本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種病原菌樣本分析前預(yù)處理液及預(yù)處理方法。

背景技術(shù)：
人類健康和醫(yī)學(xué)的發(fā)展史是一部與各種感染性疾病斗爭的歷史。目前感染性疾病(含傳染病)占人類全部死因25％以上。細(xì)菌感染所致的感染性疾病占首位。2014年世界衛(wèi)生組織發(fā)布全球死因數(shù)據(jù)表明，在列為全球十大死因疾病中，下呼吸道感染、HIV/AIDS、腹瀉病以及結(jié)核病分列其中第4、6、7和10位，其中下呼吸道感染、腹瀉病和結(jié)核病大多屬于細(xì)菌性感染。病原菌的檢查則是臨床確診感染性疾病的主要手段。目前對于病原菌的檢測方法主要有4類：一是分離培養(yǎng)法，其是證實(shí)感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于有的病原菌如肺炎支原體等，其生長周期極為緩慢，培養(yǎng)周期長，培養(yǎng)條件苛刻，甚至有時由于患者用藥導(dǎo)致病原菌活力較差而導(dǎo)致培養(yǎng)失敗出現(xiàn)假陰性結(jié)果等原因?qū)е略摲ㄔ谂R床上的應(yīng)用受到了較大的限制。二是血清學(xué)方法，即采用酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫法、微量免疫熒光法和間接血凝試驗(yàn)等，檢測被檢者血清中病原菌相關(guān)抗體的水平，可間接提示病原菌感染的存在。然而，血清學(xué)試驗(yàn)只能提供一種回顧性的診斷，而且有時需要雙份血清。另外，抗體出現(xiàn)的時機(jī)不易掌握，兒童、青少年與成人之間又存在特異性抗體的差異，故現(xiàn)有血清學(xué)方法的檢測質(zhì)量也受到一定限制。三是利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測病原菌DNA的存在，其中最常用的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，該方法快速、靈敏、特異，是目前研究病原菌感染的重要手段，但由于PCR對實(shí)驗(yàn)設(shè)備以及操作要求較高，且易出現(xiàn)假陽性，在我國還不能作為常用的臨床診斷方法。四是直接檢測病原體相關(guān)特異性抗原，以直接證實(shí)病原體的感染。該法屬于直接法，其結(jié)果可信度高。目前，已公開報(bào)道的檢測病原體抗原的方法主要為基于抗體-抗原反應(yīng)的雙抗夾心ELISA法，間接免疫熒光法，膠體金免疫層析法等。在這些方法中，以膠體金免疫層析法最為突出。免疫膠體金層析是近年來繼放射免疫分析和酶聯(lián)免疫分析之后發(fā)展起來的一種微量檢測技術(shù)，該法利用兩種抗病原菌表面特異性抗原的抗體，分別做為標(biāo)記抗體及捕獲抗體，利用雙抗夾心的原理，結(jié)合層析技術(shù)，可對病原菌進(jìn)行快速檢測(5-10分鐘內(nèi))。該法的難點(diǎn)在于制備出能捕獲菌體表面抗原的特異性抗體。事實(shí)是，有時能成功找到菌體表面抗原(通常為蛋白質(zhì))的胞外結(jié)構(gòu)域，但是由于菌體表面結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，如空間位阻等原因，以其制備的抗體并不能高效的結(jié)合該抗原，從而降低了該法的檢測靈敏度。因此能用此法檢測的病原菌種類較少，大大限制了該法的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對背景技術(shù)中存在的這些技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種對病原菌樣本進(jìn)行分析前預(yù)處理液以及預(yù)處理方法，以提高基于“抗原-抗體”捕獲反應(yīng)來直接檢測病原體方法(如膠體金、ELISA等)的靈敏度。本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種病原菌樣本分析前預(yù)處理液，其特征在于：所述病原菌樣本分析前預(yù)處理液包括三羥甲基氨基甲烷、鈣鹽、磷脂酶、溶菌酶以及雙蒸水；所述病原菌樣本分析前預(yù)處理液以100毫升計(jì)算，所述三羥甲基氨基甲烷的含量是0.0121-0.121克；所述鈣鹽以鈣元素計(jì)的含量是0.05-0.5克；所述磷脂酶的含量是0.003-0.03克；所述溶菌酶的含量是0.025-0.1克；所述病原菌樣本分析前預(yù)處理液的pH為7.0-8.5。作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的鈣鹽是可溶性鈣鹽。作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的鈣鹽是氯化鈣、硫酸鈣或硝酸鈣。作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的磷脂酶是磷脂酶A1或磷脂酶A2。一種基于如上所述的病原菌樣本分析前預(yù)處理液的制備方法，其特征在于：所述病原菌樣本分析前預(yù)處理液以100毫升計(jì)算，其制備方法包括以下步驟：1)稱取三羥甲基氨基甲烷、鈣鹽、磷脂酶以及溶菌酶；2)將步驟1)稱取得到的原料一起溶于90ml雙蒸水中；3)以鹽酸調(diào)pH至7.0-8.5后再以雙蒸水定容至100ml?；谌缟纤龅牟≡鷺颖痉治銮邦A(yù)處理液對病原菌樣本分析前進(jìn)行預(yù)處理的方法，其特征在于：所述預(yù)處理方法包括以下步驟：1)采集預(yù)處理樣本；2)將預(yù)處理樣本與前述的預(yù)處理液進(jìn)行等體積混合；3)將步驟2)得到的混合液置于50℃中反應(yīng)20min，完成預(yù)處理。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明的原理是利用含溶菌酶及磷脂酶的預(yù)處理液對病原菌樣本進(jìn)行酶促溶菌預(yù)處理，充分暴露病原菌表面抗原，消除抗體結(jié)合的空間位阻，提高抗體識別并結(jié)合抗原的效率，從而大大提高基于“抗原-抗體”反應(yīng)來檢測病原體的方法的靈敏度。將有利于提高基于抗原-抗體反應(yīng)的快速檢測試劑盒(如膠體金免疫層析試劑盒)的檢測靈敏度，從而實(shí)現(xiàn)對人類病原菌的快速檢測；應(yīng)用范圍廣，其對革蘭氏陽性及陰性菌的處理均有效；臨床樣本經(jīng)本方法處理后，檢測靈敏度大大提高，從而在提高病原菌的檢出率的同時降低了臨床取樣的質(zhì)量要求；預(yù)處理液中的溶菌酶、磷脂酶能殺滅病原菌，有利于保護(hù)工作環(huán)境及檢測人員健康。具體實(shí)施方式以下對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明使用或采用的各種材料的來源1.三羥甲基氨基甲烷、氯化鈣、硝酸鈣、硫酸鈣、鹽酸均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2.磷脂酶A1購自Novozymes，產(chǎn)品名稱為LecitaseUltraA1，比活力為10000U/ml；3.磷脂酶A2購自sigmaaldrich，產(chǎn)品編號為P6534，活性大于600units/mg蛋白；4.溶菌酶購自sigmaaldrich；產(chǎn)品編號為62970，活性為～100000U/mg；5.人流感嗜血桿菌菌株：購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，編號為ATCC53781。6.人肺炎鏈球菌亞型菌株Sp23F：購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，編號為ATCC700669。7.人肺炎支原體：購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，編號為ATCC15531。一種病原菌樣本分析前預(yù)處理液，該病原菌樣本分析前預(yù)處理液包括三羥甲基氨基甲烷、鈣鹽、磷脂酶、溶菌酶以及雙蒸水；病原菌樣本分析前預(yù)處理液以100毫升計(jì)算，三羥甲基氨基甲烷的含量是0.0121-0.121克；鈣鹽以鈣元素計(jì)的含量是0.05-0.5克；磷脂酶的含量是0.003-0.03克；溶菌酶的含量是0.025-0.1克；病原菌樣本分析前預(yù)處理液的pH為7.0-8.5。其中，鈣鹽是可溶性鈣鹽，例如氯化鈣、硫酸鈣或硝酸鈣；磷脂酶是磷脂酶A1或磷脂酶A2。一種基于如上所述的病原菌樣本分析前預(yù)處理液的制備方法，病原菌樣本分析前預(yù)處理液以100毫升計(jì)算，其制備方法包括以下步驟：1)稱量三羥甲基氨基甲烷、鈣鹽、磷脂酶以及溶菌酶；2)將步驟1)稱取得到的試劑溶于90ml雙蒸水中；3)以鹽酸調(diào)pH至7.0-8.5后再以雙蒸水定容至100ml?；谌缟嫌涊d的病原菌樣本分析前預(yù)處理液對病原菌樣本分析前進(jìn)行預(yù)處理的方法，該預(yù)處理方法包括以下步驟：1)采集預(yù)處理樣本；預(yù)處理樣本例如可以是拭子，痰液等含有病原菌樣本；2)將預(yù)處理樣本與預(yù)處理液進(jìn)行等體積混合；3)將步驟2)得到的混合液置于50℃中反應(yīng)20min，完成預(yù)處理。實(shí)施例1本發(fā)明所述預(yù)處理液的配制方法為：稱取三羥甲基氨基甲烷0.0121克、鈣元素含量為0.05克的氯化鈣、磷脂酶A10.003克、溶菌酶0.025克，溶解于90ml雙蒸水中，并以鹽酸調(diào)pH為7.0后再以雙蒸水定容為100ml，最終pH仍為7.0。實(shí)施例2本發(fā)明所述預(yù)處理液的配制方法為：稱取三羥甲基氨基甲烷0.121克、鈣元素含量為中0.25克的硝酸鈣、磷脂酶A20.03克、溶菌酶0.1克，溶解于90ml雙蒸水中，并以鹽酸調(diào)pH為7.5后再以雙蒸水定容為100ml，最終pH為7.4。實(shí)施例3本發(fā)明所述預(yù)處理液的配制方法為：稱取三羥甲基氨基甲烷0.070克、鈣元素含量為0.45克的硫酸鈣、磷脂酶A20.015克、溶菌酶0.070克，溶解于90ml雙蒸水中，并以鹽酸調(diào)pH為8.5后再以雙蒸水定容為100ml，最終pH為8.4。實(shí)施例4以申請?zhí)枮?01410406527.4發(fā)明名稱為“人流感嗜血桿菌量子點(diǎn)免疫層析檢測卡及其制備方法和應(yīng)用”的說明書中第【0117】段至【0158】段所公開的內(nèi)容制備人流感嗜血桿菌量子點(diǎn)免疫層析檢測卡。取培養(yǎng)的人流感嗜血桿菌(革蘭氏陰性菌)，將其用生理鹽水稀釋為0.5×104CFU/ml、1×104CFU/ml、2×104CFU/ml、4×104CFU/ml、6×104CFU/ml、8×104CFU/ml等不同的濃度。于各個稀釋度樣本中分別取出0.25ml的菌液與等量的由實(shí)施例1所制備的預(yù)處理液混合，于50℃反應(yīng)20min后將反應(yīng)液滴于檢測卡的樣品墊上按申請?zhí)枮?01410406527.4的說明書中第【0159】段至【0161】段所公開的方法進(jìn)行檢測；同時于各個稀釋度樣本中取出0.25ml菌液與等體積的生理鹽水混合作為對照試驗(yàn)，同時于50℃反應(yīng)20min，后進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)預(yù)處理液預(yù)處理后，該檢測卡對于人流感嗜血桿菌的檢測下限為2×104CFU/ml，而對于只經(jīng)生理鹽水處理的對照樣品，其檢測下限則為4×104CFU/ml，由此可見，配合使用實(shí)施例1所述的預(yù)處理液可使該免疫層析檢測卡的靈敏度提高1倍左右。實(shí)施例5以申請?zhí)枮?01410405212.8發(fā)明名稱為“人肺炎鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測卡及其制備方法和應(yīng)用”的說明書中第【0128】段至【0170】段所公開的內(nèi)容制備人肺炎鏈球菌量子點(diǎn)免疫層析檢測卡。取培養(yǎng)的人肺炎鏈球菌(革蘭氏陽性菌)，將其用生理鹽水稀釋為0.5×104CFU/ml、1×104CFU/ml、2×104CFU/ml、4×104CFU/ml、6×104CFU/ml、8×104CFU/ml等不同的濃度。于各個稀釋度樣本中分別取出0.25ml的菌液與等量的由實(shí)施例2所制備的預(yù)處理液混合，于50℃反應(yīng)20min后將反應(yīng)液滴于檢測卡的樣品墊上按申請?zhí)枮?01410405212.8的說明書中第【0171】段至【0173】段所公開的方法進(jìn)行檢測；同時于各個稀釋度樣本中取出0.25ml菌液與等體積的生理鹽水混合作為對照試驗(yàn)，同時于50℃反應(yīng)20min，后進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)預(yù)處理液預(yù)處理后，該檢測卡對于人肺炎鏈球菌的檢測下限為2×104CFU/ml，而對于只經(jīng)生理鹽水處理的對照樣品，其檢測下限則為6×104CFU/ml，由此可見，配合使用實(shí)施例2所述的預(yù)處理液可使該免疫層析檢測卡的靈敏度提高2倍左右。實(shí)施例6以公開號為CN104198703A發(fā)明名稱為“人肺炎支原體金標(biāo)銀染免疫層析檢測試劑盒及其制備方法和應(yīng)用”的說明書中第【0134】段至【0194】段所公開的內(nèi)容制備人肺炎支原體金標(biāo)銀染免疫層析檢測試劑盒。取培養(yǎng)的人肺炎支原體，將其用生理鹽水稀釋為0.5×104CFU/ml、1×104CFU/ml、2×104CFU/ml、4×104CFU/ml、6×104CFU/ml、8×104CFU/ml、16×104CFU/ml、24×104CFU/ml等不同的濃度。于各個稀釋度樣本中分別取出0.25ml的菌液與等量的由實(shí)施例3所制備的預(yù)處理液混合，于50℃反應(yīng)20min后將反應(yīng)液滴于檢測卡的樣品墊上按公開號為CN104198703A的說明書中第【0195】段至【0197】段所公開的方法進(jìn)行檢測；同時于各個稀釋度樣本中取出0.25ml菌液與等量的生理鹽水混合作為對照試驗(yàn)，同時于50℃反應(yīng)20min，后進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)預(yù)處理液預(yù)處理后，該檢測卡對于人肺炎支原體的檢測下限為8×104CFU/ml，而對于只經(jīng)生理鹽水處理的對照樣品，其檢測下限則為24×104CFU/ml，由此可見，配合使用實(shí)施例3所述的預(yù)處理液可使該免疫層析檢測卡的靈敏度提高2倍左右。