互補鏈結合，檢測線處熒光信號降低或不出信號；反之，樣品中沒有靶標時，標記有熒光或膠體金的適配體流經(jīng)試紙條時和檢測線處的互補鏈結合，檢測線處出現(xiàn)較強的信號，從而根據(jù)熒光或膠體金信號大小判斷樣品中靶標含量。然而，在實際的應用中，由于該檢測方法的原理主要是基于適配體-靶標和適配體-互補鏈的競爭來實現(xiàn)的，因此很難設計比較可靠的檢測方法。由于不同適配體長度不同，因此其互補鏈的長度也不同，從而適配體與互補鏈的的親和力也不同。由于適配體鏈一般比較長，所以適配體與互補鏈的親和力經(jīng)常大于適配體與靶標的親和力，從而導致無法檢測；目前文獻的解決方法都是通過將互補鏈截短，僅將部分互補鏈固定到檢測線上，從而降低互補鏈和適配體的親和力，但是這種方法需要繁雜的摸索，且互補鏈長度過短時適配體無法與互補鏈雜交，從而也導致無法檢測。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種基于抗原-適配體的競爭法檢測試紙條，以解決上述問題。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術方案：一種基于抗原-適配體的競爭法檢測試紙條，所述試紙條包括樣品吸收墊、標記物墊、反應膜、吸水墊和底板；所述標記物墊包被有檢測探針，所述檢測探針為標有顯示信號強度的指示劑的檢測靶標物的適配體；所述反應膜上設置有檢測區(qū)和質檢區(qū)；所述檢測區(qū)固定包被有靶標物抗原；所述質檢區(qū)固定包被有質控探針。本發(fā)明提出了利用靶標抗原代替互補鏈的方法，將靶標抗原固定到試紙條檢測線，這樣適配體與樣品中的靶標和檢測線上的靶標親和力一致，保證了檢測方法的可行性和準確性。且實驗條件也更簡單，摸索起來更容易。優(yōu)選的，如上所述的基于抗原-適配體的競爭法檢測試紙條，當所述靶標物為有機物大分子靶標時，所述靶標物抗原即為靶標物本身；當所述靶標物為無機小分子靶標時，所述靶標物抗原為所述無機小分子靶標與載體蛋白的偶聯(lián)物。這里所指的大分子是指可以直接固定到膜上并暴露抗原表位的物質，小分子是指需要通過偶聯(lián)載體蛋白才能固定到膜上并暴露抗原表位的物質。優(yōu)選的，如上所述的基于抗原-適配體的競爭法檢測試紙條，所述載體蛋白包括酪蛋白、牛血清白蛋白或雞卵清白蛋白。雞卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)由386個氨基酸組成，分子量約43Kd。OVA作為載體蛋白可以協(xié)助小分子物質固定到硝酸纖維素膜上并暴露其抗原表位，從而利于抗原與適配體的結合。同樣的，載體蛋白也可選用酪蛋白(Casein)或牛血清白蛋白(BSA)等。優(yōu)選的，如上所述的基于抗原-適配體的競爭法檢測試紙條，所述顯示信號強度的指示劑包括熒光物質、生物素、放射性同位素、電子致密物、膠體金或酶中的任一種。優(yōu)選的，如上所述的基于抗原-適配體的競爭法檢測試紙條，所述熒光標記包括Alexa350、Alexa405、Alexa430、Alexa488、Alexa555、Alexa647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基熒光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯熒光素、5-羧基熒光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、CascadeBlue、Cy2、Cy3、Cy5、CY7、6-FAM、丹磺酰氯、熒光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑)、OregonGreen488、OregonGreen500、OregonGreen514、PacificBlue、鄰苯二甲酸、對苯二甲酸、間苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚藍紫、亮甲酚藍、對氨基苯甲酸、赤蘚紅、酞菁、偶氮甲堿、花青、黃嘌呤、琥珀酰熒光素、稀土金屬穴狀化合物、三雙吡啶基二胺銪、銪穴狀化合物或螯合物、二胺、雙花青苷、LaJolla藍染料、別藻藍蛋白、allococyaninB、藻藍蛋白C、藻藍蛋白R、硫胺、藻紅青蛋白、藻紅蛋白R、REG、羅丹明綠、羅丹明異硫氰酸酯、羅丹明紅、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基羅丹明異硫醇)、四甲基羅丹明和德克薩斯紅中的一種或多種。優(yōu)選的，如上所述的基于抗原-適配體的競爭法檢測試紙條，所述熒光物質包括PE、CY5、CY7、per-CP、TRITC、AlexaFluor647以及量子點中的任一種。優(yōu)選的，如上所述的基于抗原-適配體的競爭法檢測試紙條，所述質控探針的核酸序列與所述適配體上連接的序列互補。堿基的種類根據(jù)適配體的核苷酸序列進行選擇，以不出現(xiàn)與適配體發(fā)生內部的互補配對，且不影響適配體與靶標結合的效率的核苷酸序列為準。優(yōu)選的，如上所述的基于抗原-適配體的競爭法檢測試紙條，所述適配體上連接的序列為PolyA、PolyT、PolyG或PolyC中的一種。優(yōu)選的，堿基的數(shù)量為6～24個。優(yōu)選的，適配體上連接的序列在適配體核苷酸序列的5'端。優(yōu)選的，如上所述的基于抗原-適配體的競爭法檢測試紙條，所述適配體上連接的序列為PolyT18。與上述適配體上連接的序列配對的質控探針的核酸序列為：5'-biotin-AAA-AAA-AAA-AAA-AAA-AAA-3'。如上所述的抗原-適配體的競爭法檢測試紙條在檢測黃曲霉毒素B1和凝血酶中的應用。優(yōu)選的，如上所述的應用，包括：1)、用試紙條檢測靶標物標準品，得到標準品在試紙條的檢測區(qū)和質控區(qū)的信號強度比值，制作靶標標準品的濃度對應信號強度比值的線性回歸曲線，計算回歸方程；2)、用試紙條檢測待測樣品，得到待測樣品在試紙條的檢測區(qū)和質控區(qū)的信號強度比值，根據(jù)步驟1)得到回歸方程，得到所述待測樣品中靶標物的含量。用上述的試紙條檢測靶標標準品或待測樣品，得到標準品在所述試紙的檢測區(qū)和質控區(qū)的熒光或顯色信號比值包括如下步驟：取靶標標準品或待測樣品滴加到試紙的樣品吸收墊上，10分鐘后，將試紙條放入試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3中進行檢測，分別測定檢測區(qū)和質控區(qū)的熒光或顯色信號強度；將檢測區(qū)的熒光信號強度(T)比上質控區(qū)的熒光信號強度(C)，得到T/C值，為檢測區(qū)和質控區(qū)的熒光信號比值。本發(fā)明基于抗原-適配體的競爭法檢測試紙條具有設計簡單、結果可靠、靈敏度高、精確定量、特異性強、簡單方便和檢測時間短的優(yōu)點。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：1)、由于以抗原代替了目前試紙條檢測區(qū)中的適配體的互補鏈，徹底避免了由于適配體-靶標和適配體-互補鏈親和力差異使得過于雜交或雜交不上帶來的檢測誤差，提高了檢測方法的穩(wěn)定性；2)、本發(fā)明避免了目前適配體試紙條繁雜的互補鏈截短設計，利用抗原代替互補鏈使得基于適配體的試紙條設計開發(fā)更為容易簡單；3)、本發(fā)明試紙條通過設置檢測區(qū)/質控區(qū)信號比值作為數(shù)據(jù)歸一化方法，降低了不同紙條間不同操作人員乃至不同儀器掃描的實驗誤差，將不同紙條測得的樣品值代入標準曲線，即可以達到精確定量的效果；4)、由于采用了適配體作為識別分子，基于適配體對靶標的高親和力和高特異性，因此本發(fā)明試紙條具有高靈敏高特異性的優(yōu)點；5)、核酸適配體具有非常好的熱穩(wěn)定性，因此本發(fā)明的試紙條還可以常溫儲運，具有貨架期長、結果可靠等優(yōu)點。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本發(fā)明提供的試紙條的結構示意圖；圖2為不同AFB1濃度下檢測區(qū)處熒光強度檢測結果圖；第一個波峰代表檢測區(qū)信號值(箭頭所示)；圖3為本申請實施例1中AFB1濃度與T/C值線性關系的標準曲線；圖4為本申請實施例1中對AFB1試紙?zhí)禺愋缘臋z測結果圖；第一個波峰代表檢測區(qū)信號值(箭頭所示)；圖5為本申請實施例2中不同濃度凝血酶與試紙條反應時的質控區(qū)和檢測區(qū)信號值；圖6為本申請實施例2中凝血酶濃度與T/C值線性關系的標準曲線。附圖標記：1樣品吸收墊；2標記物墊；3反應膜；4吸水墊；5底板；6檢測區(qū)；7質控區(qū)；8待檢靶標；9標有用于顯示信號強度的指示劑的檢測靶標物的適配體；10固定包被在檢測區(qū)的靶標物抗原；11固定包被在質控區(qū)的質控探針。具體實施方式下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產品。實施例1檢測黃曲霉毒素B1試紙條的制備及在檢測黃曲霉毒素B1(AFB1)中的應用一、檢測黃曲霉毒素B1試紙條的制備1、檢測探針和質控探針的合成分別設計合成熒光素標記的檢測探針和生物素標記的質控探針。其中檢測探針為熒光素Cy5標記的帶有連接序列PolyT18的黃曲霉毒素B1適配體；黃曲霉毒素B1適配體可以和檢測區(qū)的黃曲霉毒素B1半抗原結合，黃曲霉毒素B1適配體的核苷酸序列如下：5'-Cy5-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-GTT-GGG-CAC-GTG-TTG-TCT-CTC-TGT-GTC-TCG-TGC-CCT-TCG-CTA-GGC-CCA-CA-3′質控探針為生物素標記的可以與黃曲霉毒素B1適配體連接序列結合的PolyA18，可以與檢測探針連接序列PolyT18通過堿基互補結合。質控探針的核酸序列為：5'-biotin-AAA-AAA-AAA-AAA-AAA-AAA-3'2、AFB1半抗原和載體蛋白BSA的偶聯(lián)物AFB1-BSA制備首先經(jīng)過肟化反應制備AFB1肟(AFB1-O)；然后用碳二亞胺法制備AFB1人工抗原，然后與陽離子化牛血清蛋白(C-BSA)的反應得到偶聯(lián)產物，即偶聯(lián)物AFB1-BSA。3、制備試紙條1)、標記物墊制備將檢測探針包被在標記物墊(上海杰一生物技術有限公司，JY-BX101)上(包被濃度為0.1μM)，得到包被檢測探針的標記物墊，37度過夜烘干。2)、反應膜制備反應膜包括檢測區(qū)和質控區(qū)。將偶聯(lián)物AFB1-BSA按照包被濃度為5μM包被在反應膜形成檢測區(qū)；質控探針為標記生物素的適配體連接序列的互補序列，其通過鏈酶親和素與其上的生物素偶聯(lián)形成共價鍵包被在反應膜上形成質控區(qū)，包被濃度為1μM。3)、試紙條組裝試紙條由樣品吸收墊(上海杰一生物技術有限公司，JY-BX111)、上述1)制備的包被檢測探針的標記物墊、上述2)制備的反應膜、吸水墊依次按照順序黏貼在底板上，且反應膜的檢測區(qū)與標記物墊相鄰，反應膜的檢質控區(qū)與吸水墊相鄰，如圖1所示。二、試紙條檢測原理如圖1所示，當不含黃曲霉毒素B1的樣品加入樣品吸收墊1上時，樣品在毛細作用下流動到標記物墊2，并帶著熒光標記的探針混合物一起繼續(xù)向前流動。當流動到檢測區(qū)6時，標有用于顯示信號強度的指示劑的檢測靶標物的適配體9會與檢測區(qū)6處固定的AFB1-BSA結合，出現(xiàn)熒光信號，經(jīng)試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3檢測出熒光信號強度；當流動到質控區(qū)7時，剩余的標有用于顯示信號強度的指示劑的檢測靶標物的適配體9會與固定包被在質控區(qū)的質控探針11互補結合，質控區(qū)7也出現(xiàn)熒光信號，經(jīng)試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3檢測出熒光信號強度。如圖1所示，當含有黃曲霉毒素B1的樣品加入樣品吸收墊上時，樣品在毛細作用下流動到標記物墊，黃曲霉毒素B1與檢測探針(適配體)結合，并在毛細作用下一起向前流動。當流動到檢測區(qū)時，未與黃曲霉毒素B1結合的檢測探針會與半抗原結合；當樣品中的AFB1越多，結合的檢測探針也就越來越多，剩余的游離檢測探針就會越來越少，和檢測區(qū)半抗原結合的檢測探針也就越少，熒光強度越低。反之，樣品中的黃曲霉毒素B1越少，剩余的游離檢測探針就會越來越多，和檢測區(qū)處半抗原結合也就越多，熒光強度越強，從而可以根據(jù)熒光強度的變化判斷樣品中黃曲霉毒素B1的濃度。三、試紙條檢測方法1)取黃曲霉毒素B1標準品滴加到試紙的樣品吸收墊上，10分鐘后，將試紙條放入試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3中，進行檢測，分別測定檢測區(qū)和質控區(qū)的熒光信號強度；將檢測區(qū)的熒光信號強度(T)比上質控區(qū)的熒光信號強度(C)，得到T/C值，制作黃曲霉毒素B1標準品的濃度對應熒光信號T/C比值的線性回歸曲線，計算回歸方程；2)將黃曲霉毒素標準品B1替換為待測樣品，用上述試紙檢測待測樣品，記錄在所述試紙的檢測區(qū)和質控區(qū)的熒光信號比值，根據(jù)步驟(1)的回歸方程，得到待測樣品中黃曲霉毒素的濃度。四、黃曲霉毒素B1試紙條在檢測黃曲霉毒素B1中的應用1、檢測黃曲霉毒素B1靈敏度與線性范圍研究配制圖2所示的不同濃度AFB1(FermentekLtd，AF028)水溶液，分別用實施例1制備的試紙條進行測定。用試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3分別測定檢測區(qū)和質控區(qū)處的熒光強度。結果如圖2所示，可以看出，隨著AFB1濃度增加，檢測區(qū)處熒光強度逐漸變小。利用檢測區(qū)熒光強度與質控區(qū)熒光強度比值(表1)，繪制檢測黃曲霉毒素B1的標準曲線如圖3所示，結果表明，試紙條的靈敏度0.5ng/mL；線性范圍為0.5ng/mL～50μg/mL。表1黃曲霉毒素B1標準品的檢測結果2、特異性研究配制濃度為100ng/mL的AFB1溶液、100ng/mL的AFM1(百靈威科技有限公司，6795-23-9)溶液、濃度為100ng/mL的黃曲霉毒素G1(百靈威科技有限公司，1165-39-5)、濃度為100ng/mL的黃曲霉毒素B2(百靈威科技有限公司，7220-81-7)、濃度為100ng/mL的赭曲酶毒素OchratoxinA(OTA，F(xiàn)ermentekLtd,OC030a)溶液、濃度為100ng/mL的玉米赤酶烯酮Zearalenone(ZEN，百靈威科技有限公司，17924-92-4)溶液，濃度為100ng/mL的嘔吐毒素Vomitoxin(DON，百靈威科技有限公司，51481-10-8)溶液和空白樣品分別用試紙條進行測定。用試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3分別測定檢測區(qū)和質控區(qū)處的熒光強度，結果如圖4所示，其中AFM1為AFB1代謝物，結構相似，表現(xiàn)出了近100％的交叉，而AFG1、AFB2、OTA、ZEN、DON以及空白樣品等均不能引起檢測區(qū)處熒光變化，這也說明本方法對黃曲霉毒素B1/M1具有很好的特異性。五、黃曲霉毒素B1試紙條在花生粕中黃曲霉毒素B1檢測中的應用1、標準曲線繪制同本實施例第一部分中檢測黃曲霉毒素B1靈敏度與線性范圍研究中的標準曲線方法，得到的回歸方程為：y＝-0.2076x+0.9881，R2＝0.99，為黃曲霉毒素B1標準曲線一元回歸方程。2、樣品提取選擇5份經(jīng)國標方法(LC-MSMS)測定過的花生粕黃曲霉毒素B1樣品，用本試紙條進行測定。首先稱取2g花生粕于50mL離心管中，加入8mL正己烷和10mL70％的甲醇水溶液，振蕩5min，室溫4000轉/分離心10min；去除上層液體，取0.5mL下層液體加入0.5mL去離子水，混勻，再取混勻液體0.5mL加入0.5mL35％的甲醇水溶液，振蕩30s；取100μL進行分析(樣品稀釋倍數(shù)為20倍)。3、樣品測定取上述制備好的待測樣品100μL滴加到所述試紙的樣品吸收墊上，觀察樣品層析沿著硝酸纖維素膜流動，直到被上面的吸水墊吸附；10分鐘后，將試紙條放入試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3中，進行檢測，分別測定檢測區(qū)和質控區(qū)的熒光信號強度；將檢測區(qū)的熒光信號強度(T)比上質控區(qū)的熒光信號強度(C)，將得到的計算值代入上述步驟1的回歸方程，計算得到待測樣品中黃曲霉毒素B1的濃度。4、檢測結果：5份花生粕實際樣品檢測結果如表2所示。從結果可以看出，本發(fā)明試紙條結果與LC-MS方法相比，回收率在110％～115％之間，回收率較好，說明本發(fā)明試紙條和LC-MS方法具有非常好一致性，同時可以看出本方法比LC-MS方法整體偏高，避免了可能的假陰性結果。另外本方法標準差小于10％，說明本方法具有很好的穩(wěn)定性。因此可以用于實際樣品中黃曲霉毒素B1的檢測。表2本發(fā)明試紙條檢測花生粕中AFB1結果與LC-MS方法比較實施例2檢測凝血酶試紙條的制備及在檢測凝血酶中的應用一、檢測凝血酶試紙條的制備1、檢測探針和質控探針的合成分別設計合成膠體金標記的檢測探針和生物素標記的質控探針。其中檢測探針為膠體金標記的帶有連接序列PolyT20的凝血酶適配體；凝血酶適配體可以和檢測區(qū)的凝血酶抗原結合，凝血酶適配體的核苷酸序列如下：5′-SH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGG-3′膠體金合成方法為：加熱煮沸100mL濃度為1mM的HAuCl4溶液，劇烈攪拌下加入10mL濃度為38.8mM的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)煮沸20分鐘，然后室溫冷卻，得到的膠體金粒徑為13nm。膠體金與適配體偶聯(lián)方法為：取10μL濃度為100μM巰基修飾的適配體、1μL醋酸鈉(pH＝5.20)和0.5μL濃度為10mM三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽混合避光孵育1小時，13000rpm離心20min后加入1mL合成好的膠體金室溫孵育16小時以上。然后加入12μLTris-Hac緩沖液(pH＝8.2)和100μL濃度1M的NaCl溶液進行鹽化一天。然后16,000rpm離心15min去除多余的適配體，然后用緩沖液重懸備用(100mLPB溶液，0.5gPEG20000，1gsucrose，0.1mLTween-20，0.02gMgSO4，and0.05g(NH4)2SO4))。質控探針為生物素標記的可以與凝血酶適配體連接序列結合的PolyT20，可以與檢測探針連接序列PolyA20通過堿基互補結合。質控序列的核苷酸序列為：5′-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-biotin-3′.2、制備試紙條1)、標記物墊制備將檢測探針包被在標記物墊(上海杰一生物技術有限公司，JY-BX101)上(包被濃度為0.1μM)，得到包被檢測探針的標記物墊，37度過夜烘干。2)、反應膜制備反應膜包括檢測區(qū)和質控區(qū)。將凝血酶抗原按照包被濃度為1mg/mL包被在反應膜形成檢測區(qū)；質控探針為標記生物素的適配體連接序列的互補序列，其通過鏈酶親和素與其上的生物素偶聯(lián)形成共價鍵包被在反應膜上形成質控區(qū)，包被濃度為5μM。3)、試紙條組裝試紙條由樣品吸收墊(上海杰一生物技術有限公司，JY-BX111)、上述1)制備的包被檢測探針的標記物墊、上述2)制備的反應膜、吸水墊依次按照順序黏貼在底板上，且反應膜的檢測區(qū)與標記物墊相鄰，反應膜的檢質控區(qū)與吸水墊相鄰，如圖1所示。二、試紙條檢測原理如圖1所示，當不含凝血酶的樣品加入樣品吸收墊1上時，樣品在毛細作用下流動到標記物墊2，并帶著膠體金標記的探針混合物一起繼續(xù)向前流動。當流動到檢測區(qū)6時，標有用于顯示信號強度的指示劑的檢測靶標物的適配體9會與檢測區(qū)6處固定的凝血酶抗原結合，出現(xiàn)膠體金紅色條帶，經(jīng)試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3檢測出高顯色信號強度；當流動到質控區(qū)7時，剩余的標有用于顯示信號強度的指示劑的檢測靶標物的適配體9會與固定包被在質控區(qū)的質控探針11，質控區(qū)7也出現(xiàn)紅色條帶，經(jīng)試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3檢測出顯色信號強度。如圖1所示，當含有凝血酶的樣品加入樣品吸收墊上時，樣品在毛細作用下流動到標記物墊，凝血酶與檢測探針(適配體)結合，并在毛細作用下一起向前流動。當流動到檢測區(qū)時，未與凝血酶結合的檢測探針會與凝血酶抗原結合；當樣品中的凝血酶越多，結合的檢測探針也就越來越多，剩余的游離檢測探針就會越來越少，和檢測區(qū)凝血酶抗原結合的檢測探針也就越少，膠體金顯色強度越低。反之，樣品中的凝血酶越少，剩余的游離檢測探針就會越來越多，和檢測區(qū)處凝血酶抗原結合也就越多，膠體金顯色強度越強，通過紙條檢測儀器ESEQuant-LR3檢測檢測區(qū)和質控區(qū)顯色信號強度的變化即判斷樣品中凝血酶的濃度。三、試紙條檢測方法1)取凝血酶標準品滴加到試紙的樣品吸收墊上，10分鐘后，將試紙條放入試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3中，進行檢測，分別測定檢測區(qū)和質控區(qū)的膠體金顯色信號強度；將檢測區(qū)的顯色信號強度(T)比上質控區(qū)的顯色信號強度(C)，得到T/C值，將得到的T/C值制作凝血酶標準品的濃度對應顯色信號比值的線性回歸曲線，計算回歸方程；2)將凝血酶標準品替換為待測樣品，用上述試紙檢測待測樣品，記錄在所述試紙的檢測區(qū)和質控區(qū)的顯色信號比值，根據(jù)步驟(1)的回歸方程，得到待測樣品中凝血酶的濃度。四、凝血酶試紙條在檢測凝血酶中的應用1、檢測凝血酶靈敏度與線性范圍研究配制圖5所示的不同濃度凝血酶(Sigma，Cat#T6884)水溶液，分別用實施例2制備的試紙條進行測定。用試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3分別測定檢測區(qū)和質控區(qū)處的顯色強度。結果如圖5所示，可以看出，隨著AFB1濃度增加，檢測區(qū)處顯色強度逐漸變小。利用檢測區(qū)顯色強度與質控區(qū)顯色強度比值(表3)，繪制檢測凝血酶的標準曲線如圖6所示，結果表明，試紙條的靈敏度1nM；線性范圍為1nM-100nM。表3凝血酶標準品的檢測結果2、凝血酶試紙條在血清凝血酶檢測中的應用1)、標準曲線繪制同本實施例第一部分中檢測凝血酶靈敏度與線性范圍研究中的標準曲線方法，得到的回歸方程為：y＝-1.177x+2.4398，R2＝0.972，為凝血酶標準曲線一元回歸方程。2)、樣品制備取小鼠血清，分別加入終濃度分別為2nM、10nM、50nM的人凝血酶。3)、樣品測定取上述制備好的待測樣品100μL滴加到所述試紙的樣品吸收墊上，觀察樣品層析沿著硝酸纖維素膜流動，直到被上面的吸水墊吸附；10分鐘后，觀察試紙條顯色信號，并將試紙條放入試紙條檢測儀器ESEQuant-LR3中，進行檢測，分別測定檢測區(qū)和質控區(qū)的顯色信號強度；將檢測區(qū)的顯色信號強度(T)比上質控區(qū)的顯色信號強度(C)，將得到的計算值代入上述步驟1的回歸方程，計算得到待測樣品中凝血酶的濃度。4)、檢測結果：3份添加人凝血酶的小鼠血清樣品測得結果如表4所示。從結果可以看出，本發(fā)明試紙條的回收率在105％～115％之間，標準差小于15％，具有很好的準確度和精密度，因此可以用于實際樣品中凝血酶的檢測。表4小鼠血清凝血酶添加回收實驗結果添加濃度實測濃度回收率標準差(％)2nM2.3115％12.210nM10.5105％9.8.50nM55110％8.7最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，但本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明各實施例技術方案的范圍。當前第1頁1 2 3