本發(fā)明涉及利用生物敏感標志物檢測水體酸化狀況，更具體地說，本發(fā)明涉及一種利用魚的GSH與GSSG的比值大小檢測水體酸化程度的方法。
背景技術：
：自工業(yè)革命以來，由于人類活動和工農(nóng)業(yè)發(fā)展，大氣中的二氧化碳(CO2)水平正以前所未有的速度上升，導致海洋和其他水體吸收CO2的量不斷增加，水體pH值下降，導致水體酸化。CO2酸化如海水酸化，不同于一般意義上的酸化如鹽酸(HCl)酸化，CO2酸化對魚類的影響顯著大于HCl酸化的影響。例如同是pH＝6.2，CO2酸化對真鯛(Pagrusmajor)的卵和幼體產(chǎn)生的毒性(死亡率60-100％)遠高于HCl酸化產(chǎn)生的毒性(死亡率1-4％)。由于CO2分子比H+更易穿透生物膜，與水反應生成H2CO3，后者在碳酸酐酶的作用下，迅速分解成H+和HCO3-；在相同H+濃度下(pH＝6.16)，CO2衍生出的分子種類(HCO3-、CO32-)是HCl的150倍。HCl酸化只是H+濃度升高；而CO2進入生物體內(nèi)后可以直接破壞體液的酸堿平衡，加之CO2酸化還會使機體新陳代謝率及蛋白合成下降，攜氧能力下降，抑制機體正常生理活動，乃至死亡。因此，由CO2酸化升高導致的pH降低對水生動物產(chǎn)生的影響比單一H+濃度增加而產(chǎn)生的影響更為嚴重。海水酸化是CO2酸化，是全球環(huán)境變化的重大問題之一。海水酸化可直接和間接影響魚及其他水生生物的代謝、抗氧化、免疫防御、離子和酸堿平衡等，致其傷亡。海水酸化不僅威脅某些物種，還可使整個海洋生態(tài)系統(tǒng)退化。海水酸化是亟待研究和積極應對的全球性重大環(huán)境問題。目前有關海水酸化(CO2酸化水體)的研究剛起步，海水酸化對水生生物影響的研究還少，對魚類影響的研究更少，海水酸化的生物效應相對難以預測，并且尚無適宜的魚類合成物監(jiān)測CO2酸化水體的程度，影響了海水酸化對水生生物影響的深入研究。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。本發(fā)明還有一個目的就是提供一種利用魚的GSH與GSSG的比值檢測水體污染程度的方法，本方法利用魚的GSH與GSSG的比值作為敏感生物標記物，能敏感的表達出水體中CO2酸化的程度和危害程度，為水體生態(tài)環(huán)境監(jiān)測、毒理診斷、調(diào)控和防治提供準確、快速的科學方法。為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其他優(yōu)點，提供了一種利用魚的GSH與GSSG的比值監(jiān)測CO2酸化水體的方法。本檢測方法為獲取需要檢測的水域中的魚，并采用所述魚的GSH與GSSG的比值作為敏感生物標記物。其中，GSH是還原型谷胱甘肽的簡寫，GSSG是氧化型谷胱甘肽的簡寫。優(yōu)選的是，所述魚的GSH與GSSG的比值大小與CO2酸化水體的pH值大小呈正相關。優(yōu)選的是，建立魚的GSH與GSSG的比值與CO2酸化水體的pH值大小關系的標準曲線，然后將待檢測水域中的同種同大小的魚的GSH與GSSG的比值大小與所述標準曲線比對，得到待檢測水域中CO2酸化水體的pH值大小。優(yōu)選的是，魚的GSH含量與GSSG含量分別用GSH試劑盒和GSSG試劑盒測定。優(yōu)選的是，所述魚的GSH與GSSG的比值測定包括如下步驟：步驟一、待測樣本處理：制備全魚勻漿，然后離心分層，取上層清液為待測樣本；步驟二、測定GSSG含量；步驟三、測定GSH含量；步驟四、將GSH含量除以GSSG含量得到GSH與GSSG的比值。優(yōu)選的是，所述步驟一中全魚勻漿為全魚與濃度0.65％的魚用生理鹽水按質量比為1:9配置，且離心分層用冷凍離心機，11028g，4℃，離心10min。優(yōu)選的是，用GSSG試劑盒測定GSSG含量的具體步驟為：1)、將稀釋n倍的待測樣本100ul加入測定管中，將濃度為50umol/L的GSSG標準品加入標準管中，然后在測定管和標準管中分別各加入試劑五2ul和試劑六5ul，然后漩渦混勻1分鐘，37℃反應30分鐘；2)、在測定管和標準管中各自只留50ul液體測定，然后在測定管和標準管中分別各加入試劑一400ul和試劑二50ul，然后混勻室溫靜置2分鐘；3)、在測定管和標準管中分別各加入試劑三200ul，加試劑三時開始計時，混勻后，于1cm光徑4mm內(nèi)徑的玻璃比色皿中，于紫外可見分光光度計412nm處，30秒時分別讀取測定管和標準管的吸光度值記為A3，室溫靜置5分鐘，然后到5分30秒時分別讀取測定管和標準管的吸光度值記為A4，然后代入如下公式計算得魚的過GSSG含量：優(yōu)選的是，用GSH試劑盒測定GSH含量的具體步驟為：1)、將稀釋m倍的待測樣本50ul加入測定管中，將濃度為50umol/L的GSH標準品加入標準管中，然后在測定管和標準管中分別各加入試劑一400ul和試劑二50ul，然后混勻室溫靜置2分鐘；2)、在測定管和標準管中分別各加入試劑三200ul，加試劑三時開始計時，混勻后，于1cm光徑4mm內(nèi)徑的玻璃比色皿中，于紫外可見分光光度計412nm處，30秒時分別讀取測定管和標準管的吸光度值記為A1，室溫靜置5分鐘，然后到5分30秒時分別讀取測定管和標準管的吸光度值記為A2，然后代入如下公式計算得魚的過GSH含量：GSH含量＝T-GSH含量-2×GSSG含量。優(yōu)選的是，n＝m＝10。優(yōu)選的是，所述魚為海水青鳉或淡水青鳉。本發(fā)明至少包括以下有益效果：谷胱甘肽是含有巰基的小分子肽類物質，具有重要的抗氧化作用和解毒作用，還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)是其兩種形式。在正常生理條件下魚類組織中GSH占絕大多數(shù)，GSSG含量非常低。GSH/GSSG的穩(wěn)態(tài)是維持某些特定基因的轉錄、細胞增殖、凋亡及炎癥反應等正常生理過程。GSH/GSSG的變化，是魚體對環(huán)境變化做出應激反應程度的重要指標。本方法有利于預測海水酸化的生物效應，其對保護海水酸化的首要沖擊者、水體生產(chǎn)力中的主要產(chǎn)物—魚類和其他生物，發(fā)展可持續(xù)的漁業(yè)和生態(tài)系統(tǒng)具有現(xiàn)實意義。并且本發(fā)明可以利用魚的GSH與GSSG的比值監(jiān)測水體CO2酸化的情況，通過魚的GSH與GSSG的比值與CO2酸化水體的pH值大小呈正相關，就可以快速準確監(jiān)測到水體受到CO2的酸化的程度和危害程度。具體實施方式下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書能夠據(jù)以實施。實施例1本方案利用魚的GSH與GSSG的比值監(jiān)測CO2酸化水體的方法，獲取需要檢測的水域中的魚，并采用所述魚的GSH與GSSG的比值作為敏感生物標記物，通過檢測魚的GSH與GSSG的比值大小，然后比對同類同大小的魚的GSH與GSSG的比值與CO2酸化水體的pH值大小關系的標準曲線，就可以獲悉出水體受CO2酸化的pH值大小，不但檢測準確，且敏感度高，而且能直觀反映CO2酸化水體對生物的危害程度。實施例2本方案利用魚的GSH與GSSG的比值監(jiān)測CO2酸化水體的方法，獲取需要檢測的水域中的魚，并采用所述魚的GSH與GSSG的比值作為敏感生物標記物，根據(jù)魚的GSH與GSSG的比值大小與水體受CO2酸化的pH值大小呈正相關，通過測定魚的GSH與GSSG的比值大小，然后比對同類同大小的魚的GSH與GSSG的比值與CO2酸化水體的pH值關系的標準曲線，如果檢測樣本魚的GSH與GSSG的比值比正常情況下的同類同大小的魚的GSH與GSSG的比值低，則判斷水域受到CO2酸化；GSH與GSSG的比值越低，則判斷水域CO2酸化越嚴重，甚至可判斷是否達到危害水體生物的程度。實施例3本方案利用魚的GSH與GSSG的比值監(jiān)測CO2酸化水體的方法，獲取需要檢測的水域中的魚，并采用所述魚的GSH與GSSG的比值作為敏感生物標記物。首先通過實驗建立魚的GSH與GSSG的比值與CO2酸化水體的pH值關系的標準曲線，然后將待檢測水域中的同種同大小的魚的GSH與GSSG的比值與所述標準曲線比對，得到待檢測水域中CO2酸化的pH大小。通過實驗建立魚的GSH與GSSG的比值與CO2酸化水體的pH值關系的標準曲線，如下：采用30天齡海水青鳉稚魚作為監(jiān)測水污染的生物樣本，將稚魚分成5組，每組3個平行，分別在表1所述的水環(huán)境中飼養(yǎng)，其中水域的pH8.1為對照組。飼養(yǎng)8周后，每個平行取3尾魚樣品測定，每組測定3*3＝9個數(shù)據(jù)，將每組9個數(shù)據(jù)數(shù)理統(tǒng)計后得到各組魚的GSH與GSSG的比值大小如表2所示，根據(jù)表2的數(shù)據(jù)繪制魚的GSH與GSSG的比值與CO2酸化水體的pH值關系的標準曲線。表15組稚魚飼養(yǎng)的水域中CO2酸化水體的pH值實驗序號對照組1234pH值8.17.97.77.57.3構建CO2充氣系統(tǒng)持續(xù)泡控目標pH值的酸化海水，以目前近海表層海水的平均值(pH8.1)為對照組。通過向海水中充入高純CO2氣體，用HENTEXpH/ORP控制器監(jiān)測并控制每個養(yǎng)殖槽中海水pH值，以保持各組實驗海水pH值的穩(wěn)定。飼養(yǎng)的其他條件是：每天三次投喂200目飼料，總投喂量為魚體重的5％。每天詳細觀察和記錄魚的活動、攝食、畸形、死亡等，8周后隨機采集魚樣品，分別稱魚體濕重，可以直接用于測定魚的GSH與GSSG的比值。表25組魚樣品的GSH與GSSG的比值測定待測水域中的海水青鳉的GSH與GSSG的比值大小的具體步驟如下：步驟一、待測樣本處理：制備全魚勻漿，然后離心分層，取上層清液為待測樣本；步驟二、用GSSG試劑盒測定GSSG含量：1)、將稀釋n倍的待測樣本100ul加入測定管中，將濃度為50umol/L的GSSG標準品加入標準管中，然后在測定管和標準管中分別各加入試劑五2ul和試劑六5ul，然后漩渦混勻1分鐘，37℃反應30分鐘；2)、在測定管和標準管中各自只留50ul液體測定，然后在測定管和標準管中分別各加入試劑一400ul和試劑二50ul，然后混勻室溫靜置2分鐘；3)、在測定管和標準管中分別各加入試劑三200ul，加試劑三時開始計時，混勻后，于1cm光徑4mm內(nèi)徑的玻璃比色皿中，于紫外可見分光光度計412nm處，30秒時分別讀取測定管和標準管的吸光度值記為A3，室溫靜置5分鐘，然后到5分30秒時分別讀取測定管和標準管的吸光度值記為A4，然后代入如下公式計算得魚的過GSSG含量：步驟三、用GSH試劑盒測定GSH含量：1)、將稀釋m倍的待測樣本50ul加入測定管中，將濃度為50umol/L的GSH標準品加入標準管中，然后在測定管和標準管中分別各加入試劑一400ul和試劑二50ul，然后混勻室溫靜置2分鐘；2)、在測定管和標準管中分別各加入試劑三200ul，加試劑三時開始計時，混勻后，于1cm光徑4mm內(nèi)徑的玻璃比色皿中，于紫外可見分光光度計412nm處，30秒時分別讀取測定管和標準管的吸光度值記為A1，室溫靜置5分鐘，然后到5分30秒時分別讀取測定管和標準管的吸光度值記為A2，然后代入如下公式計算得魚的過GSH含量：GSH含量＝T-GSH含量-2×GSSG含量。步驟四、將GSH含量除以GSSG含量得到GSH與GSSG的比值。然后將計算得海水青鳉的GSH與GSSG的比值大小與標準曲線比對，不但可以知道水體是否受到CO2酸化，而且從標準曲線中可以知道水體中CO2酸化的pH大小，更能知道水體對生物體危害程度。實施例4利用實驗可以建立任何魚種的魚的GSH與GSSG的比值與CO2酸化水體的pH值關系的標準曲線，然后取待測水域中的魚做樣本，只要做樣本的魚與建立標準曲線的魚是同類同大小的即可進行比對。測定待測水域中的魚的GSH與GSSG比值的具體步驟如下：步驟一、待測樣本處理：取與建立標準曲線用魚一樣和大小相當?shù)聂~制備全魚勻漿，全魚勻漿為全魚與0.65％濃度的魚用生理鹽水按質量比為1:9配置，然后用冷凍離心機，11028g，4℃，離心10min，取上層清液為待測樣本；步驟二、用GSSG試劑盒測定GSSG含量：1)、將稀釋10倍的待測樣本100ul加入測定管中，將濃度為50umol/L的GSSG標準品加入標準管中，然后在測定管和標準管中分別各加入試劑五2ul和試劑六5ul，然后漩渦混勻1分鐘，37℃反應30分鐘；2)、在測定管和標準管中各自只留50ul液體測定，然后在測定管和標準管中分別各加入試劑一400ul和試劑二50ul，然后混勻室溫靜置2分鐘；3)、在測定管和標準管中分別各加入試劑三200ul，加試劑三時開始計時，混勻后，于1cm光徑4mm內(nèi)徑的玻璃比色皿中，于紫外可見分光光度計412nm處，30秒時分別讀取測定管和標準管的吸光度值記為A3，室溫靜置5分鐘，然后到5分30秒時分別讀取測定管和標準管的吸光度值記為A4，然后代入如下公式計算得魚的過GSSG含量：步驟三、用GSH試劑盒測定GSH含量：1)、將稀釋10倍的待測樣本50ul加入測定管中，將濃度為50umol/L的GSH標準品加入標準管中，然后在測定管和標準管中分別各加入試劑一400ul和試劑二50ul，然后混勻室溫靜置2分鐘；2)、在測定管和標準管中分別各加入試劑三200ul，加試劑三時開始計時，混勻后，于1cm光徑4mm內(nèi)徑的玻璃比色皿中，于紫外可見分光光度計412nm處，30秒時分別讀取測定管和標準管的吸光度值記為A1，室溫靜置5分鐘，然后到5分30秒時分別讀取測定管和標準管的吸光度值記為A2，然后代入如下公式計算得魚的過GSH含量：GSH含量＝T-GSH含量-2×GSSG含量。步驟四、將GSH含量除以GSSG含量得到GSH與GSSG的比值。將計算得魚的GSH與GSSG的比值大小與標準曲線比對，不但可以知道水體是否受CO2酸化，而且從標準曲線中可以知道水體中CO2酸化的pH值大小，更能知道水體對生物體危害程度。實施例5利用實驗建立12周齡的淡水青鳉的GSH與GSSG的比值大小與CO2水體的pH大小關系的標準曲線，然后取待測水域中的魚做樣本，只要取得樣本的魚與建立標準曲線的魚是同類同大小的即可進行比對。取得待測水域中12周齡的淡水青鳉做樣本，然后測定待測水域中的該魚的GSH與GSSG的比值的具體步驟如下：步驟一、待測樣本處理：取與建立標準曲線用魚一樣和大小相當?shù)聂~制備全魚勻漿，全魚勻漿為全魚與0.65％濃度的魚用生理鹽水按質量比為1:9配置，然后用冷凍離心機，11028g，4℃，離心10min，取上層清液為待測樣本；步驟二、用GSSG試劑盒測定GSSG含量：1)、將稀釋10倍的待測樣本100ul加入測定管中，將濃度為50umol/L的GSSG標準品加入標準管中，再在測定管和標準管中分別各加入試劑五2ul和試劑六5ul，然后漩渦混勻1分鐘，37℃反應30分鐘；2)、在測定管和標準管中各自只留50ul液體測定，再在測定管和標準管中分別各加入試劑一400ul和試劑二50ul，然后混勻室溫靜置2分鐘；3)、在測定管和標準管中分別各加入試劑三200ul，加試劑三時開始計時，混勻后，于1cm光徑4mm內(nèi)徑的玻璃比色皿中，于紫外可見分光光度計412nm處，30秒時分別讀取測定管和標準管的吸光度值記為A3，室溫靜置5分鐘，然后到5分30秒時分別讀取測定管和標準管的吸光度值記為A4，然后代入如下公式計算得魚的過GSSG含量：步驟三、用GSH試劑盒測定GSH含量：1)、將稀釋10倍的待測樣本50ul加入測定管中，將濃度為50umol/L的GSH標準品加入標準管中，然后在測定管和標準管中分別各加入試劑一400ul和試劑二50ul，然后混勻室溫靜置2分鐘；2)、在測定管和標準管中分別各加入試劑三200ul，加試劑三時開始計時，混勻后，于1cm光徑4mm內(nèi)徑的玻璃比色皿中，于紫外可見分光光度計412nm處，30秒時分別讀取測定管和標準管的吸光度值記為A1，室溫靜置5分鐘，然后到5分30秒時分別讀取測定管和標準管的吸光度值記為A2，然后代入如下公式計算得魚的過GSH含量：GSH含量＝T-GSH含量-2×GSSG含量。步驟四、將GSH含量除以GSSG含量得到GSH與GSSG的比值為5.31。將計算得魚的GSH與GSSG的比值大小和標準曲線比對，得到待測水域的CO2酸化的pH為7.43，這樣既可以知道水體已受到CO2酸化，而且從標準曲線中可以知道水體中的CO2酸化的pH大小，更能知道水體對生物體危害程度。盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列應用范例，它完全適用于各種適合本發(fā)明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地另行修改他用，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的實施例。當前第1頁1 2 3